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Cálculo del factor de concentración de la muestra (opuesto a la dilución)

Cálculo del factor de concentración de la muestra (opuesto a la dilución)


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Estoy comenzando un proyecto de algas y estoy un poco confundido acerca de algunos detalles en el cálculo de la densidad. Por ejemplo, tomo una muestra de 250 mL y la concentro a 25 mL con un aparato de filtración de arena (factor de 10). Estoy usando una cámara sedgwick-rafter en cuadrícula para enumerar la densidad de las células de algas en una base de células / ml usando esta fórmula de los métodos estándar 10200F: células / ml = [(# organismos contados) * (1000 mm cúb.) / ( área de campo)(profundidad de campo)(# campos contados)].

Una vez que calcule las células / mL, ¿debería DIVIDIR que resulta por mi factor de concentración (10)? Mi instinto es multiplicar, pero ¿no sería apropiado solo si diluyera la muestra?


Su muestra original está más diluida que la muestra que contó. La concentración es menor y, por lo tanto, debe dividir su concentración contada por 10 para obtener la concentración en la muestra original.


Ensayo de Bradford: cálculo de la concentración de proteínas (30 / Jun / 2008)

Me siento un poco tonto al hacer esta pregunta, pero no he tenido mucha suerte al encontrarla en ningún lado, así que aquí va:

Después de lisar las células, verifico mi concentración de proteínas por Bradford usando un lector de microplacas. Añado 200 ul de reactivo de Bradford diluido a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego agrego BSA para completar mis estándares (10 ug / ml-40 ug / ml, concentraciones más bajas o más altas si es necesario). Por último, agrego 1 ul de mis muestras por duplicado a los pocillos. Nuestro lector de placas calcula las concentraciones de las muestras basándose en la curva estándar y el factor de dilución. Mi pregunta es, dado que estoy agregando 1 ul de mi muestra a 200 ul de reactivo de Bradford, ¿mi factor de dilución es 200? Y si agrego 2 ul de muestra en lugar de 1 ul, ¿sería una dilución 100X? No estoy seguro de estar obteniendo las concentraciones de proteínas correctas cuando hago mis Bradfords. Todo es relativo, pero sería bueno saber cuánta proteína estoy cargando realmente en mis geles.

Me siento un poco tonto al hacer esta pregunta, pero no he tenido mucha suerte al encontrarla en ningún lado, así que aquí va:

Después de lisar las células, verifico mi concentración de proteínas por Bradford usando un lector de microplacas. Añado 200 ul de reactivo de Bradford diluido a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego agrego BSA para completar mis estándares (10 ug / ml-40 ug / ml, concentraciones más bajas o más altas si es necesario). Por último, agrego 1 ul de mis muestras por duplicado a los pocillos. Nuestro lector de placas calcula las concentraciones de las muestras basándose en la curva estándar y el factor de dilución. Mi pregunta es, dado que estoy agregando 1 ul de mi muestra a 200 ul de reactivo de Bradford, ¿mi factor de dilución es 200? Y si agrego 2 ul de muestra en lugar de 1 ul, ¿sería una dilución 100X? No estoy seguro de estar obteniendo las concentraciones de proteínas correctas cuando hago mis Bradfords. Todo es relativo, pero sería bueno saber cuánta proteína estoy cargando realmente en mis geles.

no necesita trabajar con un factor de dilución si usa la misma dilución para los estándares BSA, solo necesita la pendiente de la fase lineal de la fila estándar BSA como factor para calcular la proteína de extinción

¿Qué volumen de sus estándares está agregando?

si está agregando 1 ul de cada estándar y está comparando sus muestras con la curva que genera a partir de los estándares, entonces no está diluyendo sus muestras en absoluto.

Para hacer mi curva estándar, agrego 1 ul, 2 ul, 3 ul, 4 ul, etc. de 1 mg / ml de BSA directamente en el pocillo con 200 ul de reactivo Bradford. No lo diluyo primero y luego lo agrego al pozo. Probablemente debería diluir mi BSA en tampón de lisis (& # 33) y agregar volúmenes iguales a cada pocillo, pero ese es otro punto de discusión.

Para hacer mi curva estándar, agrego 1 ul, 2 ul, 3 ul, 4 ul, etc. de 1 mg / ml de BSA directamente en el pocillo con 200 ul de reactivo Bradford. No lo diluyo primero y luego lo agrego al pozo. Probablemente debería diluir mi BSA en tampón de lisis (& # 33) y agregar volúmenes iguales a cada pocillo, pero ese es otro punto de discusión.

