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¿Cómo encuentran las proteínas de membrana sus ubicaciones objetivo?

¿Cómo encuentran las proteínas de membrana sus ubicaciones objetivo?


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La pregunta podría plantearse para cualquier tipo de proteínas "unidas", pero me gustaría restringirla a las proteínas de membrana.

Suponiendo que las proteínas de membrana (o sus partes principales) no se construyen (o no) en el lugar pero a cierta distancia de la membrana, me pregunto por qué mecanismos viajan desde su sitio de generación hasta su destino final dentro de la membrana (interna o externa).

Las proteínas que se distribuyen de manera más o menos uniforme (o aleatoria) sobre la membrana no plantean un gran problema conceptual: podrían haber desaparecido. por difusión, posiblemente de muchos sitios de generación, distribuidos aproximadamente de manera uniforme (o aleatoria) dentro de la celda.

Pero, ¿qué pasa con las distribuciones desiguales, donde algunas proteínas están empaquetadas de manera más densa y no aleatoria (significativas y funcionales) en algunos sitios de la membrana que en otros, p. Ej.

  • receptores en densidades postsinápticas

  • N / A+ canales en los sitios de inicio del potencial de acción como el montículo del axón o el segmento inicial del axón

  • N / A+ canales en los nodos de Ranvier?

¿Por qué mecanismos (fuerzas, señales o estructuras) estas proteínas conducen a sus objetivos?

Quizás depende, y existen diferentes mecanismos. Estos se me ocurrieron (al contemplar los primeros principios):

  • distribución desigual de los sitios de generación dentro de la celda (¿por qué?)

  • distribución desigual de los orígenes de las señales de atracción dentro de la membrana (¿debido a qué?)

  • algunas fuerzas o señales "auto-atractivas" (que conducen a la acumulación por retroalimentación positiva)

  • microtúbulos

¿Qué mecanismo es, posiblemente, predominante?


Preguntas relacionadas:

  • Ciclo de vida de las proteínas

  • Vías de los canales iónicos activados por ligandos

  • Distribución de sinapsis de neuronas CA1

  • Distribución de canales iónicos que generan picos dendríticos en el árbol dendrítico

  • Mapas visuales de la membrana neuronal

  • Distribución de bombas de sodio-potasio


Esta es una gran pregunta. Una respuesta completa estaría más allá del alcance de una respuesta en un foro como este. Resumiré lo mejor que pueda aquí, pero si está realmente interesado en esto, debería mirar algunos de los trabajos de Randy Schekman y Tom Rapoport, quienes han hecho un gran trabajo pionero en este campo y tienen artículos de más de dos hace décadas en sus sitios web de laboratorio. Hablaré sobre proteínas de membrana en general, pero no estoy seguro de cuál es el estado del campo para los canales de Na + específicamente, por lo que no puedo comentar demasiado sobre ese caso en particular. Muchos de los detalles de los procesos que mencionaré siguen siendo áreas de investigación activa, por lo que trataré de ceñirme principalmente a lo que se ha caracterizado bien (según mi leal saber y entender).

Para reafirmar el problema, las proteínas generalmente se sintetizan en la luz del retículo endoplásmico, que es un ambiente acuoso similar al citosol en muchas (pero no todas) formas. Sin embargo, las proteínas de membrana, que no son estables en ambientes acuosos, deben:

1) Encuentre un camino desde el lumen ER hacia una membrana.
2) Pasar de la sala de emergencias a la membrana correcta para que puedan realizar su función celular.

Comenzaremos con el paso 1, pero la clave para ambos es un aspecto crítico pero a menudo subestimado de la biología de las proteínas llamado péptido señal. El péptido señal es simplemente una secuencia N-terminal de aminoácidos que precede a lo que normalmente pensaríamos como el comienzo de una proteína madura. Es relativamente corto, por lo general solo tiene ~ 30 aminoácidos de longitud. Una proteasa escinde la proteína madura una vez que la proteína está plegada y en la membrana. Hasta ese momento, el péptido señal sirve como un marcador molecular que indica hacia dónde debe dirigirse la proteína naciente y cómo debe manejarse. No es sorprendente que haya muchos péptidos señal diferentes que cumplen funciones múltiples y no solo se utilizan para proteínas de membrana.

Entonces, digamos que estamos en la luz del RE y tenemos algo de ARNm que codifica una proteína de membrana que está destinada a la membrana plasmática. Los primeros aminoácidos que emergerán del ribosoma es la secuencia señal, en este caso una secuencia señal específica que indica que se trata de una proteína de la membrana plasmática. Una vez que la secuencia señal emerge del ribosoma, es reconocida por un complejo de ribonucleoproteína (es decir, un complejo de ARN y proteína) llamado partícula de reconocimiento de señal. Una vez que el SRP se une al péptido señal, la traducción se detiene y todo el complejo se mueve hacia la membrana del RE, donde forma un complejo con otro complejo proteico grande llamado translocón. No puedo entrar en las complejidades de estos complejos y sus funciones solo en esta respuesta, pero la descripción simple es que el translocón contiene una ATPasa que puede insertar la proteína de la membrana en la membrana del ER a medida que se traduce, con la orientación correcta. La hidrólisis de ATP proporciona energía para mover la cadena polipeptídica emergente hacia la membrana hidrófoba, donde las chaperonas la ayudan a plegarse. Este proceso está impulsado en parte por el reconocimiento de las regiones transmembrana hidrófobas de las proteínas por el translocón. También puede mover proteínas citosólicas solubles a través de la membrana a través de un mecanismo similar.

Ahora que la proteína ha sido translocada, una peptidasa escindirá la secuencia señal de la proteína. A partir de aquí, las señales de clasificación se harán cargo. Generalmente, estos son motivos de secuencia simple en el primer dominio transmembrana que actúan de manera similar a una secuencia señal, pero no se escinden. Sin embargo, las señales de clasificación también pueden ser tramos de péptido a lo largo de la proteína, en algunos casos.

Estos motivos de secuencia serán reconocidos por la maquinaria de tráfico celular. Sin entrar en demasiados detalles, las proteínas se reunirán en vesículas y se transportarán a otros orgánulos. Por lo general, la primera parada para las proteínas es el aparato de Golgi, que es típicamente donde tienen lugar muchas modificaciones postraduccionales, como la glicosilación. Soy bioquímico y no biólogo celular, por lo que no soy el más calificado para entrar en los detalles del tráfico subcelular. Baste decir que una vez que la proteína termine de procesarse en el golgi, se trasladará a otros orgánulos, como la membrana plasmática, utilizando el transporte de vesículas como antes. Según tengo entendido, la proteína se clasificará en las vesículas adecuadas en función de sus señales de clasificación, así como de otros marcadores (en algunos casos, ciertas modificaciones postraduccionales de ciertas proteínas pueden influir en su tráfico). Las vesículas reconocen la membrana de destino adecuada en parte por la composición de lípidos de esa membrana. Por ejemplo, los fosfoinosítidos tienen una gran influencia en el tráfico de membranas y muchas membranas se pueden diferenciar por su firma de fosfoinosítidos.

