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Cómo deducir si la infección por el virus del ARN o la infección por el virus del ADN

Cómo deducir si la infección por el virus del ARN o la infección por el virus del ADN


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¿Existe alguna regla general que diga que esto debe ser una infección por virus de ARN y la otra por una infección por virus de ADN?

Ejemplo de un caso: 5 niños desarrollan una erupción de color rojo brillante en la cara que se vuelve violeta después de unos días y luego desaparece. Luego aparece una erupción maculopapular en el tronco, glúteos y extremidades. Pronto se desvanece del tronco pero persiste en los muslos y antebrazos. Dos niños también han tenido fiebre leve y dolor de garganta, pero no todos estaban muy enfermos. ¿Cuál es el material genético del agente causal más probable?

La respuesta correcta es: ADN monocatenario, ya que lo más probable es que el agente causal sea el eritema infeccioso causado por el parvovirus B19.

No quiero recordar todos los microbios de memoria. ¿Cómo se puede deducir que esto debe ser una infección de ADN y probablemente de una sola hebra?


Si te refieres simplemente a observar los síntomas, entonces no hay forma, especialmente si es en el contexto de una visita médica. Es mejor que conozca a los sospechosos habituales y averigüe el riesgo y la probabilidad de que los pacientes tengan una infección determinada. Un buen ejemplo es la hepatitis. El virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) tienen síntomas externos similares (suficientes), pero el primero es un virus de ADN y el segundo un virus de ARN. De hecho, mirando la lista de causas agudas de enWikipedia, ¡está por todas partes!

Si realmente puede analizarlo en el laboratorio, entonces, por supuesto. A pesar de que…


La dinámica de norte Modificación del ARN de la 6-metiladenina en las interacciones entre los virus del arroz y de las plantas

norte 6 -metiladenosina (m 6 A) es la modificación de ARN más común en eucariotas y se ha implicado como un marcador epigenético novedoso que participa en varios procesos biológicos. Ya se ha informado del patrón y disección funcional de m 6 A en la regulación de varias enfermedades virales humanas importantes. Sin embargo, los patrones y funciones de la distribución de m 6 A en el brote de enfermedades de las plantas siguen siendo en gran parte desconocidos.

Resultados

Analizamos los metilomas m 6 A de alta calidad en plantas de arroz infectadas con dos virus devastadores. Encontramos que la metilación de m 6 A se asocia principalmente con genes que no se expresan activamente en plantas de arroz infectadas con virus. También detectamos diferentes distribuciones de picos de m 6 A en el mismo gen, que pueden contribuir a diferentes modos antivirales entre el virus de la raya del arroz o la infección por el virus de la raya negra del arroz. Curiosamente, observamos niveles aumentados de metilación de m 6 A en la respuesta de la planta de arroz a la infección por virus. Varios genes relacionados con la vía antiviral, como el silenciamiento del ARN, la resistencia y los genes relacionados con el metabolismo de las fitohormonas antivirales fundamentales, también están metilados en m6A. El nivel de metilación de m 6 A está estrechamente asociado con sus niveles de expresión relativos.

Conclusiones

Revelamos la dinámica de la modificación de m 6 A durante la interacción entre el arroz y los virus, que puede actuar como una estrategia reguladora principal en la expresión génica. Nuestras investigaciones destacan la importancia de las modificaciones de m 6 A en las interacciones entre plantas y virus, especialmente en la regulación de la expresión de genes implicados en vías clave.


Cómo deducir si una infección por virus de ARN o una infección por virus de ADN - Biología

Palabras clave: generación de precursor-miARN, silenciamiento mediado por ARN bicatenario, formación de heterocromatina, resilenciamiento de la transcripción activa, mantenimiento de genes homeóticos e inmunidad antiviral

Las helicasas DEAD-box juegan un papel esencial en el metabolismo del ARN en todas las especies, pero los datos emergentes sugieren que tienen funciones adicionales en la inmunidad. A través de la detección de ARNi, se identificó un papel evolutivamente conservado e independiente del interferón para la helicasa DEAD-box DDX17 en la restricción del virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), un virus transmitido por mosquitos en la familia de los bunyavirus que causa morbilidad y mortalidad severas en humanos y ganado. . La pérdida de Drosophila DDX17 (Rm62) en células y moscas aumenta la infección por RVFV. De manera similar, el agotamiento de DDX17 pero no la helicasa relacionada DDX5 aumentó la replicación de RVFV en células humanas. Utilizando la secuenciación de alto rendimiento de inmunoprecipitación entrecruzada (CLIP-seq), este estudio muestra que DDX17 se une a los lazos madre del precursor-miARN del huésped (pri-miRNA) para facilitar su procesamiento y también un bucle principal esencial en el ARN bunyaviral para restringir la infección. Por lo tanto, DDX17 tiene un papel doble en el reconocimiento de los bucles madre: en el núcleo para la biogénesis de microARN endógenos (miARN) y en el citoplasma para la vigilancia contra elementos no propios estructurados (Moy, 2014).

