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¿Cómo funciona la transformación por choque térmico?

¿Cómo funciona la transformación por choque térmico?


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¿Qué sucede exactamente cuando las células competentes como DH5ɑ se someten a una descarga de calor con ADN presente? ¿Cómo ingresa el ADN a las células?

Específicamente, ¿por qué son necesarios todos los pasos? ¿Qué pasa si sufres un golpe de calor justo después de agregar ADN? ¿Qué pasa si no se pone hielo después del golpe de calor? ¿Qué hace el cloruro de calcio? ¿Qué sucede realmente cuando las células son "competentes"? ¿Qué gobierna la eficiencia de la transformación (además de cosas obvias como la cantidad de ADN o células)?

Para dejar en claro de qué estoy hablando, utilizo un protocolo como el siguiente:

  1. Saque las células de -80C y descongele en hielo durante 5 min.
  2. Agregue 1 ul (~ 500 ng) de ADN plasmídico a 50 ul de células, mezcle suavemente con la punta de la pipeta.
  3. Dejar en hielo durante 30 min.
  4. Poner en baño de agua a 42 ° C durante 45 segundos.
  5. Ponga en hielo durante 10 min.
  6. Agregue 950 ul de LB, ponga a 37 ° C durante 1 hora.
  7. Extienda 300 ul del cultivo en placas de agar LB con la selección adecuada.

Por lo general, obtengo miles de colonias de esto (de hecho, a menudo es necesaria una dilución 1:10 o 1: 100 para poder obtener colonias aisladas). Incluso si me salto el crecimiento, todavía obtengo cientos.

No tengo mi protocolo celular competente, pero básicamente utilizo ese cloruro de rubidio que todos usan: las células DH5ɑ se lavan con algunos tampones, se suspenden en una solución con CaCl2 y RbCl y luego se congelan en nitrógeno líquido. En realidad, nunca medí, pero generalmente la concentración de células en las alícuotas congeladas es aproximadamente 10 veces mayor que la que obtendría de un cultivo líquido durante la noche (se centrifugan y se resuspenden en un pequeño volumen).


La transformación por choque térmico altera la fluidez de la membrana creando poros:

Un aumento repentino de temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y permite que el ADN plasmídico ingrese a la célula bacteriana.

Referencia: Revista de experimentos visualizados. Transformación bacteriana: el método de choque térmico. 2014. http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method

El cambio de temperatura altera la fluidez del estado de la membrana semicristalina alcanzado a 0oC permitiendo así que la molécula de ADN ingrese a la célula a través de la zona de adhesión.

Referencia: Anh-Hue T. Tu. Transformación de Escherichia coli convertida en competente mediante el protocolo de cloruro de calcio. 2008-2013. Sociedad Americana de Microbiología

… El paso de pulso de calor (0 grados C42 grados C) del procedimiento de transformación estándar había reducido considerablemente la fluidez de la membrana externa de las células. La disminución de la fluidez fue causada por la liberación de lípidos de la superficie celular al medio extracelular. Un posterior choque de frío (42 grados C0 grados C) en las células elevó la fluidez a su valor original y esto fue causado por la liberación de proteínas de membrana al medio extracelular.

Referencia: Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. ¿Cómo penetra el ADN plasmídico en las membranas celulares en el proceso de transformación artificial de Escherichia coli? Mol. Membr. Biol. Agosto de 2008; 25 (5): 411-22. doi: 10.1080 / 09687680802187765. PubMed PMID: 18651316.


Transformación por choque térmico. ¿Cómo funciona? - (04 / Ago / 2008)

No puedo encontrar cómo funciona la transformación de choque térmico. Parece que nadie lo sabe & # 33 ¿Es así? Alguien sabe como funciona? Quiero decir. Me gustaría conocer el mecanismo físico involucrado en este método.

No puedo encontrar cómo funciona la transformación de choque térmico. Parece que nadie lo sabe & # 33 ¿Es así? Alguien sabe como funciona? Quiero decir. Me gustaría conocer el mecanismo físico involucrado en este método.

También me gustaría saber cómo funciona el choque térmico. ¿Quizás alguien conozca una fuente al respecto? Revisé toneladas de artículos de investigación científica y ninguno describió cómo funciona el choque térmico. La mayoría de ellos acaba de mencionar que aumenta la eficiencia de la transformación. Como quiero escribir un ensayo, necesitaría información profunda. Ya estoy un poco desesperado.

Como mikkel
Sería genial si tuvieras una fuente sobre eso.

También leí sobre un gradiente térmico que ayuda a los plásmidos a entrar en las células. Pero simplemente no puedo encontrar una fuente que diga cómo funciona.

