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Modificaciones de nucleótidos libres

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Sabemos que el ARN puede modificarse post-transcripcionalmente (modificación del ARN). Entonces, cuando el ARN se degrada, ¿es posible que tales modificaciones todavía estén presentes en los nucleótidos individuales, de modo que cuando los nucleótidos se reciclan para construir otro ARN, esas modificaciones persisten?


Nucleótido

Un nucleótido es una molécula orgánica que es el componente básico del ADN y el ARN. También tienen funciones relacionadas con la señalización celular, el metabolismo y las reacciones enzimáticas. Un nucleótido se compone de tres partes: un grupo fosfato, un azúcar de 5 carbonos y una base nitrogenada. Las cuatro bases nitrogenadas del ADN son adenina, citosina, guanina y timina. El ARN contiene uracilo, en lugar de timina. Un nucleótido dentro de una cadena constituye el material genético de todos los seres vivos conocidos. También cumplen una serie de funciones fuera del almacenamiento de información genética, como mensajeros y moléculas que mueven energía.

Una serie de tres nucleótidos dentro del ADN se conoce como codóny dirige a las proteínas dentro de la célula a unir una proteína específica a una serie especificada por el resto del ADN. Los codones especiales incluso especifican a la maquinaria dónde detener e iniciar el proceso. Traducción de ADN, como se le conoce, convierte la información del ADN al lenguaje de las proteínas. Esta cadena de aminoácidos se puede plegar correctamente y proporcionar una de las muchas funciones dentro de la célula.


Regulación del procesamiento de ARN

Cuando un gen eucariota se transcribe en el núcleo, la transcripción primaria (molécula de ARN recién hecha) todavía no se considera un ARN mensajero. En cambio, es una molécula & # 8220inmadura & # 8221 llamada pre-ARNm.

El pre-mRNA tiene que pasar por algunas modificaciones para convertirse en una molécula de mRNA madura que pueda salir del núcleo y ser traducida. Estos incluyen el empalme, el taponado y la adición de una cola poli-A, todo lo cual puede potencialmente ser regulado: acelerado, ralentizado o alterado para dar como resultado un producto diferente.

Splicing alternativo

La mayoría de las moléculas de pre-ARNm tienen secciones que se eliminan de la molécula, llamadas intrones, y secciones que están unidas o juntas para hacer el ARNm final, llamado exones. Este proceso se llama empalme.

En el proceso de splicing alternativo, se pueden seleccionar diferentes porciones de un ARNm para su uso como exones. Esto permite que se produzcan dos (o más) moléculas de ARNm a partir de un pre-ARNm.

Figura 1. Imagen modificada de & # 8220Eukaryotic Post-transcriptional Gene Regulation, & # 8221 por OpenStax College, Biology (CC BY 3.0).

El empalme alternativo no es un proceso aleatorio. En cambio, normalmente está controlado por proteínas reguladoras. Las proteínas se unen a sitios específicos en el pre-ARNm y & # 8220 & # 8221 los factores de corte y empalme qué exones deben usarse. Los diferentes tipos de células pueden expresar diferentes proteínas reguladoras, por lo que se pueden usar diferentes combinaciones de exones en cada tipo de célula, lo que lleva a la producción de diferentes proteínas.


1.4: Enzimas modificadoras del ADN

  • Contribuido por Michael Blaber
  • Profesor (Ciencias Biomédicas) en Florida State University

Metilasas

Así como el estudio del sistema de modificación de restricción bacteriana ha proporcionado una variedad de endonucleasas específicas, también hay una variedad de metilasas de ADN específicas.

  • Las secuencias de reconocimiento de las metilasas son las mismas que las de las endonucleasas asociadas (por ejemplo, la metilasa EcoR1 reconoce y metila en la secuencia GAATTC).
  • Todas las metilasas transfieren el grupo metilo de la S-adenosilmetionina (SAM) a una base específica en la secuencia de reconocimiento, y SAM es un componente necesario en la reacción de metilación.
  • La metilación del ADN generalmente tiene el efecto de proteger el ADN de la endonucleasa de restricción relacionada. Sin embargo, existen metilasas con una especificidad mínima. Por ejemplo, Sss I metilasa metilará residuos de citosina en la secuencia 5 '& hellip CG & hellip 3'. En este caso, el ADN metilado estará protegido de una amplia variedad de endonucleasas de restricción.
  • Algunas endonucleasas de restricción solo cortarán el ADN en sus sitios de reconocimiento si el ADN es metilado (por ejemplo, Dpn I).
  • Aún otras endonucleasas de restricción cortarán ambos ADN metilado y no metilado en sus secuencias de reconocimiento (por ejemplo, BamH I).

Represa y dcm Metilación

  • La metilasa codificada por el represa gen (dam metilasa) transfiere un grupo metilo de SAM al N6 posición de la base de adenina en la secuencia 5 '& hellip GATC & hellip 3'.
  • La metilasa codificada por el dcm gen (metilasa dcm) metila la base interna de citosina, en el C5 posición, en las secuencias 5 '& hellip CCAGG & hellip 3' y 5 '& hellip CCTGG & hellip 3'.
  • Casi todas las cepas de E. coli de uso común en la clonación tienen un represa+dcm+ genotipo. El punto aquí es no que particularmente queremos que nuestro ADN esté metilado, pero que para hacer una presa-dcm- alguien tiene que mutar la bacteria y aislar el mutante correcto. Eso aparentemente no se ha hecho con muchas cepas bacterianas. Probablemente porque el represa y dcm La metilación afecta solo a un pequeño subconjunto de endonucleasas de restricción potenciales.