Las helicasas de ARN controlan casi todas las facetas del metabolismo del ARN, incluida la transcripción, el empalme, la biogénesis de miARN, la traducción y la descomposición. Las proteínas DEAD-box, que comprenden la familia más grande de helicasas, se encuentran en los tres reinos de la vida y comparten 12 motivos conservados, incluido el motivo DEAD caracterizado por los aminoácidos Asp-Glu-Ala-Asp. Aunque las proteínas DEAD-box son más apreciadas por su papel en el metabolismo del ARN, algunas tienen funciones importantes en la defensa antiviral. Por ejemplo, el gen 1 inducible por ácido retinoico de mamíferos (RIG-I / DDX58) y el factor 5 asociado a la diferenciación de mieloma (MDA-5), denominados colectivamente receptores similares a RIG-I (RLR), reconocen elementos no propios en virus. ARN como el ARN bicatenario (dsRNA) y el ARN 5'-trifosforilado, que conducen a la inducción transcripcional de interferón tipo I (IFN-I) y citocinas proinflamatorias (Loo, 2011). Sin embargo, algunos virus no están restringidos por RLR en algunos contextos ni codifican potentes antagonistas de RLR y, por lo tanto, pueden haber evolucionado sensores adicionales (Moy, 2014).

Aunque los RLR no se conservan estrictamente en invertebrados como mosquitos y Drosophila, los insectos usan una helicasa relacionada para combatir la infección viral. La helicasa Dicer-2 (Dcr-2) de DEAD-box es un componente central de la vía del ARNi que reconoce los ARN virales bicatenarios o estructurados y los escinde en ARN de pequeña interferencia (ARNip) de 21 nt (Ding, 2007 Sabin, 2013 ). Los ARNip derivados de virus se cargan en un complejo silenciador inducido por ARN que contiene Argonaute-2 (Ago2) que escinde el ARN viral. Además, durante la infección por el virus Drosophila C (DCV), Dcr-2 controla la inducción del gen antiviral Vago (Deddouche, 2008 Moy, 2014 y referencias allí).

Más recientemente, se ha implicado a varias otras proteínas DEAD-box en la detección de ácidos nucleicos virales o en la regulación de la señalización aguas abajo. Por ejemplo, DDX41 reconoce el ADN intracelular y los dinucleótidos cíclicos bacterianos, mientras que un complejo de DDX1, DDX21 y DHX36 detecta el ARNdc viral específicamente en células dendríticas. Otros sensores de helicasa identificados recientemente o componentes de vías de señalización antiviral incluyen DDX3, DHX9 y DDX60. Por lo tanto, el panorama de las helicasas DEAD-box en la inmunidad innata es más diverso de lo que se pensaba anteriormente, y es probable que muchas helicasas antivirales sigan siendo oscuras (Moy, 2014).

Como muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan en las moscas, así como en muchas helicasas de caja DEAD, se realizó un cribado de ARNi para identificar nuevas helicasas antivirales. La atención se centró en el virus transmitido por artrópodos (arbovirus), el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), un virus de ARN de sentido negativo trisegmentado de la familia de los bunyavirus. En los seres humanos, la infección por RVFV suele causar una enfermedad febril aguda, pero puede progresar a manifestaciones más graves, como encefalitis y fiebre hemorrágica, con una mortalidad del 1% al 3%. En el ganado, la infección es particularmente letal, con tasas de aborto del 100% y casi el 100% de mortalidad en los recién nacidos. No existen vacunas o terapias efectivas para la infección por RVFV y, por lo tanto, se necesitan dianas adicionales para la intervención farmacológica. Además, se ha demostrado que el RVFV no está restringido por los RLR en algunos contextos, incluidos los fibroblastos, lo que sugiere que otros sensores pueden restringir este patógeno (Moy, 2014).