Así es como lo entiendo.

Agregar el plásmido a las células en hielo hace que el plásmido se adhiera a la pared celular. El choque térmico abre los poros (creados por la preparación de células competentes) y hace que el plásmido ingrese a la célula. Colocar las células en hielo después del choque cierra los poros y evita que el plásmido se escape.

Así es como lo entiendo.

Agregar el plásmido a las células en hielo hace que el plásmido se adhiera a la pared celular. El choque térmico abre los poros (formados por la preparación de células competentes) y hace que el plásmido entre en la célula. Colocar las células en hielo después del choque cierra los poros y evita que el plásmido se escape.

Eso suena muy parecido a lo que he leído, y creo que esa es más o menos la respuesta.

Supongo que este artículo sería exactamente el correcto, lamentablemente tienes que comprarlo. así que aquí está solo el resumen:
abstracto

Si alguien conoce un artículo gratuito similar, dígaselo a & # 33

Hola Toulouse, muchas gracias & # 33 & # 33 & # 33. Haré todo lo que pueda para conseguir ese papel. Si lo consigo, le enviaré una copia en pdf. Incluso aquí los bioforumers podrían estar interesados ​​en conseguir el papel. así que gracias de nuevo.

Así es como lo entiendo.

Agregar el plásmido a las células en hielo hace que el plásmido se adhiera a la pared celular. El choque térmico abre los poros (formados por la preparación de células competentes) y hace que el plásmido entre en la célula. Colocar las células en hielo después del choque cierra los poros y evita que el plásmido se escape.

Eso suena muy parecido a lo que he leído, y creo que esa es más o menos la respuesta.

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Autofagia mediada por chaperona y enfermedad renal

18.4.2 Chaperones-Hsc70 y socios

Hsc70, o Hsc73 en determinadas ocasiones, es un miembro citoplasmático muy conservado de la familia Hsc70 [38]. Representa aproximadamente el 1% de la proteína intracelular total. Se ha confirmado que las Hsc70s desempeñan múltiples funciones en una amplia variedad de procesos, incluido el plegamiento y el tráfico de proteínas intracelulares [42,43], el tráfico de antígenos, la presentación de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) [44], la disociación de clatrina y el ensamblaje de proteínas de vesículas recubiertas [45,46]. Se ha confirmado que la Hsc70 es la única acompañante que se une directamente al sustrato de CMA, un proceso regulado por los cambios conformacionales impulsados ​​por la hidrólisis del ATP [26,47-49]. La forma de Hsc70 unida a ADP contiene la mayor afinidad por todos los sustratos potenciales de CMA [50,51]. Hsc70 se distribuye en el citoplasma o en la luz del lisosoma [7,48,52]. Cytoplasmic Hsc70 (cyt-Hsc70) reconoce la presencia de un motivo similar a KFERQ en las proteínas del sustrato, lo que facilita su transferencia a los receptores CMA ubicados en las membranas de los lisosomas [26,52]. También se ha propuesto que cyt-Hsc70 participa en el despliegue de las proteínas del sustrato, que es necesario para la entrada en el lumen de los lisosomas [23]. Las formas quiméricas de los sustratos de CMA suelen ser capaces de unirse a las membranas lisosomales, aunque no experimentan translocación cuando el despliegue se bloquea químicamente. Estos datos sugieren que el despliegue no es necesario para la unión [48], lo que sugiere la posible aparición de la unión del sustrato sobre la membrana lisosomal antes del proceso de despliegue [24].