De todos modos, esa es una descripción general muy amplia de la respuesta a su pregunta. Lamento no poder comentar demasiado sobre las complejidades del tráfico celular, no tengo la experiencia para revisar esa literatura lo suficientemente rápido como para responder a su pregunta en un período de tiempo razonable. Espero que esto te ayude a orientarte en la dirección correcta, ¡y buena suerte!


¿Es el transporte activo una respuesta? Con péptidos especiales de señalización e interacción dentro de la proteína, las proteínas pueden dirigirse a diferentes sublocaciones. Si está interesado en cómo se acumulan los canales de Na + en el AIS, lea, por ejemplo, Gasser et al. 2012, es un artículo muy agradable que muestra que el motivo de unión a anquirina es suficiente para agrupar los canales de Na + en el AIS.


Abstracto

La identificación de nuevos objetivos farmacológicos es uno de los principales desafíos de la proteómica. Los métodos computacionales desarrollados durante la última década han mejorado el proceso de diseño de fármacos en términos de tiempo y calidad. La tarea principal es el diseño de compuestos selectivos, que se unen a objetivos más específicamente, dependiendo del modo de acción deseado del fármaco en particular. Esto hace necesario crear compuestos, que exhiban sus funciones en una sola proteína para excluir reactividad cruzada no deseada o para utilizar el efecto ventajoso de fármacos menos selectivos que se dirigen a numerosas proteínas y por lo tanto exhiben sus funciones en clases de proteínas completas. Los aspectos principales en la asignación de interacciones entre ligandos y objetivos putativos implican la composición de aminoácidos del sitio de unión, la conservación evolutiva y la similitud en la secuencia y estructura de los objetivos conocidos. Las similitudes o diferencias dentro de las familias de proteínas clasificadas pueden ser la clave de su función y dar las primeras pistas para el diseño funcional de un fármaco. De este modo, la clasificación basada en el sitio de unión supera en número a las clasificaciones basadas en la secuencia, ya que también se pueden encontrar sitios de unión similares en proteínas más distantes. Las proteínas de membrana son "dianas difíciles", debido a sus características fisicoquímicas especiales y a la falta general de información estructural. A continuación, describimos los avances recientes en los métodos de modelado dedicados a las proteínas de membrana.

Se están desarrollando diferentes descriptores de similitud entre compuestos y la similitud entre sitios de unión y aclaran aspectos importantes como la dinámica o la entropía. La importancia del diseño computacional de fármacos es indiscutible. Sin embargo, el proceso de diseño se complica por la complejidad creciente, lo que subraya la importancia de un conocimiento preciso sobre la (s) clase (s) objetivo (s) a las que se dirige y, en particular, sus sitios vinculantes. Un objetivo principal al considerar los temas nombrados es predecir los posibles efectos secundarios y las funciones errantes (efectos fuera del objetivo) de nuevos fármacos, lo que requiere una visión holística (biología de sistemas) de las relaciones fármaco-objetivo-vía. A continuación, ofrecemos un breve resumen sobre la discusión reciente sobre las interacciones fármaco-objetivo con énfasis en las proteínas de membrana.


Contenido

Las proteínas de membrana realizan una variedad de funciones vitales para la supervivencia de los organismos: [2]

    las proteínas transmiten señales entre los entornos internos y externos de la célula. mover moléculas e iones a través de la membrana. Se pueden clasificar de acuerdo con la base de datos de clasificación de transportadores.
  • Las enzimas de membrana pueden tener muchas actividades, como oxidorreductasa, transferasa o hidrolasa. [3] permiten que las células se identifiquen entre sí e interactúen. Por ejemplo, proteínas involucradas en la respuesta inmune.

La localización de proteínas en membranas se puede predecir de forma fiable utilizando análisis de hidrofobicidad de secuencias de proteínas, es decir, la localización de secuencias de aminoácidos hidrófobos.

Proteínas integrales de membrana Editar

Las proteínas integrales de la membrana están unidas permanentemente a la membrana. Dichas proteínas pueden separarse de las membranas biológicas solo usando detergentes, disolventes no polares o, a veces, agentes desnaturalizantes. Un ejemplo de este tipo de proteína que aún no se ha caracterizado funcionalmente es SMIM23. Se pueden clasificar según su relación con la bicapa:

    son proteínas transmembrana que atraviesan la membrana más de una vez. Estas proteínas pueden tener una topología transmembrana diferente. [4] [5] Estas proteínas tienen una de dos arquitecturas estructurales:
      proteínas, que están presentes en todos los tipos de membranas biológicas proteínas, que se encuentran solo en las membranas externas de bacterias Gram-negativas y en las membranas externas de mitocondrias y cloroplastos. [6]

    Proteínas de la membrana periférica Editar

    Las proteínas de la membrana periférica se unen temporalmente a la bicapa lipídica oa proteínas integrales mediante una combinación de interacciones hidrófobas, electrostáticas y otras interacciones no covalentes. Las proteínas periféricas se disocian después del tratamiento con un reactivo polar, como una solución con un pH elevado o altas concentraciones de sal.

    Las proteínas integrales y periféricas pueden modificarse postraduccionalmente, con adición de ácidos grasos, diacilglicerol [8] o cadenas de prenilo, o GPI (glicosilfosfatidilinositol), que puede estar anclado en la bicapa lipídica.

    Toxinas polipeptídicas Editar

    Las toxinas polipeptídicas y muchos péptidos antibacterianos, como colicinas o hemolisinas, y ciertas proteínas involucradas en la apoptosis, a veces se consideran una categoría separada. Estas proteínas son solubles en agua, pero pueden agregarse y asociarse irreversiblemente con la bicapa lipídica y asociarse a la membrana de manera reversible o irreversible.