Este estudio identifica a Drosophila Rm62 como un factor huésped novedoso que restringe la infección por RVFV in vitro e in vivo. Esta restricción era específica para los bunyavirus, ya que Rm62 también controlaba la replicación del virus bunyavirus La Crosse (LACV), pero no los virus de las otras tres familias analizadas. Sorprendentemente, la función antiviral de Rm62 se conservó en células humanas, ya que el homólogo humano DDX17 restringió la infección por RVFV. DDX17 se identificó en un complejo de alto peso molecular con Drosha y más tarde se demostró que regula el complejo microprocesador que media el procesamiento de pri-miARN y la biogénesis de miARN, pero sus objetivos directos de ARN no se conocen por completo. Usando CLIP-seq, este estudio encontró que además de unirse a los ARN celulares, DDX17 también interactúa con el ARN del RVFV, probablemente a través de elementos de ARN viral estructurado. Se encontraron similitudes sorprendentes en el modo de reconocimiento del ARN del huésped y del virus: DDX17 une un subconjunto de horquillas de pri-miARN junto con una horquilla bien caracterizada en el genoma del RVFV. La clonación de esta horquilla en el virus Sindbis (SINV) disminuyó su replicación de una manera dependiente de DDX17 en células humanas y de insectos, lo que indica una función antiviral directa para la unión de DDX17 al ARN viral. En conjunto, estos datos amplían la comprensión del reconocimiento DDX17 de los ARN celulares y virales, así como el alcance de las helicasas DEAD-box en la inmunidad antiviral, lo que demuestra que las funciones inmunes de los genes DEAD-box pueden conservarse evolutivamente de insectos a humanos (Moy , 2014).

Los datos emergentes han comenzado a descubrir funciones especializadas para las helicasas de caja DEAD de mamíferos en la inmunidad, particularmente en la detección de ácidos nucleicos virales para activar la inducción de interferón (Fullam, 2013). Sin embargo, no está claro si las helicasas DEAD-box desempeñan funciones independientes del interferón en la inmunidad antiviral. Además, no se ha explorado por completo si existen helicasas antivirales DEAD-box principalmente en mamíferos o funciones inmunes evolucionadas en organismos inferiores. Este estudio ha descubierto un papel específico y evolutivamente conservado de la helicasa DDX17 en la restricción de la infección por RVFV, un arbovirus humano importante que carece de terapias eficaces (Moy, 2014).

A través de un cribado de ARNi en células de Drosophila, se identificó Rm62 como un gen de helicasa anti-RVFV. Rm62 también es esencial para la resistencia a la infección por RVFV in vivo, ya que las moscas deficientes en Rm62 desafiadas por RVFV mostraron un aumento de la replicación viral y la mortalidad. La pérdida de Rm62 aumentó la infección por LACV pero no la infección por SINV, VSV o DCV, y el silenciamiento de genes de helicasa de caja DEAD estrechamente relacionados no tuvo ningún efecto sobre el RVFV. Por tanto, Rm62 es un factor de restricción viral esencial y específico en las moscas (Moy, 2014).

Los mamíferos codifican dos ortólogos de Rm62, DDX5 y DDX17, que han sido ampliamente estudiados en coactivación transcripcional, empalme de ARNm y procesamiento de miARN. Además, estudios previos han implicado a DDX5 y DDX17 en la promoción de la replicación de varios virus, como el virus de la hepatitis C y el virus de la influenza. Este estudio encontró que silenciar DDX17 pero no DDX5 aumentaba la replicación de RVFV en células U2OS humanas, mientras que la sobreexpresión de DDX17 inhibía la infección por RVFV. Aunque no se puede descartar una función antiviral para DDX5, ya que el agotamiento de DDX5 regulaba al alza la expresión de DDX17 y no fue posible eliminar de manera eficiente ambas proteínas simultáneamente en las células U2OS, los niveles basales de DDX5 no pudieron compensar la pérdida de DDX17. Por lo tanto, la actividad antiviral de DDX17 se conserva evolutivamente de invertebrados a mamíferos, lo que sugiere un origen antiguo para las helicasas de caja DEAD en la inmunidad innata. DDX17 se une a una lista cada vez mayor de proteínas antimicrobianas DEAD-box que funcionan como sensores citoplasmáticos de ácidos nucleicos virales. Por ejemplo, DDX41 se une al ADN para controlar la inducción de IFN-I y citocinas proinflamatorias (Zhang, 2011). Además, DDX3 interactúa con IKK & epsilon y TBK-1 para regular la activación de IFN-I aguas abajo del reconocimiento del virus. Por el contrario, DDX17 es prescindible para la expresión de genes antivirales, lo que sugiere que DDX17 actúa independientemente del IFN-I, que es distinto de los genes antivirales DEAD-box previamente definidos (Moy, 2014).