ADN aislado de presa + dcm + son en realidad no se cortará por un modesto subconjunto de endonucleasas de restricción disponibles:

Secuencia de reconocimiento Enzima restrictiva GATC G me ATC
TGATCA Bcl I + -
GATC Mbo yo + -
ATCGAT Cla I + -
TCTAGA Xba yo + -
TCGA Taq I + -
GAAGA Mbo II + -
GGTGA Hph I + -

Puede ser necesario preparar ADN a partir de cepas de E. coli que son dam-dcm- para poder ser cortado por estas enzimas.

ADN polimerasas

Se ha caracterizado una amplia variedad de polimerasas y están disponibles comercialmente. Todas las ADN polimerasas comparten dos características generales:

  1. Añaden nucleótidos a la Extremo 3'-OH de una cartilla
  2. El orden de los nucleótidos en el polinucleótido naciente es plantilla dirigida

Figura 1.4.1:Replicación de ADN

Además de la actividad polimerasa 5 '- & gt3', las polimerasas pueden contener actividad exonucleasa. Esta actividad exonucleasa puede proceder en la dirección 5 '- & gt3' o en la dirección 3 '- & gt5'.

  • La actividad exonucleasa en la dirección 3 '- & gt5' permite que la polimerasa corrija un error si incorpora un nucleótido incorrecto (llamado & quotactividad de corrección de errores& quot). También puede degradar lentamente el extremo 3 'de la imprimación..
  • La actividad exonucleasa en la dirección 5 '- & gt3' le permitirá degradar cualquier otro cebador hibridado que pueda encontrar. Sin actividad de exonucleasa 5 '- & gt3', los cebadores de obstrucción pueden desplazarse físicamente o no, dependiendo de la polimerasa que se utilice.

Las diferentes polimerasas tienen diferentes tasas de error de incorporación incorrecta y diferentes tasas de polimerización.

ADN polimerasa I de E. coli ADN polimerasa I de E. coli - Fragmento de Klenow ADN polimerasa T4 ADN polimerasa T7 Taq ADN polimerasa Transcriptasa inversa M-MuLV
Actividad exonucleasa 5 '- & gt3' * *
Actividad exonucleasa 3 '- & gt5' * * * *
Tasa de error (x10 -6) 9 40 & lt1 15 285
Desplazamiento de hebra *
Inactivación por calor * * * *

Usos de polimerasas

Las diversas actividades de las diferentes polimerasas las prestan a una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, las endonucleasas de restricción pueden producir fragmentos de ADN con 3 'o 5' nucleótidos y voladizos de quoto.

  • En el caso de voladizos de 5 ', la actividad de polimerasa 5' - & gt3 'puede completarlos para hacer extremos romos.
  • En el caso de salientes 3 ', la actividad exonucleasa 3' - & gt5 'presente en algunas polimerasas (especialmente ADN polimerasa T4) puede "masticar" estos extremos para producir también fragmentos de ADN de extremos romos.

Figura 1.4.2:Actividad de la polimerasa

& quotNick-translation & quot

Este método se utiliza para obtener fragmentos de ADN monocatenarios altamente radiomarcados, que utilizan la actividad exonucleasa 5 '- & gt3' presente en algunas polimerasas (E. coli ADN polimerasa I, por ejemplo).

  • En este método, se hace un corte en un dúplex de ADN de interés (es decir, se corta una de las hebras, véase ADNasa I).
  • Luego se agrega ADN pol I junto con nucleótidos radiomarcados. La actividad de la exonucleasa 5 '- & gt3' mastica el extremo 5 'en el sitio "pinchazo" y la actividad polimerasa incorpora los nucleótidos radiomarcados. El polinucleótido resultante estará altamente radiomarcado y se hibridará con la secuencia de ADN de interés.

Figura 1.4.3:Nick-traducción

  • Las polimerasas termoestables tienen la capacidad de permanecer funcionales a intervalos de temperatura en los que el dúplex de ADN realmente se "fundirá" y se separará. Esto ha permitido el desarrollo de la & quot Reacción en cadena de la polimerasa & quot técnica (PCR), que ha tenido un profundo impacto en la biotecnología moderna. Discutiremos este método en una fecha posterior.
  • La incorporación de bases didesoxi (es decir, sin grupos hidroxilo en el carbono 2 'o 3' del azúcar ribosa) conduce a terminación de la reacción de la polimerasa. Esto se discutirá con mayor detalle más adelante. Sin embargo, esta terminación de la cadena mediante la incorporación de didesoxinucleótidos es la base del método de secuenciación del ADN de Sanger, así como de las terapias para intentar inhibir la replicación viral.

Nucleasas

Nucleasa BAL-31

  • Esto es un exonucleasa (comienza en los extremos y trabaja hacia adentro) que degradará los extremos 3 'y 5' del ADN bicatenario. No hará escisiones internas ("mellas"), sin embargo, degradará los extremos del ADN en las "mellas" internas existentes (que crean los extremos 3 'y 5').
  • La degradación de los terminales no está coordinada, lo que significa que el producto es no 100% de extremos romos (aunque el dúplex original puede haber tenido extremos romos).
  • Dichos extremos arrancados se pueden hacer romos rellenando y masticando con una polimerasa adecuada (por ejemplo, ADN polimerasa de T4). La definición de unidad de 1 unidad es la cantidad de enzima necesaria para eliminar 200 pares de bases de cada extremo del ADN dúplex en 10 minutos a 30 ° C.

Figura 1.4.4:Actividad de nucleasa BAL-31

Exonucleasa III

  • Cataliza la eliminación gradual de nucleótidos de los extremos hidroxilo 3 'del ADN dúplex.
  • La enzima atacará el hidroxilo 3 'en el ADN dúplex con extremos romos, con voladizos 5' o con muescas internas.
  • Dado que se requiere ADN dúplex, la enzima no digerir el extremo 3 'del ADN dúplex donde los extremos son salientes 3'.