Simplemente haga un balance de masa (en lugar de pensar en concentraciones).
Trazar abosrbancia vs ug BSA en estándares. Ajustar ecuación lineal. Usando la absorbancia bruta para cada muestra, resuelva la ecuación para ug BSA dado su valor de absorbancia. Ahora, para obtener la concentración de su muestra, simplemente divida por el volumen de la muestra.

Nuestro lector de microplacas lee la curva estándar como una concentración para calcular las concentraciones de proteínas. Esto no es un problema para mí si hago un Bradford más tradicional. Me pregunto si un factor de dilución se aplica al lector de placas de la forma en que lo estoy usando.

Para hacer mi curva estándar, agrego 1 ul, 2 ul, 3 ul, 4 ul, etc. de 1 mg / ml de BSA directamente en el pocillo con 200 ul de reactivo Bradford. No lo diluyo primero y luego lo agrego al pozo. Probablemente debería diluir mi BSA en tampón de lisis (& # 33) y agregar volúmenes iguales a cada pocillo, pero ese es otro punto de discusión.

Simplemente haga un balance de masa (en lugar de pensar en concentraciones).
Trazar abosrbancia vs ug BSA en estándares. Ajustar ecuación lineal. Usando la absorbancia bruta para cada muestra, resuelva la ecuación para ug BSA dado su valor de absorbancia. Ahora, para obtener la concentración de su muestra, simplemente divida por el volumen de la muestra.

1. Debe utilizar un volumen mínimo de 5 ul tanto para los estándares como para las muestras, ya que 1 ul es muy difícil de pipetear con precisión.
2. Todos los estándares y todas las muestras deben tener el mismo volumen (por ejemplo, 10 ul)
3. Primero pipetee las muestras y los estándares en la placa, luego agregue el reactivo Bradford con una pipeta multicanal.

1ul + 200ul es 201 × dilución, que es aproximadamente 200 ×
2ul + 200ul es 101 × dilución, que es aproximadamente 100 ×

Tengo una pregunta adicional sobre los ensayos de Bradford. El presidente de mi comité insiste en que BSA se une aproximadamente 2 veces más reactivo de Bradford que la mayoría de las otras proteínas y, por lo tanto, usar BSA como su estándar de proteína no le da una cuantificación correcta de una desconocida; de hecho, está calculando las concentraciones de su muestra en aproximadamente la mitad de lo que ellos realmente son. ¿Alguien ha oído hablar de esto? Dice que el estándar debería ser alguna IgG genérica de concentración conocida. Estoy pensando en ejecutar los dos estándares uno al lado del otro y ver las diferencias (si las hay) en OD595.

Se sabe que diferentes proteínas se unen al reactivo de Bradford con diferentes afinidades. El estándar ideal está compuesto por la proteína que está midiendo. Dado que normalmente no es posible, todos los resultados se basarán en una aproximación. Puede evitarlo simplemente expresando sus concentraciones como equivalentes de BSA o calibrando su proteína frente a BSA una vez, y siempre volver a calcularla de acuerdo con la curva de calibración.

la dilución causada por el reactivo de determinación de proteínas (bradford, lowry, biuret, etc.) normalmente no se considera al calcular la concentración de proteínas. Se considera la dilución al preparar la muestra antes de la adición del reactivo. y la mejor práctica es preparar todas las muestras y estándares al mismo volumen para que el reactivo no se diluya de manera diferente para ninguna muestra.

2x la lectura de gammaglobulina con el reactivo de Bradford. biorad tiene una tabla que muestra varias respuestas de proteínas con bradford. Determinamos, utilizando algunos métodos diferentes, que la gammaglobulina era el mejor estándar proteico general, con el bradford, para las proteínas con las que trabajamos. deberías hacer lo mismo con el tuyo.


MathBench & gt Measurement

Así que juntemos todo esto. Nos gustaría contar las bacterias en una muestra en particular, y creemos que debería haber alrededor de 10 millones de células por ml.

Idealmente, por lo tanto, nos gustaría tener 100 bacterias en el plato que contamos. Ese sería un factor de dilución de 100: 10,000,000 o 1: 100,000. Y para darnos un poco de margen de maniobra, deberíamos comenzar al menos 1 dilución antes de eso, por lo que 1: 10,000. Luego haremos tres diluciones más 1:10 para obtener nuestra serie.