Informes anteriores han propuesto que Rm62 y DDX17 regulan el ARNi, que es una vía antiviral bien caracterizada en invertebrados. En células de Drosophila, se ha demostrado que Rm62 se une a Ago2 y controla el silenciamiento mediado por ARNip (Ishizuka, 2002). Sobre la base de estos hallazgos, un estudio sugirió que las moscas con deficiencia de Rm62 infectadas con el virus Drosophila X (DXV) tienen una mayor mortalidad debido a un ARNi antiviral defectuoso (Zambon, 2006); sin embargo, este estudio no utilizó controles no infectados o del mismo hermano monitorear la replicación viral. En células de mamíferos, DDX5 y DDX17 se encuentran en el complejo microprocesador y regulan la biogénesis de miARN. Sin embargo, los datos actuales sugieren que Rm62 y DDX17 restringen la infección viral de una manera independiente de RNAi. Primero, se encontró que Rm62 controla la replicación de RVFV pero no VSV, SINV o DCV, virus que están restringidos por RNAi antivírico en moscas. En segundo lugar, no se ha encontrado que Rm62 controle el silenciamiento de ARN mediado por ARNip o miARN en cribados in vitro e in vivo más recientes, lo que se confirmó en experimentos actuales. En tercer lugar, no se cree generalmente que el ARNi restrinja la infección viral en células somáticas de mamíferos, mientras que su función antiviral en tipos de células de mamíferos embrionarios e indiferenciados puede estar activa. Por último, el agotamiento del componente del microprocesador Drosha, que puede actuar como un factor antiviral independiente del interferón, no afectó la infección por RVFV. Aunque puede haber una complejidad e interacción adicionales entre DDX17, la biología de miARN y la defensa antiviral, los datos actuales sugieren que la función antiviral de DDX17 es independiente de su papel en la biogénesis de miARN (Moy, 2014).

Los estudios de LIP-seq revelaron que DDX17 se asocia físicamente con el ARN viral para controlar la infección viral. Uno de los picos de unión a DDX17, correspondiente al IGR entre los genes N y NSs en el segmento S genómico, precipitó eficazmente DDX17 a partir de lisados ​​celulares. Curiosamente, esta región forma una horquilla extensa (Sabin, 2013), lo que sugiere que DDX17 puede reconocer bucles de tallo altamente estructurados en los ARN virales. Además, en las células infectadas, DDX17 forma puntos citoplasmáticos que se superponen con RVFV N. Esta relocalización en complejos de replicación viral puede permitir que DDX17 acceda y se una a elementos de ARN viral estructurado y, por lo tanto, limite la replicación (Moy, 2014).

De hecho, al expresar la horquilla RVFV de SINV (SINV-hp), se demostró que SINV se vuelve hipersensible a DDX17 tanto en células humanas como de insectos. Esto sugiere que la unión de DDX17 al ARN viral es suficiente para mediar su efecto antivírico. La forma en que esta unión limita la replicación viral queda por aclarar en estudios futuros. DDX17 puede asociarse con cofactores proteicos adicionales que median su función antiviral. Por ejemplo, se ha demostrado que DDX17 se une a Dcp2 y Dcp1a, que eliminan la tapa 5 'de los ARNm, y la exonucleasa Xrn1, que media la degradación del ARN 5' a 3 '. Curiosamente, un estudio reciente mostró que Drosophila Dcp2 restringe la infección por RVFV, aunque esto puede ser de manera indirecta al limitar el conjunto de sustratos de ARNm celular que RVFV utiliza para su propia replicación. DDX5 y DDX17 también se unen a componentes del exosoma de ARN, un complejo que cataliza la degradación del ARN de 3 'a 5'. En consecuencia, DDX17 puede actuar como el sensor que lleva los objetivos de ARN viral a la maquinaria de degradación del ARN, o puede desenrollar los ARN virales para facilitar la degradación. La maquinaria de descascarado, el exosoma y el DDX17 también se han relacionado con la proteína antiviral ZAP. Se sabe que ZAP restringe la replicación de SINV en células humanas, y este estudio encontró un efecto modesto del agotamiento de DDX17 en WT SINV, aunque este efecto no fue tan fuerte como con SINV-hp. Por el contrario, las moscas no codifican un homólogo de ZAP, y el silenciamiento de Rm62 no tuvo ningún impacto en la replicación de WT SINV en células de insecto. Como la restricción máxima de DDX17 de SINV dependía del bucle de tallo de RVFV en ambos tipos de células, la función antiviral de DDX17 en la infección por RVFV es probablemente independiente de ZAP y dependiente de la unión directa del ARN viral (Moy, 2014).

También es incierto por qué DDX17 se dirige específicamente a los ARN de bunyaviral, ya que las reglas que dirigen la actividad de unión de ARN de DDX17, así como las proteínas DEAD-box en general, son difíciles de descifrar. Se sospecha que la especificidad antiviral se deriva de una combinación de localización celular y estructuras de ARN específicas. Los datos sugieren que SINV y VSV no tienen las señales de focalización adecuadas. Además, se debe caracterizar la correlación entre el patrón de expresión de DDX17 y la patogénesis viral. El DDX17 se expresa de forma ubicua y no es inducido transcripcionalmente por IFN-I, y los datos sugieren que la localización subcelular pero no el nivel de expresión responde a la infección. Otros estudios permitirán una mejor definición de la regulación de DDX17 y explorarán la relación entre el tipo de tejido y la actividad antiviral (Moy, 2014).