Figura 1.4.5:Actividad de exonucleasa III

Nucleasa de frijol mungo (aislado de brotes de frijol mungo)

  • A específico de una sola hebra Endonucleasa de ADN y ARN que degradará las extensiones de hebra única de los extremos del ADN y ARN dejando extremos romos.
  • Las extensiones de una sola hebra pueden ser extensiones de 5 'o 3'; ambas se eliminan y se deja un dúplex romo.

Figura 1.4.6:Actividad de la nucleasa de frijol mungo

Desoxirribonucleasa I (ADNasa I) de páncreas bovino

  • Esta enzima hidroliza hebras de ADN dúplex o simples preferentemente en los enlaces fosfodiéster 5 'a pirimidina nucleótidos
  • En presencia del ion Mg 2+, la ADNasa I ataca cada hebra de forma independiente y produce mellas de forma aleatoria (útil para la traducción de mellas)
  • En presencia de ADNsa de iones Mn2 +, escinde ambas cadenas de ADN aproximadamente en la misma posición (pero dejando los extremos `` arrastrados '')

Ligasas

  • Las ligasas catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5 'fosfato y 3' hidroxilo yuxtapuestos de los nucleótidos (potencialmente ARN o ADN dependiendo de la ligasa).
  • En cierto sentido, son lo opuesto a las endonucleasas de restricción, pero no parecen estar influenciadas por la secuencia local, per se.
  • Ligasas requieren ya sea rATP o NAD + como cofactor, y esto contrasta con las endonucleasas de restricción.

Los siguientes son diferentes tipos de ligasas y sus características.

ADN ligasa T4

  • Aislado del bacteriófago T4.
  • Ligará los extremos del ADN o ARN dúplex.
  • Esta enzima unirá los extremos romos así como los extremos con extremos colgantes cohesivos (complementarios) (salientes complementarios 3 'o 5').
  • Esta enzima también reparará las mellas de una sola hebra en los dúplex de ADN, ARN o ADN / ARN dúplex. Requiere ATP como cofactor.

Ligasa de ADN Taq

  • Esta ligasa catalizará un enlace fosfodiéster entre dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan con una hebra de ADN complementaria:

Figura 1.4.7:Actividad de la ADN ligasa Taq

  • La ligación es eficaz solo si los oligonucleótidos se hibridan perfectamente con la hebra molde.
  • La enzima es activa a temperaturas relativamente altas (45 - 65 ° C). Requiere NAD + como cofactor.

T4 RNA ligasa

  • Catalizará la formación de un enlace fosfodiéster entre oligonucleótidos ARN / ARN, oligonucleótidos ARN / ADN u oligonucleótidos ADN / ADN.
  • Requiere ATP como cofactor.
  • Esta enzima no requiere una hebra molde.

La ligasa de ARN de T4 se puede usar para una variedad de propósitos que incluyen la construcción de moléculas híbridas de ARN / ADN.

Figura 1.4.8:Actividad de ligasa de ARN de T4

ADN ligasa (E. coli)

  • Catalizará un enlace fosfodiéster entre el ADN dúplex que contiene extremos cohesivos.
  • Va a no ligar eficientemente fragmentos de extremos romos.
  • Requiere NAD + como cofactor.

Figura 1.4.9:Actividad de la ADN ligasa (E. Coli)

Polinucleótido quinasa T4

  • Cataliza la transferencia e intercambio de un grupo fosfato del gramo posición de rATP (nucleótido de adenina ribosa trifosfato) al extremo 5 'hidroxilo terminal del ADN o ARN bicatenario y monocatenario, y monofosfatos de nucleósido 3 '.
  • La enzima también eliminará los grupos fosforilo 3 '.
  • Los oligonucleótidos que se obtienen de sintetizadores automáticos carecen de un grupo fosfato 5 'y, por lo tanto, no pueden ligarse a otros polinucleótidos..

La polinucleótido quinasa T4 se puede usar para fosforilar el extremo 5 'de tales polinucleótidos:

Figura 1.4.10:Actividad de la polinucleótido quinasa T4


Beneficios

  • Alta pureza (& gt99%) según HPLC (Figura 1)
  • Libre de DNasa, RNasa e inhibidores de qPCR, PCR y RT
  • Estable durante 3 años a -20 o C
  • Disponible en formulaciones personalizadas y para suministro comercial.


Las pruebas de calidad ayudan a garantizar un rendimiento excepcional de los dNTP o NTP en sus experimentos de biología molecular. Las evaluaciones se realizan utilizando varios métodos analíticos. (Tabla 1 Figura 1).

Cuadro 1. Parámetros cualitativos y especificaciones

ParámetroPruebasEspecificación
FísicoConcentración100 + 3 mM
AparienciaSolución transparente e incolora
valor de pH7.3-7.5
Estabilidad a -20 o C36 meses
HPLCdNTP& gt 99% de pureza
NTP& gt 99% de pureza
Pirofosfato& lt 0,003 pmol PPi / pmol dNTP
FuncionalDNasa, RNasa y actividad de mella Indetectable
ADN bacteriano (qPCR, E. coli ARNr 23S)Indetectable
Contaminación por ADN humano (qPCR, ADNg humano)Indetectable

Figura 1. Perfiles de HPLC relativos de dNTP puros ≥99%. El análisis por HPLC muestra una pureza de trifosfato superior al 99% con formas indetectables de mono, di y tetrafosfato.