Se ha demostrado que Cytosolic Hsc70 está asociado con otras cochaperonas que ayudan a desplegar y liberar el sustrato a la degradación y regular el paso de CMA [50]. Por ejemplo, la cadera (proteína que interactúa con Hsc70), la proteína organizadora Hsc70-hsp90 (lúpulo), hsp90, hsp40 y Bag1 (antógeno 1 asociado a BCl2) se han encontrado en las membranas lisosomales, que pueden estar co-inmunoprecipitadas con el complejo de la proteína sustrato y Hsc70. El probable papel permisivo de estas cochaperonas en CMA recibió una mayor consolidación en el sentido de que la incubación de lisosomas utilizando anticuerpos bloqueantes de estas cochaperonas muestra respuestas negativas sobre la actividad de CMA [48,50]. Por ejemplo, se propuso que hsp40 estimula la actividad de la ATPasa Hsc70 para promover la tasa de unión a las proteínas sustrato. Además, Hip puede promover el ensamblaje de Hsc70 con los sustratos y hsp40 [27, 38], y estabilizar el complejo de sustrato y Hsc70 bloqueando la unión del ATP recién sintetizado [50]. Bag1 funciona como un factor de intercambio de nucleótidos que puede favorecer la liberación de sustrato de la chaperona al promover la unión de ATP [53]. Bag1 tiene varias isoformas diferentes, provocando efectos reguladores tanto positivos como negativos sobre la actividad de Hsc70 [50,53]. Hop actúa como un intercambiador de nucleótidos y también puede actuar como un adaptador entre Hsc70 y Hsp90 [50]. La cochaperona Hsp90 reconoce la región desplegada dentro de las proteínas del sustrato [48] y previene su agregación no deseada mediante el acoplamiento con los segmentos desplegados de las proteínas diana para lograr una estabilización óptima [50]. La función de Hsp90 en la regulación de la actividad acompañante puede ser asistida por cochaperonas adicionales como p50 y Cdc37. Se ha informado de que tanto Hsc70 como Hsp90 se localizan en la luz lisosomal y actúan de forma coordinada [4,8,48,54,55]. De hecho, en cualquier punto dado, ciertas cochaperonas pueden tener una respuesta estimulante mientras que otras ofrecen un efecto inhibidor sobre la actividad de la cochaperona, lo que denota la complejidad de múltiples complejos sustrato-chaperona en varios pasos del proceso CMA [48].

Teniendo en cuenta el papel esencial de Hsc70 en CMA, es plausible apuntar a Hsc70 en el control de la actividad de CMA. Dada su amplia gama de funciones celulares, la manipulación directa de los niveles de Hsc70 no es específica y no es factible para la inhibición de CMA. Con este fin, la focalización de las interacciones de Hsc70 con sus cochaperonas debería ser más realista por consideraciones terapéuticas. Por ejemplo, la cochaperona citosólica CHIP (terminal carboxilo de la proteína que interactúa con Hsc70) parece funcionar como un buen candidato para dirigir las proteínas citosólicas al replegamiento o degradación. Se ha demostrado que el CHIP niega las alteraciones patológicas y de comportamiento en la atrofia muscular espinal y bulbar mediante la regulación al alza de la maquinaria proteolítica [56]. Muchos más estudios también han confirmado un papel de la degradación de la proteína citosólica a través de la vía del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) en el efecto beneficioso de la homeostasis celular que ofrece el CHIP [57]. Otros estudios han indicado que el CHIP está asociado con la degradación lisosomal en la eliminación de acumulaciones anormales de proteínas [48]. Se justifican estudios más profundos para investigar el papel de diferentes vías autofágicas en la degradación lisosomal asociada a CHIP, y si dicho proceso es dependiente de Hsc70.


Contenido

Con la introducción de estresores ambientales, la célula debe poder mantener la proteostasis. La sujeción aguda o crónica a estas condiciones nocivas provoca una respuesta citoprotectora para promover la estabilidad del proteoma. [9] Las HSP (por ejemplo, HSP70, HSP90, HSP60, etc.) están presentes en condiciones normales, pero bajo estrés por calor, están reguladas positivamente por el factor de transcripción factor de choque térmico 1 (HSF1). [10] [11] Hay cuatro factores de transcripción diferentes que se encuentran en los vertebrados (HSF 1-4) donde el principal regulador de las HSP es HSF1, mientras que σ 32 es el factor de transcripción de choque térmico en E. coli. [12] [13] Cuando no está unido al ADN, HSF1 está en un estado monomérico donde está inactivo y regulado negativamente por chaperones. [14] Cuando ocurre un estrés, estas chaperonas se liberan debido a la presencia de proteínas desnaturalizadas y varios cambios conformacionales de HSF1 hacen que experimente una localización nuclear donde se activa a través de la trimerización. [15] [14] HSF1 recién trimerizado se unirá a elementos de choque térmico (HSE) ubicados en regiones promotoras de diferentes HSP para activar la transcripción del ARNm de HSP. El ARNm eventualmente se transcribirá y comprenderá las HSP reguladas al alza que pueden aliviar el estrés en cuestión y restaurar la proteostasis. [16] HSF1 también regulará la expresión de HSP a través de modificaciones epigenéticas. El HSR eventualmente se atenuará a medida que HSF1 regrese a su forma monomérica, regulada negativamente a través de la asociación con HSP70 y HSP90 junto con modificaciones postraduccionales adicionales. [17] La ​​HSR no solo está involucrada con el aumento de los niveles de transcripción de las HSP, otras facetas incluyen la estabilidad del ARNm inducida por estrés que previene errores en el ARNm y un control mejorado durante la traducción para frustrar el plegamiento incorrecto. [18]