Más allá de dilucidar las nuevas funciones de DDX17 en inmunidad, los datos revelan información importante sobre el mecanismo de reconocimiento de DDX17 para diversos ARN. Los datos sugieren que las proteínas DEAD-box son muy susceptibles al análisis CLIP-seq. Este estudio encontró que los objetivos de ARNm celular DDX17 están enriquecidos con elementos de repetición CT y CA, lo que sugiere que la secuencia primaria contribuye al reconocimiento del ARNm. Por el contrario, los pri-miARN unidos a DDX17 no se enriquecieron para este elemento ni para ninguna otra secuencia lineal, sino que DDX17 se localizó en el tallo del miARN, lo que sugiere que reconoce los pri-miARN a través de una estructura secundaria. Los pri-miARN unidos se compararon con otros dos estudios que monitorearon los miARN tras la pérdida de DDX17. Uno identificó 94 miARN que disminuyeron tras la pérdida de p72 en fibroblastos embrionarios de ratón que se derivan de 82 pre-miARN expresados ​​en células U2OS, de los cuales el 32% se unió directamente a DDX17 en los estudios actuales. Otro estudio identificó 317 miARN mal regulados por el agotamiento de DDX17 en células HaCaT de los 160 miARN unidos a DDX17 del estudio actual, 60 fueron analizados en sus células y 30 fueron regulados por DDX17 (50%). Además, el primer estudio identificó un motivo de secuencia en el segmento flanqueante 3 'de un subconjunto de pri-miRNA que se vieron afectados por los niveles de DDX17 ([GTA] CATC [CTA]), y se centró en miR-21, un miRNA que la corriente también identificada como vinculada por DDX17. El estudio anterior demostró mediante ensayos de unión in vitro que tanto el motivo como un bucle de tallo completo eran necesarios para la actividad de unión completa. En conjunto, estos datos sugieren que DDX17 reconoce el tallo pri-miRNA en el contexto de una cola 3 '. Esto sesgaría la unión de DDX17 a pri-miRNAs sobre pre-miRNAs porque alguna energía de unión adicional se derivaría de las regiones flanqueantes y facilitaría la unión de DDX17 a los bucles de tallo dentro de ARN más grandes como se encuentra en los ARN virales. En apoyo adicional de esto, el motivo de la secuencia ([GTA] CATC [CTA]) estaba sobrerrepresentado en los picos de ARNm del estudio actual, lo que sugiere que esta secuencia es de hecho un sitio de unión preferido para DDX17 en diversos ARN (Moy, 2014) .

En conclusión, estos datos revelan paralelismos sorprendentes entre el reconocimiento de DDX17 de pri-miRNA y de RNA virales: en ambos casos, DDX17 se dirige a un bucle de tallo estructurado, ya sea para facilitar el procesamiento de miRNA o para mediar en la inhibición del virus (Moy, 2014).

La ARN helicasa Rm62 coopera con Su (var) 3-9 para volver a silenciar la transcripción activa en Drosophila melanogaster

La expresión génica es muy dinámica y muchos genes muestran una amplia gama de expresión en varios órdenes de magnitud. Esta regulación suele estar mediada por factores de transcripción específicos de secuencia. Además, el empaquetado apretado del ADN en la cromatina puede proporcionar una capa adicional de control que da como resultado un rango dinámico de expresión génica que cubre varios órdenes de magnitud. Durante la activación transcripcional, las barreras de cromatina deben eliminarse para permitir una progresión eficiente de la ARN polimerasa. Esta estructura represiva de la cromatina debe restablecerse rápidamente después de que se haya activado para regular estrechamente la actividad génica. Este estudio muestra que la caja DExD / H que contiene ARN helicasa Rm62 está dirigida a un sitio de rápida inducción de la transcripción donde es responsable de un mayor grado de metilación en H3K9 en el locus de choque térmico después de la eliminación del estímulo de choque térmico. La ARN helicasa interactúa con la histona metiltransferasa Su (var) 3-9 bien caracterizada a través de su extremo N, que proporciona un mecanismo potencial para dirigir la metilación de H3K9 a genes altamente regulados. El reclutamiento de Su (var) 3-9 a través de la interacción con una helicasa de ARN en un sitio de transcripción activa podría ser un mecanismo general que permite un silenciamiento eficiente de genes altamente regulados, lo que permite que una célula ajuste su actividad génica en un amplio rango. (Boeke, 2011).