    Son comunes las proteínas de membrana, como las proteínas globulares solubles, las proteínas fibrosas y las proteínas desordenadas. [9] Se estima que del 20 al 30% de todos los genes en la mayoría de los genomas codifican proteínas de membrana. [10] [11] Por ejemplo, alrededor de 1000 de los

    4200 proteínas de E. coli se cree que son proteínas de membrana, 600 de las cuales se ha verificado experimentalmente que residen en la membrana. [12] En los seres humanos, el pensamiento actual sugiere que el 30% del genoma codifica proteínas de membrana. [13]

    Las proteínas de membrana son el objetivo de más del 50% de todos los medicamentos modernos. [1] Entre las enfermedades humanas en las que se han implicado las proteínas de membrana se encuentran las enfermedades cardíacas, el Alzheimer y la fibrosis quística. [13]

    Aunque las proteínas de membrana juegan un papel importante en todos los organismos, su purificación ha sido históricamente, y sigue siendo, un gran desafío para los científicos de proteínas. En 2008, estaban disponibles 150 estructuras únicas de proteínas de membrana, [14] y para 2019 solo se habían aclarado sus estructuras a 50 proteínas de membrana humana. [13] En contraste, aproximadamente el 25% de todas las proteínas son proteínas de membrana. [15] Sus superficies hidrófobas dificultan la caracterización estructural y especialmente funcional. [13] [16] Se pueden usar detergentes para hacer que las proteínas de la membrana sean solubles en agua, pero también pueden alterar la estructura y función de las proteínas. [13] Hacer que las proteínas de membrana sean solubles en agua también se puede lograr mediante la ingeniería de la secuencia de la proteína, reemplazando los aminoácidos hidrófobos seleccionados por otros hidrófilos, teniendo mucho cuidado de mantener la estructura secundaria mientras se revisa la carga general. [13]

    La cromatografía de afinidad es una de las mejores soluciones para la purificación de proteínas de membrana. La actividad de las proteínas de membrana disminuye muy rápidamente en contraste con otras proteínas. Por tanto, la cromatografía de afinidad proporciona una purificación rápida y específica de las proteínas de membrana. La etiqueta de polihistidina es una etiqueta de uso común para la purificación de proteínas de membrana, [17] y la etiqueta alternativa rho1D4 también se ha utilizado con éxito. [18] [19]


    Orientación de proteínas

    La selección de proteínas se refiere a los métodos que utilizan las células para llevar las proteínas a la ubicación adecuada después de la síntesis. Las proteínas juegan un papel importante en la mayoría de los procesos celulares, pero deben ubicarse adecuadamente para cumplir sus funciones. Saber cómo se dirigen las proteínas recién sintetizadas dentro de las células es esencial para comprender la función de las proteínas.

    Las proteínas se sintetizan en el citosol o en el retículo endoplásmico . Cuando se sintetiza en el citosol de forma gratuita ribosomas , la mayoría de las proteínas se difunden libremente hasta que se unen a un determinado sustrato o ensamblar en un complejo más grande. La difusión de proteínas en el citosol suele ser rápida, por lo que una proteína no unida es capaz de difundirse a través de la célula en solo unos segundos.

    Una forma en que las proteínas citosólicas se dirigen dentro de las células es mediante la formación de grandes conjuntos macromoleculares. Muchas proteínas pueden existir como monómeros , que se difunden libremente a través del citoplasma , o como polímeros , que forman estructuras a gran escala que se distribuyen dinámicamente a distintas ubicaciones en la celda. Las proteínas citoesqueléticas actina y tubulina, por ejemplo, tienen un par de complementario sitios autoadhesivos en sus superficies que les permiten polimerizar en largos filamentos helicoidales que se extienden a través de la célula. Estos filamentos forman el citoesqueleto de la célula, que se reorganiza continuamente a medida que la célula cambia de forma, se divide y responde a su entorno.

    Los cambios de conformación en una proteína a menudo conducen a cambios en la proteína & # x0027s afinidad hacia un sustrato particular. Este proceso puede jugar un papel crucial en la regulación de la localización intracelular de una proteína. Un ejemplo de este tipo de regulación es la proteína. fosforilación , o adición de un grupo fosfato. Esto puede cambiar drásticamente la afinidad de una proteína por un sustrato y, por lo tanto, puede conducir a cambios rápidos en la ubicación de la proteína. Este tipo de regulación de la localización de proteínas es crucial para permitir que las células coordinen sus actividades en diferentes condiciones de crecimiento y durante la división celular.

    Algunas proteínas citoplasmáticas se dirigen a un sitio particular de la célula porque contienen un aminoácidos secuencia que hace que se unan a los receptores ubicados en ese sitio. Un ejemplo de tal secuencia de dirección es la llamada señal de localización nuclear (NLS), que consta de dos tramos cortos de básico aminoácidos divididos por una región espaciadora de 10 & # x201311 aminoácidos. Esta secuencia de aminoácidos permite que una proteína que la posee se una a los receptores de localización nuclear que se encuentran en el núcleo . Una vez que una proteína que contiene una señal de NLS se une a un receptor nuclear, ya no puede difundirse libremente y se & # x0022localiza & # x0022 al núcleo.

    Muchas proteínas están incrustadas o asociadas a las membranas. En células eucariotas , las membranas forman los límites de una variedad de compartimentos distintos, incluido el núcleo, mitocondrias , retículo endoplásmico (RE) y complejo de Golgi. Algunas proteínas se sintetizan en el citosol y luego se modifican con un lípido & # x0022anchor, & # x0022 y la asociación con las membranas es simplemente una cuestión de incrustación en la capa lipídica externa de la membrana. Las moléculas de señalización, como la proteína Ras de unión a GTP, se localizan en las membranas de esta manera.

    Todas las demás proteínas que se dirigen a las membranas intracelulares requieren señales de clasificación que dirigen su transporte desde el citosol. Por ejemplo, las proteínas dirigidas a las mitocondrias contienen una secuencia peptídica específica de 20 & # x201380 aminoácidos que media su importación. Esta secuencia se encuentra en el extremo amino de la proteína y, después de la importación, se elimina rápidamente mediante una proteasa.

    Las proteínas localizadas dentro de las membranas involucradas en la endocitosis y la exocitosis se dirigen primero al RE y luego usan las vías de transporte de la membrana para llegar a otros compartimentos. La orientación de las proteínas al ER comienza antes de que polipéptido La cadena está completamente sintetizada. Esto contrasta con la importación de proteínas a las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas, que se produce después de que se completa la síntesis. Un péptido señal ER, localizado en el extremo amino de estas proteínas, dirige al ribosoma para que se una a la membrana ER antes de que la proteína se haya traducido por completo. El péptido señal ER es guiado a la membrana ER por una partícula de reconocimiento de señal (SRP), que se une al péptido señal, y un receptor SRP en las membranas ER.

    Desde el ER, las proteínas utilizan una variedad de mecanismos para llegar a diferentes destinos finales en la célula. Proteínas destinadas a la membrana nuclear simplemente se difunden allí y se adhieren, ya que la envoltura nuclear está en continuidad directa con el ER. Sin embargo, para llegar al complejo de Golgi, la membrana plasmática, los endosomas y los lisosomas, las proteínas deben ingresar al vía secretora y utilizar vías de tráfico de membranas. Para las proteínas de membrana, se cree que la entrada en la vía secretora requiere su concentración y clasificación en los sitios de salida del RE. Por el contrario, las proteínas que son solubles en la luz del RE (espacio interior) se mueven hacia afuera mediante un proceso de flujo masivo. Después de salir del ER, la célula finalmente secreta la mayoría de las proteínas solubles. Muchas proteínas de membrana están dirigidas a orgánulos dentro de las vías secretoras y endocíticas porque contienen señales de clasificación específicas en sus colas citoplasmáticas, que funcionan de manera muy similar a los códigos postales. Alternativamente, la clasificación puede deberse a las propiedades de un dominio transmembrana de la proteína, una región de la proteína que da su afinidad por diferentes entornos lipídicos característicos de diferentes orgánulos.