En la siguiente tabla, haga clic en el botón correspondiente a la placa que debe usarse para estimar la concentración original de bacterias:

Bastante sencillo, ¿verdad? A continuación, puedes practicar un par de veces más. También incluí algunas situaciones inusuales. las cosas salen mal, por supuesto, y deberías poder reconocerlo. Si cree que la serie de diluciones no es válida, haga clic en & quot; volver a realizar la dilución & quot.


Cálculo del factor de concentración de la muestra (opuesto a la dilución) - Biología

Tome una cucharada de Cheerios y agréguela a una cucharada de leche, revuelva bien, tome una cucharada de esta nueva mezcla y agréguela a una cucharada de leche fresca, revuelva y agregue una cucharada a otra cucharada de leche fresca. leche y & hellip ¡Tienes una DILUCIÓN SERIE de cereales!

En una dilución en serie, realiza una serie de diluciones escalonadas en las que debe diluir por el mismo factor cada vez (por ejemplo, 1: 2 en este ejemplo) de modo que la concentración (cantidad relativa de la cosa a la no-cosa) disminuye exponencialmente. Entonces, cada mezcla tiene un factor de dilución veces menor que la anterior. Entonces, en este caso, donde nuestro factor de dilución es 2, cada nueva mezcla de Cheerio tiene 1/2 más Cheerios por cucharada que la anterior.

Si en lugar de mezclar 1 cucharada con 1 cucharada cada vez que mezcláramos 1 cucharada con 9 cucharadas de leche (una dilución 1:10), nuestros Cheerios se diluirían mucho más rápido. Nosotros tenemos un factor de dilución de 10, por lo que cada nueva cucharada tendría 10 veces menos Cheerios que la anterior.

Las diluciones en serie son algo así como esquemas piramidales con el efecto opuesto y ndash, si comienzas con una cierta cantidad de dinero, se distribuye a más y más personas, pero no puedes dar más dinero del que comenzaste, por lo que la gente termina con cada vez menos. dinero.

Cuando tenemos algo que cambia por un multiplicador constante (como 1/2 o 1/10) lo llamamos crecimiento / decaimiento geométrico o exponencial. Y nos da atajos con los que trabajar mientras nosotros & rsquoll see & hellip

Entonces, ¿cómo funcionan las diluciones en serie y por qué las usamos? Sigues diluyendo lo mismo una y otra vez, pero de manera constante, paso a paso, siendo clave y son útiles para muchas cosas como ayudar con la precisión y crear curvas de nivel estándar, que son una serie de cosas sobre la concentración conocida que te permiten comparar la tuya. a (estaba haciendo esto hoy, de ahí la publicación y hellip) Más sobre estos por qué & rsquos después de discutir el cómo (e I & rsquoll probablemente haga una publicación de seguimiento sobre curvas estándar porque a la gente también le puede resultar útil).

Pero dejemos que & rsquos regrese al cómo por ahora, omitiendo la parte en la que ordeñas la vaca y ndash dice que quieres hacer diluciones 1: 2 de Cheerios, nosotros & rsquoll las llamamos C para abreviar. Así que toma la solución inicial, que es toda C. Y la mezclas con una cantidad igual de leche. p.ej. Si tomó 1 cucharada de C + 1 cucharada de leche, puede obtener 2 cucharadas de una solución al 50% C

Luego, toma esa primera dilución y hace lo mismo con ella, pero ahora que ya comienza con una solución al 50%, cuando la divide a la mitad, obtiene una solución al 25%. Y si haces lo mismo con la solución al 25%, obtendrás una solución al 25/2 = 12,5%, y puedes seguir haciendo esto, cada vez obteniendo una solución la mitad de diluida que la anterior.

Entonces, en el lapso de 5 muestras, puede cubrir un margen del 100% al 6.25%

Si ese & rsquoll no es lo suficientemente grande para usted, puede seguir diluyendo (por ejemplo, 6.25% - & gt 3.125% & hellip) Pero usted & rsquoll solo disminuirá en 1/2 cada vez. Si desea & ldquomove más rápido & rdquo, puede elegir un factor de dilución más alto.

El factor de dilución se refiere a la cantidad por la que se diluye en cada paso. Entonces, en este ejemplo, el factor de dilución fue 2/1 = 2. ¿Qué pasa si en lugar de 2 elige un factor de dilución de 10? Ahora, en el intervalo de 5 muestras, pasa de 100% - & gt 10% - & gt 1% - & gt 0.1% - & gt 0.01%

Entonces, por ejemplo, si comenzaste con 100 cucharadas de X, el quinto tubo tendría 1 cucharada de Cheerios y 99 cucharadas de leche. Pero no llegaste allí mezclando 1 cucharada de Cheerios of X con 99 cucharadas de leche y ahora llegaste paso a paso.