Las chaperonas moleculares se denominan típicamente proteínas que se asocian y ayudan a otras proteínas a alcanzar una conformación nativa sin estar presentes en el estado final. [19] Las chaperonas se unen a su sustrato (es decir, una proteína mal plegada) de una manera dependiente de ATP para realizar una función específica. [20] Los residuos hidrófobos expuestos son un problema importante con respecto a la agregación de proteínas porque pueden interactuar entre sí y formar interacciones hidrófobas. [21] El trabajo de las chaperonas es prevenir esta agregación uniéndose a los residuos o proporcionando a las proteínas un ambiente "seguro" para que se plieguen correctamente. [22] También se cree que las proteínas de choque térmico desempeñan un papel en la presentación de fragmentos de proteínas (o péptidos) en la superficie celular para ayudar al sistema inmunológico a reconocer las células enfermas. [23] Las principales HSP involucradas en la HSR incluyen HSP70, HSP90 y HSP60. [5] Las chaperonas incluyen las HSP70 y las HSP90, mientras que las HSP60 se consideran chaperoninas. [18]

La familia de chaperonas HSP70 es el principal sistema HSP dentro de las células, desempeñando un papel clave en la traducción, postraducción, prevención de agregados y replegamiento de proteínas agregadas. [24] Cuando se traduce una proteína naciente, HSP70 puede asociarse con las regiones hidrófobas de la proteína para evitar interacciones defectuosas hasta que se complete la traducción. [25] El plegamiento de proteínas postraduccionales ocurre en un ciclo en el que la proteína se une / libera de la chaperona, lo que permite enterrar grupos hidrófobos y ayudar a superar la energía necesaria para plegarse de manera oportuna. [26] HSP70 juega un papel en la desagregación de proteínas utilizando el mecanismo mencionado anteriormente, la chaperona se unirá a los residuos hidrófobos expuestos y desarmará parcial o totalmente la proteína, permitiendo que HSP70 ayude en el replegamiento adecuado. [27] Cuando las proteínas están más allá del punto de replegamiento, las HSP70 pueden ayudar a dirigir estos agregados potencialmente tóxicos para que sean degradados por el proteasoma o por autofagia. [28] Las HSP90 son paralelas a las HSP70 con respecto al replegamiento de proteínas y su uso en la eliminación de proteínas. [4] Una diferencia entre las dos HSP es la capacidad de HSP90 para mantener las proteínas en una configuración desplegada pero estable hasta que una señal hace que la proteína se trasloque y complete su plegamiento. [25]

A veces, HSP70 es incapaz de ayudar de manera efectiva a una proteína a alcanzar su estructura tridimensional final. La razón principal es que las barreras termodinámicas para el plegado son demasiado altas para que la acompañante se encuentre. [24] Debido a que el espacio intracelular está muy abarrotado, a veces las proteínas necesitan un espacio aislado para evitar interacciones aberrantes entre otras proteínas, que es proporcionado por chaperoninas o HSP60. [7] Las HSP60 tienen forma de barril y son adecuadas para unirse a los residuos hidrófobos de proteínas. [29] Una vez que una tapa se une a la chaperonina, la proteína queda libre dentro del barril para sufrir un colapso hidrofóbico y alcanzar una conformación estable. [30] Una vez que se quita la tapa, la proteína puede doblarse correctamente y seguir adelante para realizar su función o regresar a un HSP si aún no se dobla con precisión. [31] Estas chaperonas funcionan para eliminar la agregación y acelerar significativamente el plegamiento de proteínas. [21]

Tras el choque térmico, hay una segunda rama menos estudiada conocida como regulación negativa transcripcional global. Identificado por el laboratorio John T Lis.

El descubrimiento de la respuesta al choque térmico se atribuye al genetista italiano Ferruccio Ritossa, quien observó cambios llamados "bocanadas" cromosómicas en respuesta a la exposición al calor mientras trabajaba con los cromosomas politénicos de Drosophila. [32] [33] Según él mismo, el descubrimiento fue el resultado fortuito de una temperatura elevada involuntaria en una incubadora de laboratorio. [34] Las observaciones de Ritossa, reportadas en 1962, [35] fueron posteriormente descritas como "el primer estrés ambiental conocido que actúa directamente sobre la actividad genética" [32] pero inicialmente no fueron ampliamente citadas. [32] [36] La importancia de estas observaciones se hizo más clara en la década de 1970, cuando se descubrió una clase distinta de proteínas de choque térmico en el laboratorio de Herschel K. Mitchell, [37] y cuando se informaron respuestas de choque térmico en otros organismos y llegó a ser reconocido como universal. [32] [36] [38]


Haga una hipótesis: ¿Qué esperaré de mis células transformadas?