    Contenido

    En 1970, Günter Blobel realizó experimentos sobre la translocación de proteínas a través de membranas. Blobel, entonces profesor asistente en la Universidad Rockefeller, se basó en el trabajo de su colega George Palade. [5] Palade había demostrado previamente que las proteínas no secretadas eran traducidas por ribosomas libres en el citosol, mientras que las proteínas secretadas (y proteínas diana, en general) eran traducidas por ribosomas unidos al retículo endoplásmico. [5] Las explicaciones candidatas en ese momento postulaban una diferencia de procesamiento entre los ribosomas libres y unidos a ER, pero Blobel planteó la hipótesis de que el direccionamiento de proteínas se basaba en características inherentes a las proteínas, en lugar de una diferencia en los ribosomas. Apoyando su hipótesis, Blobel descubrió que muchas proteínas tienen una secuencia de aminoácidos corta en un extremo que funciona como un código postal que especifica un destino intracelular o extracelular. [2] Describió estas secuencias cortas (generalmente de 13 a 36 residuos de aminoácidos) [1] como péptidos señal o secuencias señal y fue galardonado con el premio Nobel de Fisiología de 1999 por sus hallazgos. [6]

    Los péptidos señal sirven como señales de direccionamiento, lo que permite que la maquinaria de transporte celular dirija las proteínas a ubicaciones intracelulares o extracelulares específicas. Si bien no se ha identificado una secuencia de consenso para los péptidos señal, muchos poseen una estructura tripartita característica: [1]

    1. Una región hidrófila cargada positivamente cerca del N-terminal.
    2. Un intervalo de 10 a 15 aminoácidos hidrófobos cerca de la mitad del péptido señal.
    3. Una región ligeramente polar cerca del C-terminal, que típicamente favorece a los aminoácidos con cadenas laterales más pequeñas en las posiciones que se acercan al sitio de escisión.

    Una vez que una proteína ha alcanzado su destino, el péptido señal generalmente es escindido por una peptidasa señal. [1] En consecuencia, la mayoría de las proteínas maduras no contienen péptidos señal. Si bien la mayoría de los péptidos señal se encuentran en el N-terminal, en los peroxisomas la secuencia de dirección se encuentra en la extensión C-terminal. [7] A diferencia de los péptidos señal, los parches señal están compuestos por residuos de aminoácidos que son discontinuos en la secuencia primaria pero que se vuelven funcionales cuando el plegamiento los une en la superficie de la proteína. [8] A diferencia de la mayoría de las secuencias de señales, los parches de señales no se escinden después de que se completa la clasificación. [9] Además de las secuencias de señalización intrínsecas, las modificaciones de proteínas como las glicosilaciones también pueden inducir la orientación a regiones intracelulares o extracelulares específicas.

    Dado que la traducción de ARNm en proteína por un ribosoma tiene lugar dentro del citosol, las proteínas destinadas a la secreción o un orgánulo específico deben translocarse. [10] Este proceso puede ocurrir durante la traducción, conocida como translocación co-traduccional, o después de que se completa la traducción, conocida como translocación postraduccional. [11]

    Translocación co-traslacional Editar

    La mayoría de las proteínas secretoras y unidas a la membrana se translocan de forma cotraduccional. Las proteínas que residen en el retículo endoplásmico (RE), golgi o endosomas también utilizan la vía de translocación co-traduccional. Este proceso comienza mientras la proteína se sintetiza en el ribosoma, cuando una partícula de reconocimiento de señal (SRP) reconoce un péptido señal N-terminal de la proteína naciente. [12] La unión del SRP detiene temporalmente la síntesis mientras que el complejo ribosoma-proteína se transfiere a un receptor SRP en el RE en eucariotas y la membrana plasmática en procariotas. [13] Allí, la proteína naciente se inserta en el translocón, un canal conductor de proteína unido a la membrana compuesto por el complejo de translocación Sec61 en eucariotas y el complejo homólogo SecYEG en procariotas. [14] En las proteínas secretoras y las proteínas transmembrana de tipo I, la secuencia señal se escinde inmediatamente del polipéptido naciente una vez que se ha translocado en la membrana del RE (eucariotas) o la membrana plasmática (procariotas) por la peptidasa señal. La secuencia señal de las proteínas de membrana de tipo II y algunas proteínas de la membrana politópica no se escinden y, por lo tanto, se denominan secuencias de anclaje de señal. Dentro del RE, la proteína está cubierta primero por una proteína chaperona para protegerla de la alta concentración de otras proteínas en el RE, dándole tiempo para plegarse correctamente. Una vez plegada, la proteína se modifica según sea necesario (por ejemplo, mediante glicosilación), luego se transporta al aparato de Golgi para su procesamiento posterior y va a sus orgánulos diana o se retiene en el RE por varios mecanismos de retención del RE.

    La cadena de aminoácidos de las proteínas transmembrana, que a menudo son receptores transmembrana, atraviesa una membrana una o varias veces. Estas proteínas se insertan en la membrana por translocación, hasta que el proceso es interrumpido por una secuencia de parada-transferencia, también llamada secuencia de anclaje de membrana o de anclaje de señal. [15] Estas proteínas de membrana complejas se caracterizan actualmente utilizando el mismo modelo de direccionamiento que se ha desarrollado para las proteínas secretoras. Sin embargo, muchas proteínas complejas multitransmembrana contienen aspectos estructurales que no se ajustan a este modelo. Siete receptores acoplados a proteína G transmembrana (que representan aproximadamente el 5% de los genes en humanos) en su mayoría no tienen una secuencia señal amino-terminal. A diferencia de las proteínas secretoras, el primer dominio transmembrana actúa como la primera secuencia señal, que las dirige a la membrana del RE. Esto también da como resultado la translocación del extremo amino de la proteína en el lumen de la membrana del RE. Esta translocación, que se ha demostrado con opsina con experimentos in vitro, [16] [17] rompe el patrón habitual de translocación "co-traduccional" que siempre se ha mantenido para las proteínas de mamíferos dirigidas al RE. Gran parte de la mecánica de la topología transmembrana y el plegado queda por dilucidar.