  • 100 C
  • 10 C + 90 leche
  • 10 (10 C + 90 leche) + 90 leche
  • 10 (10 (10 C + 90 leche) + 90 leche)
  • 10 (10 (10 (10 A + 90 leche) + 90 leche)) + 90 leche

Si tuviera que tomar muestras de volúmenes iguales (como cucharadas iguales), cada muestra tendrá 1/10 de las moléculas de B como la anterior - & gt así que si la solución 1 tiene 100 Cheerios, la solución 2 tiene 10, 3 tiene 1 , 4 tiene 0,1? Supongo que puedes cortar un Cheerio, pero ¿cómo tienes 0,1 moléculas? Bueno, usualmente tratamos con waayyy más de 0.1 moléculas porque 1 usualmente tiene mucho más de 100 moléculas.

De hecho, las moléculas son tan pequeñas y abundantes que a menudo hablamos de sus concentraciones en & ldquomoles & rdquo y los moles son 6.02 & veces10 ^ 23 de algo (cualquier cosa y ndash como cómo se puede usar una docena para donas o bagels). La molaridad (M) es una unidad de concentración correspondiente a 1 mol por L.Entonces, si nuestra solución de C es 1M, eso significaría que 1L tiene 6.02 & times10 ^ 23 Cheerios y 100mL tiene 6.02 & times10 ^ 22 Cheerios, entonces 4 todavía tendrá mucho! http://bit.ly/2r4RnrX

Incluso cuando hablamos en términos de milimolar (mM) tienes 1/1000 de mol / L, micromolar (& muM) todavía tienes 1 / 1000,000 y nanomolar (nM) todavía tiene 1 / 1000,000,000 mol / L que es 6.02 & times10 ^ 13 Cheerios por L que todavía es mucho! (¡Definitivamente más que físicamente posible, pero eso & rsquos nunca detuvo al torpe bioquímico!)

Supongamos que desea conocer la concentración de Cheerios sin tener que contarlos. Las diluciones en serie siguen la misma dilución & ldquorule & rdquo que las diluciones & ldquonormal & rdquo - & gt M1V1 = M2V2

La molaridad inicial (o cualquier unidad de concentración que use y ndash podría ser Cheerios por cucharada, solo tiene que ser la misma en ambos lados de la ecuación) multiplicada por el volumen inicial es igual a la molaridad final multiplicada por el volumen final. A veces se escribe C1V1 = C1V2 para reflejar el hecho de que no tiene que ser molaridad, pero lo aprendí de esta manera. Mucho más sobre esto aquí: http://bit.ly/2yogj1i

Ahora ni siquiera tenemos que preocuparnos por calcular ninguna de las concentraciones de las diluciones anteriores para encontrar la concentración de una posterior. Solo necesitamos saber la concentración inicial, el factor de dilución y el número de diluciones.

Supongamos que desea graficar el promedio de Cheerios por cucharada de cada una de las mezclas. Si intentara graficar eso en una escala lineal & ldquonormal & rdquo (donde las marcas de graduación están espaciadas uniformemente por suma (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, & hellip). (0,0) y luego ese 100% a la derecha. Si desea obtener los valores en una forma mejor visible, puede trazarlos en una escala logarítmica. Las escalas logarítmicas usan marcas de graduación que están espaciadas según exponentes a los que quieres elevar algo. Por lo tanto, si tienes un DF de 2, puedes usar una escala log2 para obtener una línea y un amplificador con un DF de 10. Más información sobre exponentes y registros de amp: http://bit.ly/2TCM2UE

Normalmente, en lugar de diluir Cheerios, yo & rsquom diluyo cosas como ARN o proteínas y en lugar de llenarlas con una cuchara, las pipeteo. Hoy, además de las diluciones en serie que hice para mis cosas que implican diluir cosas que son "invisibles" para nosotros, hice una dilución en serie de un tinte para mostrárselo.

Dependiendo de los volúmenes que desee, es útil hacerlo en tubos de tiras (como tubos de tiras de PCR) o bloques de pozos profundos, etc. y ndash algo donde los soportes de líquido estén conectados para que no los mezcle y no tenga que preocuparse por la numeración toneladas de tubos, etc.