Este estudio ha identificado a Rm62 como un interactor con el extremo N de Su (var) 3-9. Curiosamente, este dominio de interacción se comparte entre Su (var) 3-9 y eIF2 & gamma y, por lo tanto, podría mediar la interacción entre Rm62 y ambas proteínas. Este estudio se centró en el análisis de la interacción nuclear de Rm62 y Su (var) 3-9, ya que parece ser importante para el cierre eficiente de genes altamente activados como el hsp70. De acuerdo con el papel previamente descrito de las modificaciones de histonas en el locus de choque térmico, se observó una fuerte metilación de H3K9 en el hsp70 gen antes de la activación del choque térmico que desaparece después del choque térmico y reaparece lentamente cuando las células se recuperan del choque térmico. Esta metilación depende en gran medida de la presencia de Rm62 ya que está fuertemente reducida en Rm62 cepas de moscas mutantes. La mutación Rm62 no solo conduce a una menor metilación de H3K9 en los loci de choque térmico, sino que también conduce a una reducción global de la marca H3K9me2 en la eucromatina. Esto sugiere un mecanismo generalizado de reclutamiento de metiltransferasa mediado por la interacción entre Rm62 y Su (var) 3-9 (Boeke, 2011).

Las modificaciones de histonas juegan un papel crucial en la regulación de la expresión génica. los hsp70 locus proporciona un promotor modelo excelente para cambiar rápidamente entre el estado activado y desactivado de la transcripción y se ha demostrado que está regulado en múltiples niveles, incluida la modificación de histonas. Uno de los factores que se reclutan para el promotor de choque térmico inmediatamente después de la activación es el Rm62, que este estudio identifica como un interactuante con la histona metiltransferasa Su (var) 3-9. A pesar de ser reclutado inmediatamente después del choque térmico, Rm62 desempeña un papel en el cierre de la transcripción después de la eliminación del choque térmico (Buszczak, 2006). Se ha sugerido que la actividad ARN helicasa es necesaria para la eliminación eficaz del ARN de su sitio de transcripción, lo que a su vez es importante para el resilencimiento del gen (Buszczak, 2006). Sin embargo, no se podía excluir un papel más directo en la generación del estado reprimido. Dado que se observó un fuerte reclutamiento dependiente de Rm62 de Su (var) 3-9 al promotor después del choque térmico que es importante para el restablecimiento de la cromatina metilada H3K9, se propone que la interacción entre las dos proteínas contribuye a la regeneración de una estructura represiva de la cromatina después del choque térmico. Buszczak observó una fosforilación prolongada de H3S10 en el hsp70 locus en moscas que portan una mutación en Rm62 que muy bien puede deberse a una falla en el reclutamiento de la metilación de Su (var) 3-9 y H3K9 en ausencia de Rm62. La fosforilación de H3S10 se ve gravemente afectada cuando el residuo vecino (H3K9) es metilado por Su (var) 3-9 in vitro. El reclutamiento de una metiltransferasa H3K9 a la hsp70 Por lo tanto, el gen después del choque térmico puede prevenir una fosforilación eficiente de H3S10 favoreciendo así el restablecimiento de una estructura de cromatina reprimida. Al mismo tiempo, el aumento del reclutamiento de una quinasa H3S10 podría prevenir una metilación prematura de K9 a través de las metiltransferasas reclutadas, lo que podría explicar la sorprendente diferencia cinética observada entre la unión de Su (var) 3-9 y la acumulación de histonas metiladas H3K9. Por lo tanto, estos hallazgos pueden proporcionar otro ejemplo de un interruptor de fosfo-metilo en el que se observa una fuerte interdependencia de la metilación de histonas y la fosforilación de histonas en residuos adyacentes. Alternativamente, la falta de metilación de histonas después del choque térmico que se ve por inmunofluorescencia y por ChIP podría deberse al hecho de que las histonas se eliminan por completo después del choque térmico y solo se vuelven a ensamblar durante la recuperación. En este caso, el reclutamiento de Su (var) 3-9 conduciría a un aumento de la concentración local de la metiltransferasa en el sitio del promotor, lo que podría (re) metilar las histonas expulsadas, lo que conduciría a la regeneración de un estado reprimido después del calor. choque. De hecho, esto también puede explicar el efecto aparentemente paradójico de la localización de HP1 en las bocanadas de choque térmico. Los datos de unión también podrían sugerir que el reclutamiento de Su (var) 3-9 es de hecho importante para la activación del gen, ya que se encuentra que se une al promotor inmediatamente después de la inducción de la transcripción. Sin embargo, esto es poco probable, ya que se observa un efecto de la eliminación de Su (var) 3-9 y Rm62 en el cierre de hsp70 transcripción pero no en su inducción (Boeke, 2011).