    Translocación postraduccional Editar

    Aunque la mayoría de las proteínas secretoras se translocan de forma cotraduccional, algunas se traducen en el citosol y luego se transportan al RE / membrana plasmática mediante un sistema postraduccional. En los procariotas, este proceso requiere ciertos cofactores como SecA y SecB y es facilitado por Sec62 y Sec63, dos proteínas unidas a la membrana. [18] El complejo Sec63, que está incrustado en la membrana del RE, provoca la hidrólisis del ATP, lo que permite que las proteínas chaperonas se unan a una cadena peptídica expuesta y deslice el polipéptido hacia la luz del RE. Una vez en el lumen, la cadena polipeptídica se puede plegar correctamente. Este proceso solo ocurre en proteínas desplegadas ubicadas en el citosol. [19]

    Además, las proteínas dirigidas a otros destinos celulares, como las mitocondrias, los cloroplastos o los peroxisomas, utilizan vías postraduccionales especializadas. Las proteínas dirigidas al núcleo también se traslocan postraduccionalmente mediante la adición de una señal de localización nuclear (NLS) que promueve el paso a través de la envoltura nuclear a través de los poros nucleares. [20]

    Mitocondrias editar

    La mayoría de las proteínas mitocondriales se sintetizan como precursores citosólicos que contienen señales de péptidos de captación. Las chaperonas citosólicas entregan preproteínas a los receptores ligados a canales en la membrana mitocondrial. La preproteína con presecuencia dirigida a las mitocondrias está unida por receptores y el poro de importación general (GIP), conocido colectivamente como translocasa de la membrana externa (TOM), en la membrana externa. Luego se transloca a través de TOM como bucles de horquilla. La preproteína es transportada a través del espacio intermembrana por pequeños TIM (que también actúan como chaperonas moleculares) al TIM23 o TIM22 (translocasas de la membrana interna) en la membrana interna. Dentro de la matriz, la secuencia de dirección es escindida por mtHsp70.

    Se conocen tres receptores de la membrana externa mitocondrial:

    1. TOM70: Se une a los péptidos diana internos y actúa como un punto de acoplamiento para las chaperonas citosólicas.
    2. TOM20: Enlaza presecuencias.
    3. TOM22: Se une tanto a las presecuencias como a los péptidos diana internos.

    El canal TOM (TOM40) es un canal de alta conductancia específico de catión con un peso molecular de 410 kDa y un diámetro de poro de 21Å.

    La presecuencia translocase23 (TIM23) se localiza en la membrana interna mitocondrial y actúa como una proteína formadora de poros que une proteínas precursoras con su N-terminal. TIM23 actúa como un translocador de preproteínas para la matriz mitocondrial, la membrana mitocondrial interna y el espacio intermembrana. TIM50 está unido a TIM23 en el lado mitocondrial interno y se encuentra que se une a presecuencias. TIM44 está unido en el lado de la matriz y se encuentra unido a mtHsp70.
    La presecuencia translocase22 (TIM22) se une a las preproteínas unidas exclusivamente a la membrana mitocondrial interna.

    Las secuencias de dirección de la matriz mitocondrial son ricas en aminoácidos cargados positivamente y en aminoácidos hidroxilados.

    Las proteínas se dirigen a los compartimentos submitocondriales mediante múltiples señales y varias vías.

    La orientación a la membrana externa, el espacio intermembrana y la membrana interna a menudo requiere otra secuencia de señal además de la secuencia de orientación de la matriz.

    Cloroplastos Editar

    La preproteína de los cloroplastos puede contener una secuencia de importación estromal o una secuencia de dirección estromal y tilacoide. La mayoría de las preproteínas se translocan a través de los complejos Toc y Tic ubicados dentro de la envoltura del cloroplasto. En el estroma, la secuencia de importación del estroma se escinde y se pliega, así como continúa la clasificación intracloroplasto a tilacoides. Las proteínas dirigidas a la envoltura de los cloroplastos generalmente carecen de una secuencia de clasificación escindible.

    Tanto los cloroplastos como las mitocondrias Editar

    Se necesitan muchas proteínas tanto en las mitocondrias como en los cloroplastos. [21] En general, el péptido de doble focalización es de carácter intermedio a los dos específicos. Los péptidos dirigidos a estas proteínas tienen un alto contenido de aminoácidos básicos e hidrófobos, un bajo contenido de aminoácidos cargados negativamente. Tienen menor contenido de alanina y mayor contenido de leucina y fenilalanina. Las proteínas de doble objetivo tienen un péptido de direccionamiento más hidrofóbico que los mitocondriales y cloroplásticos. Sin embargo, es tedioso predecir si un péptido tiene un objetivo dual o no en función de sus características físico-químicas.

    Peroxisomas Editar

    Todas las proteínas peroxisomales están codificadas por genes nucleares. [22] Hasta la fecha, existen dos tipos de señales de focalización de peroxisomas (PTS) conocidas: [23]

    1. Señal de focalización de peroxisomas 1 (PTS1): un tripéptido C-terminal con una secuencia consenso (S / A / C) - (K / R / H) - (L / A). El PTS1 más común es serina-lisina-leucina (SKL). La mayoría de las proteínas de la matriz peroxisomal poseen una señal de tipo PTS1.
    2. Señal de focalización de peroxisomas 2 (PTS2): un nonapéptido ubicado cerca del extremo N-terminal con una secuencia de consenso (R / K) - (L / V / I) -XXXXX- (H / Q) - (L / A / F) (donde X puede ser cualquier aminoácido ).

    También hay proteínas que no poseen ninguna de estas señales. Su transporte puede basarse en un mecanismo llamado "piggy-back": tales proteínas se asocian con proteínas de la matriz que poseen PTS1 y se traslocan a la matriz peroxisomal junto con ellas. [24]

    El transporte de proteínas es defectuoso en las siguientes enfermedades genéticas:

    Como se discutió anteriormente (ver translocación de proteínas), la mayoría de las proteínas secretoras y unidas a la membrana procariotas se dirigen a la membrana plasmática mediante una vía de co-traducción que usa SRP bacteriano o una vía de postraducción que requiere SecA y SecB. En la membrana plasmática, estas dos vías entregan proteínas al translocón SecYEG para su translocación. Las bacterias pueden tener una sola membrana plasmática (bacterias Gram-positivas) o una membrana interna más una membrana externa separadas por el periplasma (bacterias Gram-negativas). Además de la membrana plasmática, la mayoría de los procariotas carecen de orgánulos unidos a la membrana como los que se encuentran en los eucariotas, pero pueden ensamblar proteínas en varios tipos de inclusiones, como vesículas de gas y gránulos de almacenamiento.

    Bacterias Gram-negativas Editar

    In gram-negative bacteria proteins may be incorporated into the plasma membrane, the outer membrane, the periplasm or secreted into the environment. Systems for secreting proteins across the bacterial outer membrane may be quite complex and play key roles in pathogenesis. These systems may be described as type I secretion, type II secretion, etc.