Desde el laboratorio anterior, podemos identificar nuestros plásmidos. Los plásmidos son pGlo, pUC18 / 19 o pUC18 / 19 con un inserto de 6 kb que interrumpe el gen LacZ. pGlo contiene un gen que codifica la proteína GFP que emitirá una fluorescencia verde bajo la luz ultravioleta y es de 5,4 kb. pUC tiene normalmente un tamaño de 2,7 kb. LacZ es un gen que codifica la proteína y beta-galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa en los monosacáridos galactosa y glucosa. X-Gal es una sustancia química que se parece a la lactosa. Sin embargo, tras la hidrólisis, la molécula deposita una coloración azul en la célula.


Proteínas de choque térmico y HD ^

En la EH, se produce una gran cantidad de proteína huntingtina mutante en la célula y forma agregados. Esta agregación desencadena la respuesta de choque térmico y se producen muchas proteínas de choque térmico para tratar el problema. En la EH, la hsp70, con la ayuda de la hsp40, se une a todas las superficies externas de las proteínas huntingtina mal plegadas. La capa de hsp70 cambia la forma en que las proteínas de huntingtina mal plegadas interactúan entre sí y previene la formación de agregados. Además, la capa de hsp70 puede prevenir interacciones dañinas con otras proteínas en la célula. Para obtener más información sobre las formas en que la huntingtina mutante puede inhibir otras proteínas en la célula, haga clic aquí. Por tanto, es posible que la proteína de choque térmico hsp70 pueda suprimir los efectos tóxicos de la agregación de la huntingtina.

Hay muy poca investigación sobre cómo interactúan otras familias de proteínas de choque térmico con los agregados de huntingtina. Una proteína de la familia hsp100, llamada hsp104, reduce tanto el efecto tóxico como el tamaño de los agregados de huntingtina. En un experimento con un HD C. elegans modelo que demuestra una función motora débil, la adición de hsp104 alivia este deterioro. Hsp104 puede romper las proteínas de la huntingtina que comienzan el proceso de agregación. Hsp104 también puede funcionar en cooperación con hsp70 y hsp40 para romper activamente los agregados y disminuir algunos de sus efectos tóxicos. Sin embargo, la hsp104 solo se encuentra en la levadura. No existen proteínas similares en los mamíferos, por lo que parece poco probable que se utilice para algún tipo de tratamiento.

No hay mucha investigación sobre las proteínas de choque térmico & ldquosmall & rdquo. Existe alguna evidencia de que reducen los efectos tóxicos de la EH, pero el mecanismo aún no está claro.


Transformación de células competentes y aislamiento de ADN plasmídico

  1. Descongele las células competentes en hielo durante aproximadamente 45 min (use aproximadamente 120 & # 956 l en 1,5 ml de eppendorf).
  2. Agregue la mezcla de ligadura (o el control positivo o negativo apropiado) & # 8211 aproximadamente 10-15 & # 956l.
  3. Mueva suavemente la parte inferior del eppendorf para mezclar.
  4. Incubar en hielo durante 30 min.
  5. Calentar & # 8220shock & # 8221 las celdas para su transformación colocándolas en un baño a 42 & # 176C o en una placa calefactora durante solo 30 segundos.
  6. Vuelva a colocar las células en hielo.
  7. Agregue 500 & # 956l de medios LB
  8. Agite en un agitador orbital a aproximadamente 240 rpm durante 90 min.
  9. Centrifugue la solución a 12.000 rpm durante 30 segundos para sedimentar las bacterias.
  10. Vierta la mayor parte del sobrenadante dejando aproximadamente 50 & # 956l de medio por encima de las bacterias sedimentadas.
  11. Vuelva a suspender las bacterias en el LB restante y luego colóquelas en placas LB / Aapicilina (o placas de agar LB con el antibiótico apropiado) e incube durante la noche a 37 ° C.
  12. A la mañana siguiente, revise la (s) placa (s) para ver si hay colonias. Raspe una porción de colonias individuales con una punta de pipeta estéril o un palillo de dientes y sumerja en un tubo de cultivo estéril que contenga medio LB (3 ml) suplementado con ampicilina (6 & # 956l de caldo de ampicilina al 5%). Agite en un agitador orbital a 37 ° C y # 176 ° C durante al menos 2 horas.
  13. Cuando la solución haya alcanzado un nivel razonable de turbidez debido al crecimiento bacteriano, utilice aproximadamente la mitad del cultivo bacteriano (1,5 ml) para una preparación mínima y realice una digestión de restricción en el plásmido resultante que se aisló. Si se ve el inserto apropiado en la electroforesis en gel de agarosa, puede verificar el ADN restante mediante la secuenciación.
  14. Para la preparación de ADN plasmídico, coloque aproximadamente 1 ml de los 3 ml de cultivo de arriba en un matraz estéril (500 ml) que contenga aproximadamente 150-200 ml de medio LB más ampicilina (400 & # 956l de stock al 5% en 200 ml de LB) . Agite en un agitador orbital durante la noche a 37 & # 176C. Al día siguiente, continúe con la preparación del ADN.