Productos y pedidos de amplificadores

[1] Tabernero et al. (2011) ARNm como terapia génica: Cómo controlar la expresión de proteínas. Diario de enfermedad controlada 150:238.
[2] Karikó et al. (2011) Generación del ARNm óptimo para la terapia: la purificación por HPLC elimina la activación inmunitaria y mejora la traducción del ARNm que codifica proteínas modificado con nucleósidos. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[3] Pascolo et al. (2006) Vacunación con ARN mensajero. En: Métodos en Medicina Molecular 127 (Saltzmann). Prensa Humana.
[4] Kormann et al. (2011) Expresión de proteínas terapéuticas después de la administración de ARNm modificado químicamente en ratones. Biotecnología de la naturaleza 29 (2):154.
[5] Karikó et al. (2008) La incorporación de pseudouridina en el ARNm produce un vector no inmunogénico superior con mayor capacidad de traducción y estabilidad biológica. Mol. El r. 16 (11):1833.
[6] Karikó et al. (2005) Supresión del reconocimiento de ARN por receptores tipo Toll: el impacto de la modificación de nucleósidos y el origen evolutivo del ARN. Inmunidad 23:165.
[7] Anderson et al. (2011) Las modificaciones de nucleósidos en el ARN limitan la activación de la 2'-5'-oligoadenilato sintetasa y aumentan la resistencia a la escisión por la ARNasa L. Nuclei Acids Res. 39 (21):9329.
[8] Warren et al. (2011) Reprogramación altamente eficiente para la pluripotencia y diferenciación dirigida de células humanas con ARNm modificado sintético. Célula madre celular 7:618.
[9] Andies et al. (2015) El ARNm incorporado con N (1) -metilpseudouridina supera al ARNm incorporado con pseudouridina al proporcionar una expresión de proteínas mejorada y una inmunogenicidad reducida en líneas celulares de mamíferos y ratones. J. Control. Liberación 217:337.
[10] Li et al. (2016) Efectos del ARN mensajero modificado químicamente en la expresión de proteínas Bioconjugate Chem. 27 (3):849.


5. MAPEO DEL EPITRANSCRIPTOMO DE CAP

5.1. m 7 G y Nmetro en el extendido mRNA Cap

Aunque gran parte del interés reciente en la epitranscriptómica se ha centrado en los nucleótidos modificados ubicados en sitios internos (es decir, entre la capa de ARNm y la cola de poli (A)), el nivel de modificación del ARN es considerablemente más alto en la capa de ARNm en comparación con los sitios internos. Además de m 6 A, hay otras cuatro abundantes modificaciones de metilo en el ARNm. Estos son el metilo N-7 en la tapa m 7 G, los dos 2 & # x02032-O-Modificaciones de metilo que se encuentran en el primer y segundo nucleótidos de plantilla, y el norte 6 -metilo que se encuentra junto con un 2 & # x02032-O-metilo en m 6 Ametro que se puede encontrar en el primer nucleótido de plantilla. Juntas, estas marcas de metilo comprenden las cinco modificaciones principales de metilo en el ARNm.

Hasta el momento, no se ha informado ningún análisis de todo el transcriptoma para la modificación de metilo en el límite de m 7 G o el 2 & # x02032-O-Modificaciones de metilo en el primer y segundo nucleótidos de plantilla. Sin embargo, existe evidencia de que estas modificaciones podrían estar reguladas. En el caso de m 7 G, la enzima que metila la guanosina a norteLa 7-metilguanosina, RNMT, está regulada en el cáncer y la sobreexpresión de RNMT promueve el desarrollo del cáncer (Cowling 2010a, 2010b). Esto sugiere que, en condiciones normales, algunos ARNm no se metilan de manera eficaz para formar la capa m 7 G, y la expresión de RNMT permite que estos ARNm maduren para adquirir una capa m 7 G completamente funcional. Debido a que la tapa de m 7 G es necesaria para la exportación nuclear de ARNm (Inesta-Vaquera y Cowling 2017), los ARNm sin metilar con tapa de guanosina pueden retenerse en el núcleo o degradarse.

El 2 & # x02032- asociado a la tapaOTambién se pueden regular las modificaciones de metilo. Cabe señalar que algunos ARNm pueden carecer de 2 & # x02032-O-Modificaciones de metilo en conjunto. Estos ARNm se denominan cap 0. Es posible que otros ARNm solo tengan el 2 & # x02032-O-Modificación de metilo en el primer nucleótido codificado, pero no en el segundo (denominado & # x0201ccap 1 & # x0201d). Este 2 & # x02032-O-La modificación con metilo es instalada por CMTR1, que requiere un ARN protegido con m 7 G como sustrato (B & # x000e9langer et al.2010 Inesta-Vaquera y Cowling 2017). CMTR1 está físicamente asociado con RNA Pol II (Haline-Vaz et al. 2008), lo que sugiere que esta modificación puede introducirse cotranscripcionalmente en el mRNA.

Los ARNm también pueden tener tanto el primer como el segundo nucleótido transcrito metilado en el 2 & # x02032-hidroxilo, que se denomina cap 2 (Furuichi et al. 1975). No es probable que los ARNm tengan solo el segundo nucleótido de plantilla 2 & # x02032-O-metilado porque CMTR2, la enzima que introduce el 2 & # x02032-O-metilo en el segundo nucleótido muestra un aumento de la actividad metiltransferasa hacia el ARNm protegido con un 2 & # x02032-O-metilo en el primer nucleótido (Werner et al. 2011).

Una función principal de 2 & # x02032-O-metilación es que esta modificación puede contribuir a una vía de defensa antiviral. La infección viral se asocia con la inducción de CMTR1, que convierte los ARN cap 0 en ARN cap 1 y potencialmente cap 2 (Daffis et al. 2010 Z & # x000fcst et al. 2011). La presencia de 2 & # x02032-OLas modificaciones de metilo impiden que estos ARNm se unan a las proteínas IFIT, que son inducidas por el interferón en respuesta a una infección viral (Fensterl y Sen 2015). Los IFIT se unen a sus ARNm diana en la estructura de la tapa extendida y suprimen la traducción al competir por la unión de las proteínas de unión a la tapa (Habjan et al. 2013 Kimura et al. 2013). Por lo tanto, 2 & # x02032-O-metilación protege los ARNm del huésped de la respuesta antiviral, que está destinada a dirigirse hacia los ARN virales.