Empiezo pipeteando el diluyente (agua en este caso) en todos los tubos excepto el primero que guardo para el inicial que no necesita diluirse. Y luego pego el de inicio en el primer tubo y el segundo tubo. Por lo general, lo que hago es transferir y luego pipetear arriba-abajo-arriba-abajo-arriba-abajo y hellip (generalmente lo hago 5 veces) terminando en & ldquoup & rdquo y luego transferir al siguiente tubo para bajar

Cuando haga diluciones, debe recordar que debe sacar parte de su & ldquoV2 & rdquo cada vez y ndash, así que si hace 10uL + 10uL = 20uL y luego toma 10uL de eso para el siguiente, solo le quedan 10uL de ese y no 20. . Entonces, si necesita 20, debería estar haciendo 20 + 20 (en realidad, si necesita 20, debería estar haciendo 25 + 25 o algo así porque siempre es bueno tener un poco más para tener en cuenta la evaporación, el tubo / pipeta se pega a). ness, etc.)

Y hablando de esa pegajosidad, otra razón para hacer diluciones en serie es que ayudan con precisión. ¡No queremos una de esas cajas de Cheerios que son un 10% más GRATIS!

Como mencioné en una publicación anterior, cada instrumento y herramienta de medición de amplificador que usa tiene un poco de error (por ejemplo, si pipetea 1 ml, podría De Verdad ser 1,01 ml o 0,99 ml en lugar de 1,00 ml). Y cuanto más pequeño sea el valor que desee medir, mayor será el error que pueda producir un error pequeño. (piense en una gota en una piscina frente a una gota en una mariquita). http://bit.ly/33hkCd8

Y si necesita pipetear una solución concentrada, 1 gota contiene mucho impacto. De modo que esa pequeña gota de líquido pegada al exterior de la pipeta contiene muchas moléculas que usted no tiene en cuenta. Así que es mejor pipetear volúmenes más grandes de cosas más diluidas.

Pero a veces es necesario preparar una solución muy diluida. Supongamos que quiere hacer una dilución de un millón de algo (por ejemplo, tiene algo que & rsquos 1M y quiere llevarlo a 1uM). Incluso si pipeteó solo 1 ul, debe diluirlo en un litro entero de agua para obtener 1 uM. En lugar de hacerlo de esa manera, puede hacerlo paso a paso.

Otro momento en el que las diluciones en serie son excelentes es para hacer "curvas estándar". Aquí es donde se toman soluciones de concentración conocida y se hace un gráfico de ellas y luego se compara una muestra de concentración desconocida con el gráfico de concentraciones conocidas para ver dónde cae. la línea.


Cálculo del factor de concentración de la muestra (opuesto a la dilución) - Biología

Los hemacitómetros se desarrollaron para contar células sanguíneas, pero también se pueden usar para contar espermatozoides. Un hemacitómetro tiene dos cámaras y cada cámara tiene una rejilla microscópica grabada en la superficie del vidrio. Las cámaras están superpuestas con un cubreobjetos de vidrio que descansa sobre pilares exactamente a 0,1 mm por encima del suelo de la cámara. Por tanto, el volumen de fluido sobre cada cuadrado de la cuadrícula se conoce con precisión.

Procedimiento

El semen debe matarse para evitar el movimiento y diluirse antes de cargarlo en el hemacitómetro. Esto se puede hacer diluyendo el semen en un tampón que contenga una pequeña cantidad de formaldehído. El factor de dilución debe registrarse para permitir el cálculo de la concentración. Cuando hay 20-25 células por cuadrado grande (ver más abajo), la muestra está en la dilución adecuada.

Carga del hemacitómetro: La punta de la pipeta se coloca en la ranura en forma de V del hemacitómetro para cargar la muestra en la cámara (aproximadamente 15 microlitros). La acción capilar atraerá el líquido hacia la cámara. Es importante no sobrecargar la cámara, ya que al hacerlo se obtendrá un recuento inexacto. Lo mismo es cierto si el cubreobjetos se mueve después de cargar la muestra.

Se deja que la muestra se asiente durante 2 o 3 minutos para que las células dejen de desplazarse por la cámara y la mayoría estén en el mismo plano de enfoque. Es importante no permitir que la muestra se asiente demasiado tiempo o se secará, concentrando las células sobre la rejilla. Para evitar que se seque, el hemacitómetro se puede colocar sobre pajitas dentro de una placa de Petri que contenga un papel de filtro humedecido.