    Gram-positive bacteria Edit

    In most gram-positive bacteria, certain proteins are targeted for export across the plasma membrane and subsequent covalent attachment to the bacterial cell wall. A specialized enzyme, sortase, cleaves the target protein at a characteristic recognition site near the protein C-terminus, such as an LPXTG motif (where X can be any amino acid), then transfers the protein onto the cell wall. Several analogous systems are found that likewise feature a signature motif on the extracytoplasmic face, a C-terminal transmembrane domain, and cluster of basic residues on the cytosolic face at the protein's extreme C-terminus. The PEP-CTERM/exosortase system, found in many Gram-negative bacteria, seems to be related to extracellular polymeric substance production. The PGF-CTERM/archaeosortase A system in archaea is related to S-layer production. The GlyGly-CTERM/rhombosortase system, found in the Shewanella, Vibrio, and a few other genera, seems involved in the release of proteases, nucleases, and other enzymes.


    Study challenging interactions with membrane proteins to improve drug design

    Figuring out the role a membrane protein plays in a cellular process requires understanding how it interacts with its ligands. This knowledge also helps in designing drugs that target these processes. The characterization of the interactions with ligands during drug discovery and development with label-free assays and in solution allows researchers to unravel molecular mechanisms and improve drug design.

    Improve drug design to target membrane proteins

    The human PepT1 transporter plays an important role in drug uptake and transport — which makes it a promising pharmacological target. Using DtpA — a bacterial homolog — this team measured the binding of peptides and drugs to DtpA with label-free MST. The data helped them model and improve drug design for the human transporter. Additionally, they looked at how nanobodies stabilized the transporter for crystallization and structure determination with label-free nanoDSF.

    Identify key ligand binding sites in solution

    The NRT1.1 proton-coupled transporter is responsible for nitrogen assimilation and nitrate transport in plants. In nature, it switches between low and high affinity nitrate binding states in response to falling nitrate levels via a process of phosphorylation. To understand this mechanism, researchers used MST to determine how nitrate binding to GFP-fused NRT1.1 in detergent was affected by phosphorylation and point mutations. In combination with crystallography data, they revealed a key amino acid residue for nitrate binding and showed how phosphorylation of the transporter allows it to switch binding states.


    Membrane Protein Overview

    Membrane proteins represent about a third of the proteins in living organisms. Based on their structure, there are main three types of membrane proteins: the first one is integral membrane protein that is permanently anchored or part of the membrane, the second type is peripheral membrane protein that is only temporarily attached to the lipid bilayer or to other integral proteins, and the third one is lipid-anchored proteins (Fig. 1). Here we only describe the first two types of membrane protein.

    Fig. 1 Structural classification of membrane proteins

    According to their their relationship with the bilayer, integral membrane protein can be classified two primary types: integral polytopic proteins and Integral monotopic proteins. Integral polytopic proteins are also known as “transmembrane proteins” which can span across the membrane at least once (Fig. 2). These integral membrane proteins may have different transmembrane topology which refers to orientations (locations of N- and C-termini) of membrane-spanning segments with respect to the inner or outer sides of the biological membrane occupied by the protein. The first three types in the Fig. 2 are common forms in integral membrane proteins, such as, transmembrane α-helix protein, transmembrane α-helical protein and transmembrane β-sheet protein.

    Integral monotopic proteins are one type of integral membrane proteins that are attached to only one side of the membrane and do not span the whole way across. There are 4 types of interaction between Integral monotopic membrane protein and cell membranes: by an amphipathicα-helix paralle, by a hydrophobic loop, by a covalently bound membrane lipid and electrostatic or ionic interaction with membrane lipids (No. 4, 5, 6,7 of Fig. 2). Integral membrane proteins can be separated from the biological membranes only using detergents, nonpolar solvents, or sometimes denaturing agents. Peripheral proteins dissociate following treatment with a polar reagent, such as a solution with an elevated pH or high salt concentrations.

    Fig. 2 Seven types of Integral Membrane protein Structure

    The membrane is represented in yellow. 1. A single transmembrane α-helix (bitopic membrane protein). 2. A polytopic transmembrane α-helical protein. 3. A polytopic transmembrane β-sheet protein. 4. Interaction by an amphipathic α-helix parallel to the membrane plane (in-plane membrane helix). 5. Interaction by a hydrophobic loop. 6. Interaction by a covalently bound membrane lipid. 7. Ionic or electrostatic interactions with membrane lipids.

    Function of Membrane Proteins

    Membrane proteins play crucial roles in all organisms, where they serve as, such as membrane receptors, ion channels , GPCR (G protein–coupled receptors) and various kinds of proteínas de transporte . Membrane receptors that embedded in the cell membranes, which can transmit signals between the cell’s internal and external environments. Membrane transport protein (or transporter) is a kind of membrane protein that involved in the movement of ions, small molecules, or macromolecules across a biological membrane. About membrane transport protein, there is a detailed classification called Transporter Classification Database (or TCDB) approved by International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Ion channels are one of most important type of membrane transport proteins. The functions of ion channel include establishing a resting membrane potential, shaping action potentials and other electrical signals by gating the flow of ions across the cell membrane, controlling the flow of ions across secretory and epithelial cells, and regulating cell volume. Some enzymes are also membranes proteins, for example oxidoreductase, transferase or hydrolase. Cell adhesion molecules that located on the cell surface involved in binding with other cells or with the extracellular matrix (ECM), allow cells to identify each other and interact. For example, proteins including Ig ( immunoglobulin ) superfamily involved in immune response. The following figure 3 summarizes membrane protein functions for easy to understand.

    Fig. 3 Membrane proteins functions

    Owing to their central role in basically all physiological processes, membrane proteins constitute around 60% of approved drug targets, and, therefore, their experimentally determined three – dimensional structures are eagerly sought to assist in structure – based drug design. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. Compared with soluble cytoplasmic proteins, a variety of difficulties in expression of membrane proteins. 1. Membrane proteins are not just released into the cytosol but must rather be targeted and translocated to their final destinations in membranes. In particular in eukaryotic cells, there is need a more complicated biological process requires sophisticated recognition and sorting mechanisms. 2. Copy number and capacity of prokaryotic and eukaryotic expression systems are limited because of translocation machineries, and translocation can be selective only for distinct groups of membrane proteins. 3. For structural and functional studies or other purposes, it is have to extract membrane protein from cellular after expression, followed by transfer into artificial and defined hydrophobic environments like micelles or liposomes. In this procedure, it is highly critical as membranes have to be disintegrated by relatively harsh detergents which can result in conformational aberrations or in unfolding of membrane proteins. It is therefore not surprising that the structural information obtained from membrane proteins with some 150 unique structures and only

    7% entries in the Protein Data Bank is lacking far behind the data obtained from soluble proteins.