Sin embargo, 2 & # x02032-O-La metilación se detecta en las células incluso en ausencia de infección viral, y los niveles de cap 1 y cap 2 parecen diferir entre las células (Furuichi et al. 1975). Por lo tanto, 2 & # x02032-O-La metilación en la tapa puede tener funciones incluso en ausencia de infección viral. Hasta el momento, la distribución de 2 & # x02032-OLas modificaciones de metilo asociadas con las tapas de ARNm no se han mapeado en el transcriptoma.

5.2. m 6 am

La única metilación asociada al casquete que se ha perfilado a nivel de todo el transcriptoma es m 6 Am. m 6 Am se mapea simultáneamente con m 6 A en el protocolo m 6 A miCLIP (descrito anteriormente), que utiliza un anticuerpo m 6 A. Los anticuerpos m 6 A también se unen a m 6 Am (Munns et al. 1979) y, por lo tanto, se describen con mayor precisión como anticuerpos 6-metiladenina para reflejar su unión a los dos nucleótidos que contienen 6-metiladenina, m 6 A y m 6 Am.

Antes del desarrollo de miCLIP, m 6 A y m 6 Am no podían distinguirse. Por lo tanto, los picos de MeRIP-seq que se encuentran en el 5 & # x02032 UTR no podrían asignarse fácilmente como m 6 A o m 6 Am. Posiblemente, la ubicación del pico de MeRIP-seq dentro de la UTR 5 & # x02032 podría sugerir que refleja un m 6 A, en lugar de un m 6 Am, que se encuentra exclusivamente en el nucleótido de inicio de la transcripción. Un pico en el medio del 5 & # x02032 UTR claramente no está en el nucleótido de inicio de la transcripción. Desafortunadamente, este razonamiento no es válido. Muchas transcripciones tienen sitios de inicio de transcripción alternativos, algunos de los cuales pueden estar aguas abajo de los sitios de inicio de transcripción anotados (Shiraki et al. 2003). Por lo tanto, un m 6 Am de una isoforma con una UTR 5 & # x02032 más corta que la isoforma UTR 5 & # x02032 anotada producirá un pico que parece estar en el medio de la UTR 5 & # x02032 anotada a pesar de que se encuentra en el sitio de inicio de la transcripción de una isoforma de ARNm diferente.

En MeRIP-seq, los fragmentos de ARN se inmunoprecipitan y el ARN se transcribe de forma inversa para formar la primera hebra de ADNc. A continuación, la segunda hebra de ADNc se fabrica cortando el ARN y utilizando el extremo libre como cebador para la síntesis de ADN. En este protocolo, el extremo 5 & # x02032 del ARN no se conserva, porque la segunda hebra de ADNc comienza de forma algo aleatoria en función de la posición de la muesca.

En el caso de m 6 A, la falta de conservación del extremo 5 & # x02032 no es importante porque m 6 A puede estar en cualquier parte del ARN inmunoprecipitado. Por lo tanto, m 6 A todavía estará en el medio del pico resultante. Sin embargo, para m 6 Am, los fragmentos de ARN serán diferentes & # x02014 en cada caso, el m 6 Am siempre estará exactamente en el extremo 5 & # x02032 del ARN. Por lo tanto, la pérdida del extremo 5 & # x02032 significa que el MeRIP-seq se colocará aguas abajo del sitio real del m 6 Am. El pico se verá como un pico de m 6 A aguas abajo del sitio real del m 6 Am.

miCLIP supera este problema preservando el extremo 5 & # x02032 exacto de los ARN inmunoprecipitados. Debido a que todas las lecturas que contienen m 6 Am tendrán el mismo final 5 & # x02032 (es decir, el nucleótido de inicio de la transcripción), esto dará como resultado la aparición de un & # x0201ccliff & # x0201d o borde que demarca claramente la posición de m 6 Am. Los métodos de biblioteca que preservan el extremo 5 & # x02032 de los ARN reducen la ambigüedad de asignar un pico a m 6 A om 6 Am.

Con base en el mapeo de m 6 Am usando miCLIP, se pudo identificar una función para m 6 Am. Nuestro análisis mostró que los ARNm que contienen m6Am muestran vidas medias de ARNm más largas que los ARNm que comienzan con otros nucleótidos. La estabilidad de m 6 Am parece estar mediada, al menos en parte, por la reducción de la susceptibilidad de los ARNm que contienen m 6 Am a la desintegración. El análisis bioquímico de los ARN que contienen m 6 Am mostró que fueron decapitados por la enzima de decapado Dcp2 con una eficiencia marcadamente reducida en comparación con ARN similares que contenían Am. Por lo tanto, una única modificación de N-6 metilo hace que el ARN muestre una reducción de la desintegración. En particular, los ARNm de m 6 Am también muestran una susceptibilidad reducida a los microARN, que inducen un paso de desencadenamiento como parte de su mecanismo para inducir la degradación del ARN. Por tanto, la m 6 Am puede tener un papel en la estabilización de los ARNm.

En la actualidad, la enzima que forma m 6 Am a partir de Am se ha purificado bioquímicamente (Keith et al. 1978) pero aún no se ha clonado. La identificación de esta enzima permitirá un análisis más completo de la función de esta modificación en el ARNm. Además, los & # x0201creaders & # x0201d de m 6 Am aún no se conocen, pero pueden contribuir al mecanismo de mejora de la traducción mediada por m 6 Am u otros efectos de m 6 Am.