Una explicación alternativa para la aparente discrepancia entre la unión de Su (var) 3-9 y la metilación de H3K9 podría ser la necesidad de una señal adicional para que la enzima se active. Dicha señal podría ser una señal externa como una modificación postraduccional o una señal interna como el ARN transcrito de la hsp70 locus en sí. Inmediatamente después del choque térmico, se puede detectar una pequeña ráfaga de ARN pequeños que se liberan del locus del choque térmico. Teniendo en cuenta el hecho de que Rm62 también desempeña un papel en el silenciamiento mediado por ARNi (Csink, 2006), este pulso de ARN pequeños podría de hecho ser la causa del reclutamiento de Rm62 dependiente del choque térmico a la hsp70 locus que este estudio observó. Los datos sugieren que Su (var) 3-9 luego se recluta para el hsp70 locus a través de interacciones proteína-proteína donde metila las histonas que se ensamblan en el promotor durante la represión. Sin embargo, no se probó la posibilidad de que el ARN estimule la actividad de Su (var) 3-9, lo que también podría contribuir a la metilación retardada de las histonas (Boeke, 2011).

Por último, no se puede excluir que, además de Su (var) 3-9, se reclute una desmetilasa para hsp70 locus, que elimina la metilación de histonas de las histonas unidas al promotor. De hecho, el miembro de la familia jmjC dUTX, que contiene una demtilasa específica de H3K27, se asocia con la enzima ARN polII de alargamiento y se recluta para el hsp70 locus después del choque térmico. Es muy probable que múltiples mecanismos redundantes desempeñen un papel en el re-silenciamiento de la hsp70 genes después del choque térmico con todas las posibilidades discutidas anteriormente. A la luz del nuevo hallazgo de una interacción funcional entre Su (var) 3-9 y Rm62, será interesante investigar si esta interacción también puede proporcionar un vínculo mecanicista entre el cierre de genes altamente activos y el silenciamiento de elementos repetitivos del ADN. mediante la generación de transcripciones breves no traducidas que pueden ayudar a reclutar una histona metiltransferasa. Se ha demostrado que mecanismos similares operan en S. pombe pero hasta ahora no se han identificado en eucariotas superiores (Boeke, 2011).

Los espacios en blanco, un componente del complejo de unión de ARNsi / ARNdc nuclear, son necesarios para la espermiogénesis de Drosophila

Los ARN pequeños y una variedad diversa de proteínas asociadas controlan la expresión génica en eucariotas a través de una variedad de mecanismos. Mediante la combinación de cromatografía de afinidad de ARNip y espectrometría de masas, este estudio identificó los Blanks de proteína de dominio de unión de ARN bicatenario como una proteína de unión de ARNsi y ARNdc de células Drosophila S2. Los espacios en blanco son un factor nuclear que contribuye a la eficiencia de RNAi. El fraccionamiento bioquímico de un complejo que contiene Blanks muestra que el complejo Blanks es diferente a los complejos silenciadores inducidos por ARN descritos anteriormente y se asocia con la helicasa RM62 de DEAD-box, una proteína previamente implicada en el silenciamiento del ARN. En las moscas, Blanks se expresa en gran medida en los tejidos de los testículos y es necesario para la espermiogénesis posmeiótica, pero la pérdida de Blanks no se acompaña de una desrepresión de transposones detectable. En cambio, los genes relacionados con las vías de inmunidad innata se regulan positivamente en espacios en blanco testículos mutantes. Estos resultados revelan que los Blanks son un componente único de un complejo de unión de ARNip / ARNdc nuclear que contribuye a las vías esenciales relacionadas con el silenciamiento del ARN en la línea germinal masculina (Gerbasi, 2011).

La acumulación nuclear de ARNm de respuesta al estrés contribuye a la neurodegeneración causada por las repeticiones de rCGG de premutación de X frágil

El síndrome de ataxia / temblor asociado al cromosoma X frágil (FXTAS) es un trastorno neurodegenerativo que se observa en los portadores de la premutación del cromosoma X frágil. Estudios anteriores encontraron que las repeticiones de rCGG de X frágil son suficientes para causar neurodegeneración y que las proteínas de unión a la repetición de rCGG Pur alfa y hnRNP A2 / B1 pueden modular la toxicidad neuronal mediada por rCGG. Para explorar más el papel de Pur alfa en la neurodegeneración mediada por rCGG, se adoptó un enfoque proteómico y se identificaron más de 100 proteínas que interactúan con Pur alfa. De particular interés es Rm62, el ortólogo de Drosophila de p68 RNA helicasa, que podría modular la neurodegeneración mediada por rCGG. Este estudio muestra que las repeticiones de rCGG disminuyeron la expresión de Rm62 postranscripcionalmente, lo que condujo a la acumulación nuclear de la transcripción de Hsp70, así como a ARNm adicionales involucrados en el estrés y las respuestas inmunes. Juntos, estos hallazgos sugieren que la acumulación nuclear anormal de estos ARNm, probablemente como resultado de una exportación nuclear deteriorada, podría contribuir a la patogénesis de FXTAS (Qurashi, 2011).