    Core factors that determine the yield, integrity, activity and stability of synthesized membrane proteins mainly are the availability of highly processive transcription and translation machineries, suitable folding environments, the lipid composition of cellular membranes, the presence of efficient targeting systems and appropriate pathways for posttranslational modifications (PTMs). Expression of membrane proteins in expression systems/cellular background as closely related to their origin as possible may be the most reasonable strategy. However, the efficiency and workload of the individual expression systems are quite different, and preparative amounts of membrane proteins are often only obtained with bacterial, yeast or cell-free systems (Fig. 4).

    Fig. 4 Process design of membrane protein expression systems.

    Overview of protocol development for the most popular membrane protein expression systems. Basic optimization parameters characteristic for the individual expression systems are illustrated, and the most critical parts are indicated. Some optimization parameters are not considered: vector or target design, e.g. fusion technologies or modifications of the expression cassettes. Grey bars illustrate the success in obtaining membrane protein structures after using the individual expression systems, while white bars correspond to those membrane protein structures obtained only after recombinant expression. (F. Junge et al.)

    Although choosing an appropriate expression system need to consider many factors which may increase the complexity and time-consuming of research project, Creative Biolabs can provide comprehensive membrane protein production service which can help you decide optimization parameter and systems for your targeted experiments.

    Membrane Protein Antibody

    Membrane proteins represent the vast majority of clinical drug targets and are a focus of pharmaceutical and biotechnological interests. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. However, there are still many strategies for preparing membrane proteins that have been developed by Specialists from Creative Biolabs. En términos de anti-membrane protein antibody discovery and production , Creative Biolabs is able to provide various methods from immune antibody library construction by phage display to native antibody discovery by antigen-specific B lymphocytes cytometry technology. If you are interested in discovering novel membrane protein antibodies, please feel free to contact us for more details.


    Abstracto

    Cellular organelles in the exocytic and endocytic pathways have a distinctive spatial distribution and communicate through an elaborate system of vesiculo-tubular transport. Rab proteins and their effectors coordinate consecutive stages of transport, such as vesicle formation, vesicle and organelle motility, and tethering of vesicles to their target compartment. These molecules are highly compartmentalized in organelle membranes, making them excellent candidates for determining transport specificity and organelle identity.


    Mapping the folding process of a single membrane protein

    Proteins are huge molecules containing hundreds to thousands of atoms that adopt a unique three dimensional structure, placing chemical groups in just the right place to catalyze reactions or build cellular structures. How all those atoms manage to find the right location -- the so-called folding problem -- has fascinated molecular biologists since the first structures were seen in the 1950s. Moreover, folding has important medical implications because most genetic defects cause protein misfolding.

    About a third of all proteins float around in the cell membrane where they ensure the right chemicals get in the cell in the right amounts. Membrane proteins also provide key information links between the cell and its environment. Indeed, most drugs target membrane proteins. Nevertheless, the folding of membrane proteins has been particularly difficult to study and has rarely been studied in natural environments, leaving the folding process for a large fraction of the protein universe still largely cloaked in mystery.

    En un número reciente de Biología química de la naturaleza, published on October 19, 2015, a research team led by Tae-Young Yoon of the Department of Physics at the Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) and James U. Bowie of the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of California, Los Angeles (UCLA), report a new method for manipulating the folding of membrane proteins in a membrane environment using a tool called a magnetic tweezer.

    Researchers first attach long DNA handles to the ends of the protein. One handle is attached to a glass surface and the other to a magnetic bead. Using a magnet, they can essentially grab the protein and pull on it, inducing it to unfold. By playing with the bead attached to the protein, they can force the protein to unfold or allow it to refold, and watch all this happening by 3D-tracking of the magnetic bead. With this novel strategy, they were able to quantitatively map the folding energy landscape, the folding kinetic rate, and folding intermediates of a membrane protein in a membrane environment for the first time.

    "I have been dreaming about this experiment for a decade. To see it work so well is really gratifying," said Dr. Bowie.

    One of the major surprises in the study was that essentially all the atoms of the protein jump into the correct structure together. The researchers expected that the protein structure would come together in a more piecemeal fashion, with different parts of the structure forming separately, but that was not the case. It is possible that nature evolved such a smooth, highly cooperative folding process to prevent partially folded forms that could get into trouble in the crowded cell membrane. On the other hand, the cooperative folding seen here might not apply to other membrane proteins.

    "We need to look at more proteins. The technique developed here may allow us to do just that," said Dr. Yoon.

    The single molecule mechanical manipulation technique could enable detailed folding studies of many other membrane proteins. A major barrier to the study of membrane proteins previously is that the proteins tend to stick together and get tangled up, as computer cords lying at your feet tend to do. With the tweezer technique used in this work, the protein cords are held apart from other cords so they can't get knotted up. It is hoped that the new approach will open up an important part of the protein universe to scrutiny, including many proteins that become misfolded in disease states.

    The title of the research paper is "Mapping the energy landscape for second-stage folding of a single membrane protein."


    6 Important Types of Membrane Proteins (With Diagram)

    Some of the most important types of membrane proteins are as follows:

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins 2. Integral (Intrinsic) Proteins 3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins 4. Mobility of Membrane Proteins 5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins 6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins.

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins:

    Peripheral or extrinsic membrane proteins are gener­ally loosely attached to the membrane and are more readily removed than are the integral proteins. Peripheral proteins are rich in amino acids with hydrophilic side chains that permit interaction with the surrounding water and with the polar surface of the lipid bilayer. Peripheral proteins on the cell’s exterior membrane surface often contain chains of sugars (i.e., they are glycoproteins).

    2. Integral (Intrinsic) Proteins:

    Integral or intrinsic membrane proteins contain both hydrophilic and hydrophobic regions. The hydrophilic portions of the protein interact with the polar heads of the lipid molecules at each surface of the bimolecular leaflet.

    Portions of integral proteins that project be­yond the surface of the lipid bilayer are also rich in hy­drophilic amino acids. Amino acids in that part of the protein projecting from the outer membrane surface may be linked to chains of sugars. Parts of the protein that are buried in the hydrophobic portion of the lipid bilayer are rich in amino acids with hydrophobic side chains.

    These side chains are believed to form hydro­phobic bonds with the hydrocarbon tails of the mem­brane phospholipids. It is speculated that within the hydrophobic interior of the membrane, the secondary structure of integral proteins is alpha helix and/or beta sheet (Fig. 15-12).

    In the alpha helix conforma­tion, amino and carboxyl groups along a stretch of the polypeptide’s backbone form hydrogen bonds with one another in the beta sheet, hydrogen bonds are formed between amino and carboxyl groups in stretches of polypeptide that lie parallel to one another.