Modificaciones de nucleótidos libres - Biología

A & quot; Ribonucleósido & quot; A & quot; Desoxirribonucleósido & quot; A & quot; Ribonucleótido & quot;

Derivados de nucleótidos :

& # 9 Muchas reacciones biosintéticas en el metabolismo de los carbohidratos requieren derivados de nucleótidos.

es decir, glucosa-1-fosfato + ATP ---- & gt ADP-glucosa

Estructura de nucleótidos

Estructura primaria de los ácidos nucleicos:

La secuencia u orden de los nucleótidos define la estructura primaria del ADN y el ARN. Los nucleótidos del polímero están unidos por enlaces fosfodiéster que se conectan a través del oxígeno del carbono 5 'de uno al oxígeno del carbono 3' del otro. Los átomos de oxígeno y nitrógeno en la columna vertebral dan al ADN y al ARN "polaridad".

Estructura secundaria de los ácidos nucleicos:

Una base de purina siempre se empareja con una base de pirimidina o más específicamente guanosina (G) con citosina (C) y adenina (A) con timina (T) o uracilo (U).

Observe que el par G-C tiene tres enlaces de hidrógeno, mientras que el par A-T tiene dos enlaces de hidrógeno.

ADN: la estructura secundaria del ADN consta de dos cadenas de polinucleótidos envueltas entre sí para formar una doble hélice. La orientación de la hélice suele ser hacia la derecha con las dos cadenas que van en contra de la otra.

La secuencia de bases en cada hebra está dispuesta de modo que todas las bases de una hebra se emparejen con todas las bases de otra hebra, es decir, el número de guanosinas siempre es igual al número de citosinas y el número de adeninas siempre es igual al número de timinas. .

Hay dos surcos, uno mayor y otro menor, en la doble hélice. Las proteínas y los fármacos interactúan con los grupos funcionales de las bases que quedan expuestas en los surcos.

Las formas estructurales del ADN pueden diferir en cuatro aspectos: el "sentido de la mano" (derecha o izquierda), la longitud del giro de la hélice, el número de pares de bases por giro y la diferencia de tamaño entre los surcos mayor y menor. La forma estructural más común de ADN es la forma B.

La estructura secundaria del ARN consta de un solo polinucleótido. El ARN se puede plegar para que se produzca un apareamiento de bases entre regiones complementarias. Las moléculas de ARN a menudo contienen regiones monocatenarias y bicatenarias. Las hebras son antiparalelas y adoptan una forma helicoidal. Las hélices tienen la forma A (ver arriba).

La estructura del ARN t (transferencia) yr (ribosómico) consta de múltiples estructuras de bucle de tallo monocatenario. Los tallos consisten en hélices formadas por el apareamiento de bases de regiones complementarias dentro del ARN. La estructura secundaria del ARNt y el ARNr son importantes para sus funciones biológicas, el ARNm también asume algún grado de estructura secundaria pero no en la misma medida que el ARNt y el ARNr.

Modificación química:

Algunas de las bases del ADN y el ARN pueden modificarse químicamente mediante metilación. Las enzimas, similares a las proteasas, llamadas exo y endonucleasas pueden escindir el ARN y el ADN. Las exonucleasas escinden los ácidos nucleicos de los extremos. Las endonucleasas reconocen secuencias específicas de ADN dúplex y se escinden en un sitio específico dentro o cerca de la secuencia reconocida. Las secuencias que se reconocen varían de cuatro a ocho pares de bases de longitud. Los fragmentos resultantes se pueden unir a otros fragmentos para crear nuevas combinaciones de secuencias de ADN.

El ADN se puede desnaturalizar en hebras simples y volver a naturalizarlo en una doble hélice. La desnaturalización reversible es esencial para los procesos biológicos de replicación y transcripción y para técnicas de biología molecular como la transferencia de Southern y las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Hay tres formas de desnaturalizar el ADN: enzimáticamente, químicamente o con calor. La desnaturalización del ADN a través del calor se puede seguir con un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 260 nm. La absorción aumenta con el aumento del calor rompiendo los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las hebras, desapilando y exponiendo las bases. Este efecto se llama efecto hipercrómico. La temperatura a la que se desnaturaliza el 50% del ADN se llama temperatura de fusión o Tmetro. Debido a que los pares de bases de GC se mantienen unidos con tres enlaces de hidrógeno (AT solo tiene dos), cuanto mayor es el porcentaje de pares de bases de GC, mayor es la Tmetro requerido para derretir el ADN.

Para que tenga lugar la renaturalización, las dos cadenas de ADN deben ponerse en contacto entre sí para iniciar el apareamiento de bases. Una vez que esto sucede, las dos hebras se vuelven a asociar rápidamente a lo largo de toda su longitud. Varias cosas influyen en la renaturalización: complejidad, concentración de ADN, concentración de cationes y temperatura. Los cationes como el sodio, el potasio y el magnesio disminuyen la repulsión intermolecular de las cadenas principales de fosfato cargadas negativamente de las dos cadenas de ADN. La renaturalización solo ocurrirá si la temperatura está por debajo de la Tm; sin embargo, si la temperatura es demasiado baja, la tasa de renaturalización disminuirá. Los estudios han demostrado que la mayor parte del ADN de las renaturalizaciones de los mamíferos consiste en secuencias repetitivas y sólo alrededor del 5% son secuencias únicas que codifican proteínas y enzimas.

La hibridación puede ocurrir entre cadenas complementarias de ácidos nucleicos derivados de diferentes fuentes. El ácido nucleico bicatenario que se forma es un heterodúplex y la extensión de los heterodúplex indica homología entre las dos fuentes de ácido nucleico. Por ejemplo, los humanos y los ratones se mezclan con una fracción muy pequeña del ADN que se renaturaliza, pero los humanos y los chimpancés dan una homología superior al 98%. El ADN y el ARN también pueden hibridar entre sí para formar heterodúplex.