Dr. Richard Patten
Centro médico Tufts-New England
Centro de Investigación de Cardiología Molecular
Boston, MA


¿Por qué se colocaron las células en CaCl2 y se sometieron a un choque térmico durante este experimento?

En el laboratorio, bacteriano células puede hacerse competente y posteriormente introducir el ADN mediante un procedimiento llamado Golpe de calor método. Golpe de calor La transformación utiliza un entorno rico en calcio proporcionado por el cloruro de calcio para contrarrestar la repulsión electrostática entre el ADN plasmídico y el bacteriano. celular membrana.

Además, ¿cuál es el propósito del CaCl2 en la transformación? Cloruro de calcio (CaCl2) transformación es una técnica de laboratorio en biología celular procariota (bacteriana). Aumenta la capacidad de una célula procariota para incorporar ADN plasmídico, lo que les permite ser genéticamente transformado.

En consecuencia, ¿cómo el CaCl2 y el tratamiento de choque térmico mejoran la captación de ADN?

los Golpe de calor paso despolariza fuertemente la membrana celular de CaCl2-tratado células. Por lo tanto, la disminución del potencial de membrana reduce la negatividad del potencial interno de la célula, lo que finalmente permite el movimiento de cargas negativas. ADN en el interior de la celda.

¿Se pueden calentar las células electrocompetentes con un choque térmico?

Células electrocompetentes están preparados para hacer frente a la electrotransformación y quimiocompetentes células están hechos para ser transformados a través de Golpe de calor. Si usted ejecutar electroporación químicamente células competentes, Vas a obtener un arco eléctrico muy agradable debido al cloruro de calcio presente en celda muestra.


¿Cómo funciona la transformación por choque térmico? - biología

¿Cuáles son las figuras de acción favoritas de los bioquímicos y rsquo? & # 129300 ¡Transformadores! & # 129299 ¿Ven como un * shock *? Con suerte, soy lo suficientemente * competente * como para describir cómo en PLASMID TRANSFORMATION podemos usar células químicamente competentes y choque térmico para introducir ADN en las células bacterianas. & # 129310 ¡Logro una buena * eficiencia * en llevar esta información a sus cerebros!

Últimamente, la mayor parte del tiempo, en lugar de estar en este banco, he estado en el banco de la habitación caliente, haciendo experimentos con cosas marcadas radiactivamente. Pero este banco todavía ha estado ocupado y ndash por las mañanas, es un desastre ya que configuré todas las partes no radiactivas de mis experimentos y ndash, ¡pero todavía se visita en muchos lugares durante el día debido a lo que hay en el final de la bahía! ¡El baño de agua! Y nuestro laboratorio lo necesita para las transformaciones, ¡así que a menudo no sé si la gente viene a buscarme o al baño!

En CLONACIÓN MOLECULAR tomamos un gen de un lugar y lo pegamos en un VECTOR que sirve como un "vehículo" para llevar ese gen a las células. A menudo, utilizamos VECTORES PLÁSMIDOS, que son piezas circulares de ADN que introducimos en las bacterias.

Los vectores plásmidos son los vehículos, pero necesitan túneles para entrar en las células, pero no queremos que esos túneles sean enormes y siempre estén abiertos de par en par, o el contenido de las células podría derramarse, entrar cosas al azar, etc. una forma de controlar su tamaño y / o apertura / cierre.

Hay 2 rutas principales para la transformación artificial y la competencia química ndash + choque térmico y electroporación amp

Con células químicamente competentes, se usa calcio para colocar el ADN justo en los túneles (zonas de adhesión) y el choque térmico para & ldquoopen up un carril adicional & rdquo (ensanchar los poros), acelerar los coches y hacer que el interior de la célula sea más atractivo ( menos cargada negativamente). Con la electroporación, utiliza corriente eléctrica para & ldquobore & rdquo túneles temporales. Usualmente usamos transformación química, por lo que & rsquos en lo que me voy a enfocar en este post

Descargo de responsabilidad: no está del todo claro cómo sucede de manera mecánica, pero aquí hay algunas teorías principales

Independientemente del método, los túneles tienen que atravesar la (s) membrana (s) celular (s), que son como sándwiches formados por 2 capas de moléculas anfifílicas y ndash, dichas moléculas tienen una parte que & rsquos hidrofílica (amante del agua) y otra parte que & rsquos hidrofóbica (agua evitando)

Las células que usamos normalmente son diferentes cepas de e. coli, que como bacterias & ldquoGram-negativas & rdquo, tienen 2 de estas capas dobles para atravesar & ndash allí & rsquos una membrana externa, luego un & ldquoperiplasmic space & rdquo, luego una & ldquoinner membrana & rdquo, luego, finalmente, usted y rsquore en el interior de la célula, el cytoplasm. En los túneles llamados zonas de adhesión, estas 2 membranas se fusionan.