Contando: La cuadrícula completa de un hemacitómetro contiene nueve cuadrados, cada uno de los cuales tiene un cuadrado de 1 mm (consulte la figura siguiente). El área central de conteo del hemacitómetro (como se llamará aquí) contiene 25 cuadrados grandes y cada cuadrado grande tiene 16 cuadrados más pequeños. Al contar, cuente solo las celdas en las líneas de dos lados del cuadrado grande para evitar contar las celdas dos veces.

Se pueden contar los 25 cuadrados grandes, o se puede usar un patrón de conteo con menos cuadrados como los que se muestran a continuación. Es importante distribuir las áreas de recuento de manera no sesgada, ya que las células pueden estar más concentradas en un lado de la cámara. Si cuenta solo 5 de los 25 cuadrados grandes, multiplique ese valor por 5 para obtener el número de celdas por área central de conteo.

Se deben contar al menos dos cámaras, incluidas al menos 100 células dentro de cada área central de conteo de cada cámara. Para una mayor precisión, se pueden contar espermatozoides adicionales y usar el promedio para calcular la concentración celular.

Calculando la concentración

Cada uno de los nueve cuadrados de la cuadrícula, incluida el área central de conteo de 25 cuadrados grandes, tiene un área de 1 mm cuadrado y el cubreobjetos descansa 0,1 mm por encima del suelo de la cámara. Por tanto, el volumen sobre el área central de recuento es de 0,1 mm 3 o 0,1 microlitro. Por tanto, puede multiplicar el número medio de espermatozoides en cada área central de recuento por 10.000 para obtener el número de espermatozoides por ml de muestra diluida.


Unidades

Es fundamental que informe las unidades para concentraciones, volúmenes y cantidades, y cuando haga cálculos para diluciones no debe mezclar las unidades. Por ejemplo, no funciona escribir

V1 (160 militros) & # 149C1 (160 miligramos / litro = V2 (desconocido) & # 149C2 (deseado-3 gramos / litro)

Sin embargo, debido a que la concentración representa una relación proporcional, puede seleccionar entre una variedad de unidades. Por ejemplo, 1 miligramo / mililitro es lo mismo que 1 gramo / litro, 1 microgramo / microlitro o 1 nanogramo / nanolitro. También es lo mismo que 1000 miligramos / litro, pero ¿por qué lo escribiríamos de esa manera?


Cálculo del factor de concentración de la muestra (opuesto a la dilución) - Biología

Introducción / Justificación. Las diluciones de reactivos son necesarias a diario en el trabajo de laboratorio bioquímico o inmunológico. Es importante saber diseñar y realizar diluciones que sean precisas y que satisfagan las necesidades de la situación.

Ejercicio de dilución única. Se le proporciona una solución madre concentrada de un soluto amarillo (p-nitrofenol), con la etiqueta "NP Stock". Haga una dilución que reduzca la concentración 37 veces, que es una dilución 1/37.

    ¿Qué necesita saber? Antes de hacer su dilución, haga una lista de las cosas que necesita saber y compruébela con sus instructores. (Suponga que está en un laboratorio de investigación y necesita hacer una dilución de un reactivo concentrado almacenado en el refrigerador. ¿Qué necesita saber para hacer una dilución que satisfaga las necesidades de la situación?)

  1. Inspeccione su placa de 96 pocillos. Enjuague la parte superior e inferior si está sucio. Tenga cuidado de no rayar la parte inferior con una toalla de papel: ¡los rayones aumentan la absorbancia! Eche el agua de enjuague vigorosamente en el fregadero (pídale a un instructor que lo demuestre) si se hace correctamente, esto no deja un volumen significativo en los pozos.
  2. Seleccione una de sus cuatro diluciones 1/37. En la placa de 96 pocillos, realice tres diluciones en serie como se indica a continuación en la columna 3 (primer alumno) o 9 (segundo alumno). En los pocillos A, B, C poner 0,1 ml de diluyente. Agregue 0.1 ml de la dilución 1/37 al pocillo A y mezcle pipeteando adentro y afuera. Retire 0,1 ml del pocillo A y agréguelo a la mezcla del pocillo B. De manera similar, transfiera 0,1 ml de B a C, mezclando. Retire 0,1 ml del pocillo C y deséchelo para que los cuatro pocillos contengan el mismo volumen total.