    In the absence of such hydrogen bonding, these amino and carboxyl groups would have polar proper­ties, their hydrophilic nature being incompatible with the membrane’s hydrophobic interior. Alpha amino and carboxyl groups that are not “neutralized” by hy­drogen bonding would be expected only in those parts of the integral protein that extend into the aqueous milieu on either side of the membrane.

    Integral Proteins That Span the Membrane:

    M. Bretscher first demonstrated the existence of inte­gral proteins that span the entire membrane. In a se­ries of elegant experiments, Bretscher showed that radioactive ligands specific for membrane proteins of the erythrocyte were bound in smaller quantities to intact cells than to disrupted cells. Disruption of the cells was shown to expose portions of the membrane proteins previously facing the cell interior, thereby al­lowing additional radioactive ligand to associate with the protein.

    T. L. Steck developed a technique for converting fragments of disrupted erythrocyte membranes into small vesicles that were either “right-side-out” (i.e., the external face of the membrane also formed the ex­ternal face of the vesicle) or “inside-out” (Fig. 15-13).

    When proteolytic enzymes were added to separate suspensions of each type of vesicle, certain of their membrane proteins were found to be equally suscepti­ble to digestion and could therefore be enzymatically attacked from either membrane surface. These pro­teins clearly spanned the membrane. Other proteins were susceptible to enzymatic digestion only when present in right-side-out or inside-out vesicles, indicat­ing their differential distribution in the membrane’s outer and inner surfaces.

    Integral proteins that span the entire membrane contain two outer regions that are hydrophilic (i.e., one at each surface of the membrane) the central re­gion is hydrophobic (Fig. 15-12). Carbohydrate asso­ciated with the hydrophilic region facing the cell’s sur­roundings is believed to play a role in maintaining the orientation of the protein within the membrane. The hydrophilic sugars, together with the hydrophilic side chains of amino acids in the out: region of the pro­tein, effectively prevent reorientation of the protein in the direction of the hydrocarbon core of the lipid bi­layer.

    3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins:

    The outer and inner regions of the plasma membrane do not contain either the same types or equal amounts of the various peripheral and integral proteins. For ex­ample, the outer half of the erythrocyte membrane contains far less protein than does the inner, half.

    In addition, various membrane proteins may be present in significantly different quantities the membranes of some cells contain a hundred times as many molecules of one protein species as another. Moreover, regard­less of absolute quantity, all copies of a given mem­brane protein species have exactly the same orienta­tion in the membrane.

    The differential distribution of proteins in the various regions of the plasma mem­brane within a single cell was described earlier in con­nection with liver parenchymal cells and intestinal epithelium. This irregular distribution of membrane proteins is known as membrane asymmetry. Not only are the proteins of plasma membranes asymmetri­cally distributed but so too are the proteins of the mem­branes of the endoplasmic reticulum and vesicular or­ganelles (e.g., mitochondria).

    4. Mobility of Membrane Proteins:

    When cells are grown in culture, there is an occasional fusion of one cell with another to form a larger cell. The frequency of cell fusion can be greatly increased by adding Sendai virus to the cell culture. In the pres­ence of this virus, even different strains of cells can be induced to fuse, producing hybrid cells or heterokaryons. D. Frye and M. Edidin utilized this phenom­enon to demonstrate that membrane proteins may not maintain fixed positions in the membrane but may move about laterally through the bilayer.

    Frye and Edidin induced the fusion of human and mouse cells to form heterokaryons and, using fluorescent antibody labels, followed the distribution of human and mouse membrane proteins in the heterokaryon during the time interval that followed fusion.

    At the onset of fu­sion, human and mouse membrane proteins were re­spectively restricted to their “halves” of the hybrid cell, but in less than an hour both protein types be­came uniformly distributed through the membrane (Fig. 15-14). The distribution of the membrane pro­teins was not dependent on the availability of ATP and was not prevented by metabolic inhibitors, indicating that lateral movement of proteins in the membrane oc­curred by diffusion.

    Although some membrane proteins are capable of lateral diffusion, many are not. G. Nicolson and others have obtained evidence suggesting that many integral proteins are restrained within the membrane by a pro­tein network lying just under the membrane’s inner surface (Fig. 15-9). In many cells, this network is as­sociated with a system of cytoplasmic filaments and microtubules that radiate through the cytosol forming a cytoskeleton.

    5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins:

    Membrane proteins have been shown to possess enzy­matic activity. Table 15-1 lists some of the enzymes that are now recognized as constituents of the plasma membrane of various cells. To this list of proteins must be added receptor proteins (such as the insulin- binding sites of the liver plasma membrane) and struc­tural or non-enzymatic proteins.

    Ectoenzymes and Endoenzymes:

    Enzymes disposed in the plasma membrane may be characterized accord­ing to the membrane face containing the enzymatic activity. Accordingly, ectoenzymes are those enzymes whose catalytic activity is associated with the exterior surface of the plasma membrane the activity of plasma membrane endoenzymes is associated with the interior of the cell. Many (perhaps all) plasma membrane ectoenzymes are glycoproteins.

    6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins:

    Because of the relative ease with which they may be purified, the plasma membranes of erythrocytes pro­vided much of the early information on the chemistry of proteins (and lipids) present in membranes. Now, however, plasma membranes can be obtained from many cell types in a reasonably uncontaminated state using various forms of density gradient centrifugation.

    Nonetheless, the individual protein constituents of the membrane are not so easily extricated for indi­vidual study because of their high degree of insolubil­ity. Varying degrees of success in extracting proteins from the plasma membrane have been achieved using organic detergents (especially sodium dodecyl sulfate, SDS) and concentrated solutions of urea, n-butanol, and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).

    These chemicals have a disaggregating effect on membranes and cause the release of many of the membrane pro­teins by dissociating the bonds that link the proteins together or to other membrane constituents. Often, the removal of these agents from a preparation of sol- ubilized membrane proteins is quickly followed by the reassociation or reaggregation of the proteins to form an intractable matrix.

    Once solubilized, the membrane proteins can be sep­arated into discrete classes using electrophoresis, chromatography, or other procedures. This generally demands that the dissociating agents be present in the separating medium (e.g., the electrophoresis gel, the column eluent, etc.) other­wise, application of the membrane extract to the me­dium is followed by membrane protein reaggregation into insoluble complexes that will not separate into distinct fractions.

    For example, the separation of liver plasma membrane proteins is achieved only if the electrophoresis gel contains SDS. The solubility problem has been one of the greatest barriers to progress in isolating and fully characterizing the proteins of membranes.

    Some of the plasma membrane enzymes listed in Table 15-1 have not actually been isolated from the membrane, as removal and isolation of the enzyme is not a prerequisite for establishing its presence. In­stead, the enzyme activity can be measured directly in the (un-solubilized) membrane preparation.