Todas las membranas tienen FOSFOLÍPIDOS, que tienen una cabeza hidrófila con un grupo fosfato cargado negativamente y una cola hidrófoba (que evita el agua) con cadenas lipídicas (grasas). Se orientan de cola a cola para formar una barrera que rodea la célula. La membrana externa y la membrana externa de los rsquos también tienen LIPOPOLISACÁRIDOS (LPS y rsquos) que, además, tienen cadenas de azúcar (polisacáridos) que se adhieren a ellos y que pueden tener cargas aún más negativas.

El ADN también tiene una carga negativa debido a los grupos fosfato en su estructura. Esto lo ayuda a mantenerse soluble en agua, pero también lo hace normalmente repulsivo hacia el exterior de la membrana (las cargas similares se repelen). Entonces necesitamos un mediador cargado positivamente (catiónico).

El cloruro de calcio (CaCl2) proporciona una fuente de cationes divalentes (carga de 2) (moléculas cargadas positivamente) CaCl2 es la forma de sal en la que lo compramos, pero cuando lo disolvemos en agua, se ioniza completamente, lo que significa que el Ca2 + se desprende esos Cl- aniones (iones cargados negativamente)

El Ca2 + ayuda a ocultar el ADN y las membranas y rsquo cargas negativas para que no se repelan entre sí y, mejor aún, el Ca2 + puede unirse a más de una cosa a la vez, por lo que puede unir el ADN a la superficie celular para que esté en el lugar correcto para entrar rápidamente. cuando los túneles se abren más durante el paso de choque térmico.

Cuando calentamos las células, los poros eliminan algunos de sus lípidos, por lo que los túneles se hacen más grandes y la membrana se "despolariza", lo que significa que el interior de la célula se vuelve menos cargado negativamente y, por lo tanto, más atractivo para el ADN cargado negativamente. Normalmente, las células mantienen un potencial de membrana bombeando protones (H +) de modo que el interior de la célula sea más negativo, lo que no sería muy atractivo para el ADN cargado negativamente.

El calor también crea un desequilibrio térmico y ndash que el ADN exterior no está & rsquot & ldquoinsulated & rdquo por lo que se calienta más rápido y ndash comienza a moverse más - & gt coches aceleran más rápido a través del túnel

Como dije, todavía hay mucha incertidumbre sobre cómo funciona, pero hice todo lo posible para averiguar cómo funciona. ¡Y funciona, (por lo general) lo hace!

Así que veamos y rsquos lo hacemos en la práctica. Y lo hacemos mucho, ¡así que practicamos mucho! (Y este es el protocolo que suelo usar, pero los tiempos exactos, etc.dependen de los tipos de células que utilice, volúmenes, tipos de tubos, etc.)

Las células competentes son competentes para absorber el ADN, pero no muy competentes para sobrevivir y, por lo tanto, son realmente "complicadas", por lo que hay que tratarlas con TLC.

Para evitar la congelación-descongelación innecesaria, normalmente se hacen alícuotas pequeñas y de un solo uso y cada tubo tiene la cantidad perfecta para 1 transformación.

Tendrá que descongelarlos al menos una vez, y cuando lo haga, querrá hacerlo & ldquogently & rdquo & ndash en hielo. Las bajas temperaturas también ayudan a mantener el calcio adherido a la membrana donde los queremos (las moléculas no tienen la energía para ir en busca de mejores alternativas).

Una vez que se hayan descongelado, puede agregar el plásmido y revolver suavemente o golpear suavemente (no pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que eso es demasiado fuerte).

Luego se va a un baño para el choque térmico. Colocamos los tubos en un baño de agua caliente a 42 ° C durante 40 s. Mi banco es uno de los lugares más populares del laboratorio porque tiene un baño de agua. Hacemos muchas transformaciones, por lo que en un momento dado hay & rsquos a menudo alguien parado ahí, mirando el reloj y esperando que pasen esos 40 segundos.