  1. ¿Importa si descarta 0,1 ml del pocillo C después de mezclar? ¿Por qué? Después de todo, la concentración permanece igual de cualquier manera.
  2. ¿Es visible la luz de 405 nanómetros? ¿De qué color es? ¿Por qué 405 nm es adecuado para medir la absorbancia de NP (que es amarillo)?
  3. A partir de una lectura, determine la media, la DE y el SEM para las 4 diluciones 1/37. ¿Es esta media significativamente diferente a la de su compañero de laboratorio?
  4. Escriba la media, SD, SEM del paso anterior en la pizarra. Cuando al menos 4 estudiantes hayan escrito sus resultados en la pizarra, busque el más alto y el más bajo. ¿Son significativamente diferentes? Si es así, ¿cuáles son las posibles explicaciones de la discrepancia?
  5. A partir de una lectura, determine la media, la DE y el SEM para las cuatro réplicas de la última (fila C) de sus diluciones en serie. ¿Cómo se compara la SD para esto con la SD para sus ocho diluciones 1/37? como interpretas esto?
  6. ¿La media de la última fila de sus diluciones en serie es significativamente diferente de la de su compañero de laboratorio?
  7. ¿Qué tan cerca está la media de lo que debería ser, según las diluciones que realizó? ¿Cómo interpretas cualquier discrepancia?
  8. A partir de sus dos lecturas, determine la media, SD y SEM para dos pares de lecturas de los mismos pozos de sus diluciones en serie en las filas C. Por ejemplo (para el primer estudiante)
  9. ¿Qué aporta más variación a sus lecturas: el lector de placas de 96 pocillos o el pipeteo?
  10. ¿Cómo se compara la precisión de sus diluciones en serie con la precisión de la que es capaz la pipeta, según el fabricante?
  11. ¿Cómo puede determinar más fácilmente la precisión de las entregas de un P200 o un P1000?

III. Concentración de proteínas por absorbancia a 280 nm.

Los aminoácidos aromáticos, en particular el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, absorben la luz al máximo a 280 nanómetros. Las bases de ADN y ARN absorben al máximo a 260 nanómetros. Una solución de proteína que no esté contaminada con ácidos nucleicos tendrá una relación de absorbancia, A260 / A280, de menos de 0,6. Un valor sustancialmente mayor concuerda con la contaminación por ácido nucleico. Si no está contaminada, la concentración de proteína en solución acuosa se puede determinar a partir de la absorbancia a 280 nanómetros, siempre que se conozca el coeficiente de extinción para la proteína en cuestión, ya que las cantidades de aminoácidos aromáticos por miligramo de proteína varían entre diferentes proteínas.


Experimentos de recuperación y aumento

En los experimentos de aumento y recuperación, el objetivo principal es determinar si la detección del analito se ve afectada por una diferencia entre el diluyente / tampón del ensayo utilizado para preparar la curva estándar de un usuario final y la matriz de la muestra. La matriz de la muestra puede ser una muestra biológica pura (sin diluir) o una muestra biológica diluida en diluyente de ensayo. Esto se logra agregando una cantidad conocida del estándar de proteína recombinante (pico) en la matriz de la muestra de prueba natural y observando su respuesta (recuperación) en relación con la adición de la misma cantidad conocida al diluyente del ensayo. La respuesta (la concentración resultante) se interpola a partir de la curva estándar y la DO resultante de la adición de una cantidad conocida de estándar de proteína recombinante. Después de ejecutar los dos conjuntos de respuestas y calcular la concentración a partir de la curva estándar, un usuario final puede calcular el porcentaje de recuperación para identificar la desviación porcentual del valor de la muestra con picos observados del valor de la muestra sin picos observado en relación con la cantidad real conocida para determinar la compatibilidad del diluyente del ensayo y la matriz de la muestra. Un usuario final desea lograr una respuesta idéntica para una determinada cantidad de analito de interés tanto en la matriz de la muestra como en el diluyente / tampón del ensayo. En otras palabras, las matrices de muestras totalmente compatibles deben obtener una recuperación del 100% porque la recuperación observada para el pico es idéntica a la recuperación obtenida tanto en el diluyente del ensayo como en la matriz de la muestra. El% de recuperación puede desviarse hasta un 20%. Si el valor recuperado difiere significativamente de la cantidad esperada (debido a la adición de una cantidad conocida), entonces esta desviación del 100% de recuperación puede sugerir el grado de incompatibilidad / discrepancia del diluyente del ensayo con la matriz de la muestra, en cuyo caso se deben hacer ajustes para minimizar la desviación. En casos de recuperaciones de muestra muy deficientes, este ajuste puede sugerir el uso de un diluyente de ensayo diferente cuya composición se asemeje más a la matriz de muestra final.