La estructura del ARN

Hay un segundo ácido nucleico en todas las células llamado ácido ribonucleico o ARN. Como el ADN, el ARN es un polímero de nucleótidos. Cada uno de los nucleótidos del ARN está formado por una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos y un grupo fosfato. En el caso del ARN, el azúcar de cinco carbonos es ribosa, no desoxirribosa. La ribosa tiene un grupo hidroxilo en el carbono 2 ', a diferencia de la desoxirribosa, que solo tiene un átomo de hidrógeno (Figura 9.1.4).

Figura 9.1.4: La diferencia entre la ribosa que se encuentra en el ARN y la desoxirribosa que se encuentra en el ADN es que la ribosa tiene un grupo hidroxilo en el carbono 2 '.

Los nucleótidos de ARN contienen las bases nitrogenadas adenina, citosina y guanina. Sin embargo, no contienen timina, que en su lugar se reemplaza por uracilo, simbolizado por una "U". El ARN existe como una molécula monocatenaria en lugar de una hélice bicatenaria. Los biólogos moleculares han nombrado varios tipos de ARN en función de su función. Estos incluyen ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr) y moléculas mdash que participan en la producción de proteínas a partir del código de ADN.


Terapia génica no viral: diseño y aplicación de nanoplexos inorgánicos

Mario Viñambres Panizo,. Marzia Marciello, en Nanoteranósticos de ácidos nucleicos, 2019

2 Diseño inorgánico Nanoplex: Consideraciones generales

La aplicación de NP inorgánicas en la entrega de genes es un campo emergente porque se trata de nanoestructuras que se pueden preparar fácilmente con diferentes tamaños y formas. Además, se pueden funcionalizar de diversas formas para evadir el sistema reticuloendotelial, prolongando su vida media de circulación sanguínea y protegiendo los ácidos nucleicos transportados y / o ligandos conjugados para que alcancen las células diana. 9,11-14 Las NP de Au, las SPION, las QD y las CNT son las NP inorgánicas más estudiadas. Estas partículas muestran algunas ventajas importantes con respecto a los nanosistemas orgánicos, tales como mejores eficiencias de transfección, 12,15 no estar sujetas a ataque microbiano, 10,14 mayor estabilidad en almacenamiento, bajo costo de fabricación y mayor vida útil. 14,16,17 Además, muestran propiedades eléctricas, mecánicas, ópticas y magnéticas únicas que son menos comunes en las partículas poliméricas. 18,19 Algunos avances destacados en la aplicación de NP metálicas y nanomateriales basados ​​en carbono se informan, respectivamente, en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1 . Resumen de algunos avances en la aplicación de Au NP, QD y SPION para la terapia génica no viral

MaterialComposición y funcionalizaciónHallazgos usados ​​/ principales propuestosModelo de pruebaReferencia
Au NPNanopartículas de oro cubiertas con PEI conjugadas con ARNip que se dirigen a quinasas endógenas del ciclo celularPara regular a la baja la quinasa 1 oncogénica tipo polo. El complejo de nanopartículas dio un 60% de caída y una toxicidad celular insignificante cuando se usaron 40 nM de ARNipCélulas MDA-MB-435sCanción 2010 43
Au NPADN terminado en tiol unido a AuNP y luego hibridado con el ADN donante de distrofina funcional. La proteína Cas9 fue adsorbida por afinidadMejorar la transfección de la herramienta de edición de genes CRISPR / Cas9 y modificar el gen de distrofina mutado. 3.3% de los mioblastos fueron reparadosmdx modelo de ratónLee 2017155
QDQD de núcleo-shell de CdSe / ZnS. Recubrimiento de poli (etilenglicol), poli-ɛ-caprolactona y polietilenimina. ARNip conjugado con fluorescencia contra GAPDHPara rastrear y probar la separación del ADN de los complejos QDs-nanoportadores mediante una técnica de imagen basada en FRETCélulas SKOV3Endres 2014 60
QDMn: núcleo de ZnSe. Recubrimiento de poli (clorhidrato de alilamina) y ácido fólico para la transfección mediada por receptores. ARNip contra silenciamiento de K-Ras mutadoEl gen K-Ras fue silenciado en un 60%. No se observa citotoxicidad hasta 160 μg mL - 1 Células panc-1Wang 2015 61
SPIONNanopartículas comerciales Polymag complejado con plásmido (pCIKLux) que lleva un gen indicador de luciferasaTo apply an oscillating magnet to improve the magnetofection technique up to 6 times compared with original magnetofection protocolNCI-H292 cellsMcBain 2008 80
SPIONNanocluster containing SPIONs of 5 nm, fluorescent Rhodamine B in a matrix polymer of poly(lactide-co-glycolide) and PEI coating, and conjugated with pDNA containing the GFP reporterTo track the complex by both fluorescence imaging and MRI. 39% of GFP expression and nontoxic effects for 96 hours at a concentration of 200 μg mL -1 Human mesenchymal stem cells (hMSCs)Park 2017 83

AuNP, gold nanoparticle FRET, fluorescence resonance energy transfer GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GFP, green fluorescent protein Resonancia magnética, molecular resonance imaging PEI, polyethylenimine pDNA, plasmid DNA QD, quantum dot ARNip, short interfering RNA SPION, superparamagnetic iron oxide nanoparticle.