Luego regresa directamente al hielo. Ese golpe de calor fue bastante traumático para las bacterias, por lo que debes ayudarlas a recuperarse. Les das algo de comida líquida y esto puede ser LB (alimento básico para bacterias) o un alimento & ldquoricher & rdquo como SOC (esto tiene glucosa para que las células quemen glucosa para obtener energía y dejen esos aminoácidos y lípidos en paz para que puedan ir hacia la producción de proteínas y fijación a la pared)

Es importante destacar que este alimento NO tiene antibióticos. El plásmido que colocas tiene un gen de resistencia a los antibióticos para que puedas seleccionarlo; no todas las células habrán absorbido el plásmido, pero solo las células que lo tengan podrán crecer en presencia del antibiótico. Así que usamos ese antibiótico cuando los cultivamos en platos, pero primero tenemos que darle tiempo a las células para que hagan lo que las hace resistentes.

Además, dado que no tienen que gastar energía luchando por sus vidas con los antibióticos, ¡pueden gastar energía luchando por sus vidas desde todos esos agujeros en sus membranas! Pueden usar este tiempo de recuperación para ayudar a reparar sus membranas.

Entonces, en el paso de CRECIMIENTO agregamos medios sin antibióticos y los dejamos crecer por

30min-1 hora El tiempo que necesitan depende del antibiótico que planee usar. Los antibióticos como la kanamicina y el cloranfenicol inhiben la traducción (producción de proteínas), por lo que las células necesitan un crecimiento más prolongado o de lo contrario no podrán producir las proteínas que necesitan para inactivar los antibióticos. Los antibióticos como la ampicilina, que no detienen la producción de proteínas, no necesitan tanto tiempo para recuperarse. Más aquí: http://bit.ly/2IxPOM8

Durante este tiempo, incluso las células no transformadas pueden crecer, pero mueren una vez que las colocamos en la placa. Una vez que repararon sus membranas y comenzaron a desarrollar su resistencia, las llevamos del crecimiento en suspensión (basado en líquido) al crecimiento en placa y luego esparcimos el líquido (lleno de bacterias) sobre una placa de agar LB que contiene ese antibiótico y el agar es un azúcar que forma un gel lleno de alimento LB enriquecido con antibiótico

Ahora, dado que el alimento LB está enriquecido con antibióticos, solo las células transformadas deberían poder crecer. Y cuando lo hacen, lo hacen copiando todo su ADN (incluido el plásmido que colocaste) y luego dividiéndolo. Así que terminas con muchas células de cada célula transformada original, y estas & ldquofamilies & rdquo aparecerán como globby & ldquodots & rdquo llamadas colonias.

Cuanto mejor sea la "eficiencia de transformación", más colonias verá. This efficiency depends on a lot of things like how competent the cells where, how big the plasmid was, whether the plasmid &ldquostill needed help&rdquo etc.

Sometimes, the plasmids you put in are &ldquopre-made&rdquo and have already grown in bacteria (then been taken out & purified) but other times, they&rsquore things you&rsquove just pasted together (ligation products) or even plasmids with gaps the bacteria needs to fix through homologous recombination (like SLIC products). These are &ldquoharder&rdquo because you have to have the engineering go right AND the transformation go right. So you should expect lower transformation efficiency.

You can isolate the plasmid DNA from these colonies to use and, especially if you&rsquove just cloned it, send it for sequencing to check for &ldquotypos.&rdquo

Note: In addition to this &ldquoartificial competence&rdquo, some bacteria have &ldquonatural competence&rdquo &ndash In nature, some bacteria can take up *linear* pieces of foreign DNA (such as that released by dead, exploded bacteria) through a form of transformation that relies on DNA receptors


Notas

This method was first discovered to increase the rate of bacteriophage infections by the uptake of viral DNA by the cells. [1]

Inoue et al. 1990 published a method to store cells in a competent state (able to take up DNA during transformation) that can greatly increase efficiency when a large number of transformations are being done over time. [2]

Li et al. 2007 constructed a MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) device that greatly increases transformation efficiency with much smaller volumes. [3] [4]

Panja at al. 2008 found that the heat-shock (and a following cold-shock) step released lipids and proteins from the cell membrane and facilitated pore formation that might contribute to the uptake of DNA. Furthermore, repeated cycles of heat and cold shock, up to the third pair, increased transformation efficiency. [5]

Sarkar et al. 2002 found that ethanol removed lipopolysaccharide (LPS, lipid-phosphate membrane molecule with a cell surface O-antigen polysaccharide covalently attached) and lowered transformation efficiencies, suggesting DNA association with LPS molecules may be a key part of calcium chloride heat shock transformation. [6]


Ver el vídeo: Transformación bacteriana: Introduciendo un plásmido en E. coli (Mayo 2022).