Abstracto

La titulación de microorganismos en muestras infecciosas o ambientales es una piedra angular de la microbiología cuantitativa. Se presenta un método simple para estimar los recuentos microbianos obtenidos con la técnica de dilución en serie para microorganismos que pueden crecer en medios bacteriológicos y convertirse en una colonia. El número (concentración) de organismos microbianos viables se estima a partir de una única placa de dilución (ensayo) sin necesidad de repetir las placas. Nuestro método selecciona la mejor placa de agar con la que estimar los recuentos microbianos y tiene en cuenta el tamaño de la colonia y el área de la placa que contribuyen a la probabilidad de contar mal el número de colonias en una placa. La estimación del recuento óptimo proporcionado por nuestro método se puede utilizar para limitar la búsqueda de la mejor placa de dilución (óptima) y ahorrar tiempo. Las entradas requeridas son el tamaño de la placa, el tamaño de la colonia microbiana y los factores de dilución en serie. El enfoque propuesto muestra una precisión relativa dentro de ± 0,1 log10 a partir de datos producidos por simulaciones por computadora. El método mantiene esta precisión incluso en presencia de errores de dilución de hasta el 10% (tanto para la alícuota como para los volúmenes de diluyente), recuentos microbianos entre 10 4 y 10 12 unidades formadoras de colonias, proporciones de dilución de 2 a 100 y tamaño de placa. a proporciones de tamaño de colonia entre 6.25 y 200.


Pico / Recuperación

Spike / Recovery se utiliza a menudo para determinar las diferencias en el porcentaje de recuperación entre las matrices de muestra y el diluyente estándar. La pregunta postulada pregunta si el porcentaje de recuperación obtenido del diluyente estándar es idéntico al porcentaje de recuperación obtenido de la matriz de muestra natural proporcionará un porcentaje de recuperación idéntico. Los picos / recuperaciones se llevan a cabo agregando una cantidad conocida de analito estándar dentro de la curva estándar a la matriz de prueba de muestra y al diluyente estándar previstos. Después de analizar ambas muestras y obtener las concentraciones, calcule el porcentaje de recuperación.

Muestra Concentración de pico, ng / mL % Recuperación Dilución mínima recomendada
Suero humano extraído 2 102 Limpio
1 83
0.5 124
Plasma de EDTA humano extraído 2 101 Limpio
1 90
0.5 112.2
Suero de rata extraído 1 89.7 Limpio
0.5 99.6
0.25 112.4
Suero de ratón extraído 1 90.9 1:2
0.5 105.8
0.25 115.6
Suero porcino extraído 3 102.8 1:2
0.6 107.8
0.12 112.5
Saliva humana extraída 5 83.3 1:2
2.5 98.7
1.25 108.4
Plátano extraído 5 100.9 1:2
2.5 115.7
1.25 87.6
Ciruela extraída 5 100.1 1:2
2.5 108.0
1.25 96.4

Tabla 3: Se añadió melatonina purificada a tres concentraciones en la dilución mínima recomendada de matrices de humanos, ratas, ratones, porcinos y frutas. El fondo de la matriz se restó de los valores enriquecidos y el porcentaje de recuperación promedio para cada matriz a la dilución mínima requerida se presenta a continuación. Estos resultados muestran que las matrices probadas a la dilución mínima recomendada no tienen una interferencia obvia con el ensayo ELISA de melatonina (número de catálogo ENZ-KIT150).


Las matrices de muestra ideales deben obtener una recuperación del 100%. Sin embargo, también son aceptables desviaciones del 20% o menos. El porcentaje de recuperación dentro de estos rangos sugiere una mayor confianza en la compatibilidad de ELISA con la muestra propuesta. Las recuperaciones que superan este umbral implican diferencias potencialmente significativas entre la matriz de muestra natural y el diluyente estándar. Un posible ajuste para mejorar la recuperación es encontrar diluyentes alternativos que se alineen más estrechamente con la matriz de muestra propuesta. Alternativamente, la introducción de diferentes proporciones de diluyente de muestra en la matriz de muestra también puede mostrar mejoras en la recuperación.


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Ver el vídeo: Dilution Problems, Chemistry, Molarity u0026 Concentration Examples, Formula u0026 Equations (Junio 2022).


Comentarios:

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