Tabla 2 . Summary of Some Outstanding Progress in the Application of Graphene and GO Nanomaterials for Nonviral Gene Therapy

MaterialFormaFunctionalizationProposed Use/Major FindingsTesting ModelReferencia
Graphene/GONanosheetsPAMAM + OA13-Fold increase in transfection efficiency with respect to grapheneHeLa cells and MG-63 cellsLiu 2014 124
IRNanosheetsPEICodelivery of siRNA and doxorrubicine for anticancer therapyB-cell lymphoma 2 cellsZhang 2011 137
IRNanosheetsPEG + PEINanocarriers with photothermally enhanced intracellular trafficking via NIR for light-controllable gene deliveryHeLa cells and MDA-MB-435s cellsFeng 2013 134
IRNanosheetsPEIDelivery of VEGF-165 gene for acute myocardial infarctionIntramyocardial injection in ratPaul 2014 138
IRQDsPLL + PEGMicroRNAs imaging analysis and gene deliveryHeLa cellsDong 2015 132
IRNanosheetsPL-PEG + CPPsImproved hydrocolloidal stability and siRNA transfection efficiencyMCF-7 cellsImani 2016 136
IRQDsCodelivery of MPG-2H1 chimeric peptide and plasmid DNA for simultaneous gene delivery and trackingHEK 293T cellsGhafary 2017 133

CPP, cell penetrating peptide ADN, deoxyribonucleic acid IR, graphene oxide NIR, near-infrared light OA, oleic acid PAMAM, polyamidoamine CLAVIJA, poly(ethylene glycol) PEI, polyethylenimine PLL, poly( l -lactide) PL-PEG, phospholipid-based poly(ethylene glycol) QDs, quantum dots ARN, ribonucleic acid ARNip, short interfering RNA VEGF, vascular endothelial growth factor.

With the aim of forming a stable complex with the carried therapeutic nucleic acid, the surface of the inorganic NPs needs to be chemically modified. Specifically, surface modifications are performed for different objectives: (1) to allow a stable conjugation of the carried nucleic acid (2) to protect the NPs from opsonization (3) to increase the selective cellular binding and (4) to allow internalization through receptor-mediated endocytosis. 3

After modification of the NP surface, the therapeutic gene is carried using different strategies. Depending on the type of chemical NP-nucleic acid association, inorganic vectors can be differently categorized as: (1) vectors that form a condensed complex with the nucleic acid, protecting it from nucleases and other blood components (2) nanocarriers that expose specific ligands for target cells (3) nanovectors able to improve the release of the genetic material into the cytosol or nucleus and (4) nanosystems that prolong the release of the therapeutic gene in tissues. 1

Typical chemical modifications /conjugations can be obtained by establishing three main kinds of bonds:

Weak bindings—These are generally represented by electrostatic interactions that lead to the formation of reversible bonds. Normally, they are based on the attraction between positively and negatively charged species and can easily be broken under high salt concentrations. Some examples are ionic bindings, hydrogen bonds, and Van der Waals forces. 20

Weak interactions are preferred for the complexation of the nucleic acid with the NPs because the therapeutic can be easily released into the cell, while also avoiding chemical modifications of it. An interesting example is represented by multiple electrostatic layers on the surface of NPs that can be deposited using a layer-by-layer (LbL) approach. 21

Strong bonds—They are usually characterized by irreversible conjugations. They are resistant to high-force ionic conditions differently from electrostatic interactions. Generally, they are formed between different functional groups (e.g., carboxylic acids, amines, thiols), forming very strong bonds, such as amide, ester, or disulfide bridges. 20

The metal-ligand interaction between Au and thiolated molecules, 22 as well as the binding affinity of protein-ligand (including lock-and-key, induced fit, and conformational selection models) 23,24 are also included in this category of conjugation.

Versatile and quick click chemistry reactions can be used to obtain some reactions that lead to the formation of resistant bonds. These include, for example, cycloadditions (e.g., 1,3-dipolar cycloadditions of alkynes to azides, hetero-Diels-Alder cycloadditions), nucleophilic ring openings consisting of opened strained heterocyclic electrophiles (e.g., aziridines, epoxides, cyclic sulfates), and additions to carbon-carbon multiple bonds (e.g., epoxidations, aziridinations, dihydroxylations, sulfenyl halide additions, nitrosyl halide additions, and certain Michael additions). 25,26

Encapsulation—It leads to the formation of hybrid nanomaterials based on the entrapment of inorganic particles with the therapeutic into a polymer. 27 This polymer can be stimuli-sensitive, so able to release its contents in the presence of specific conditions (typically temperature and pH). 28,29


Nucleotides and Bases

Nucleotide Structure
Courtesy of the National Human Genome Research Institute

Nucleótidos

A nucleotide is the basic structural unit and building block for ADN. These building blocks are hooked together to form a chain of DNA. A nucleotide is composed of 3 parts:

* five-sided sugar
* phosphate group
* nitrogenous base (nitrogen containing)

Image courtesy of the National Human Genome Research Institution

The sugar and phosphate group make up the backbone of the DNA double helix, while the bases are located in the middle. A chemical bond between the phosphate group of one nucleotide and the sugar of a neighboring nucleotide holds the backbone together. Chemical bonds (hydrogen bonds) between the bases that are across from one another hold the two strands of the double helix together.

There are four types of bases in DNA. They are called:

* Adenine (A)
* Cytosine (C)
* Guanine (G)
* Thymine (T)

Courtesy of the National Human Genome Research Institution

Bases are the part of DNA that stores information and gives DNA the ability to encode fenotipo, a person’s visible traits. Adenine and guanine are purine bases. These are structures composed of a 5-sided and 6-sided ring. Cytosine and thymine are pyrimidines which are structures composed of a single six-sided ring. Adenine always binds to thymine, while cytosine and guanine always bind to one another. This relationship is called complementary base paring. These complementary bases are bonded together via hydrogen bonds, which can be easily broken apart when the DNA needs to unzip and duplicate itself.

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