Rm62, una helicasa de ARN de caja DEAD, se compleja con DSP1 en embriones de Drosophila

Dos clases principales de proteínas, el grupo Polycomb (PcG) y el grupo Trithorax (TrxG), juegan un papel clave en la regulación de los genes homeóticos. Estas proteínas actúan en complejos multiméricos para remodelar la cromatina. Una tercera clase de proteínas llamadas Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP) modula la actividad de TrxG y PcG, pero su función sigue siendo en gran parte desconocida. Una proteína similar a HMGB, DSP1 (Dorsal Switch Protein 1), se ha clasificado como ETP. Los estudios preliminares han revelado que DSP1 está involucrado en complejos multiméricos. Este estudio identificó una helicasa de ARN DEAD-box, Rm62, como socio de DSP1 en un complejo de 250 kDa. Los ensayos de coinmunoprecipitación realizados en extractos de embriones indican que DSP1 y Rm62 están asociados en embriones de 3 a 12 h. Además, DSP1 y Rm62 se colocalizan en cromosomas politénicos. De acuerdo con estos resultados, una mutación en Rm62 potencia una mutación nula de dsp1 y también mutaciones de trxG o PcG, lo que sugiere que Rm62 tiene características de ETP. Este estudio muestra que una ARN helicasa está involucrada en el mantenimiento de genes homeóticos (Lamiable, 2010).

Modificadores genéticos de dFMR1 codificar componentes de gránulos de ARN en Drosophila

Los mecanismos de localización y traducción del ARNm neuronal son de considerable interés biológico. La traducción de ARNm regulada espacialmente contribuye a las decisiones sobre el destino de las células y la guía de los axones durante el desarrollo, así como a la plasticidad sináptica a largo plazo en la edad adulta. La proteína Fragile-X Mental Retardation (FMRP / dFMR1) es una de las moléculas de control de la traducción neuronal mejor estudiadas y este estudio describe la identificación y caracterización temprana de proteínas que probablemente funcionen en la vía dFMR1. Inducción del dFMR1 en siete menosla expresión de células del ojo de Drosophila provoca un ojo desorganizado (rugoso) a través de un mecanismo que requiere los residuos necesarios para la función represora de traducción de dFMR1 / FMRP. Varias mutaciones en dco, orb2, pAbp, rm62, y smD3 genes suprimen predominantemente el sev-dfmr1 fenotipo de ojo rugoso, lo que sugiere que son necesarios para procesos mediados por dFMR1. Las proteínas codificadas se localizan en mRNP neuronales que contienen dFMR1 en neuritas de neuronas cultivadas y / o tienen un efecto sobre la ramificación dendrítica predicha para De buena fe represores traslacionales neuronales. Los análisis de mosaico genético indican que dco, orb2, rm62, smD3, y dfmr1 son prescindibles para la represión traslacional de escondido, un gen diana de microARN, conocido por ser reprimido en los discos de las alas por el gallito miARN. Por lo tanto, las proteínas codificadas pueden funcionar como reguladores de traducción específicos de miARN y / o ARNm. en vivo (Cziko, 2009).

Se sugiere, que en cuanto a los identificados previamente sev-dfmr1 supresores Ago1, Lgl y Me31b, análisis de proteínas PABP, Smd3, Rm62, Orb2 y Dco, codificadas por la sev-dfmr1 Los genes supresores identificados en este estudio ayudarán a dilucidar cómo funciona el dFMR1 en la regulación de la traducción, el direccionamiento y localización del ARN y la función de la vía del ncRNA (Cziko, 2009).

Tres líneas de evidencia indican que los genes identificados codifican proteínas con actividad represora traduccional. Primero, con la excepción de Dco, todas estas proteínas han estado implicadas previamente en algún aspecto del metabolismo del ARN y están presentes en gránulos neuríticos que contienen dFMR1 en los que el ARN es reprimido y transportado. En segundo lugar, el fenotipo de ojo áspero observado en sev-dfmr1 se ha relacionado con la capacidad de FMRP para reprimir la traducción de ARNm. Por tanto, se esperaría que el fenotipo se aliviara mediante mutaciones que reducen la eficacia de la represión traduccional. En tercer lugar, la sobreexpresión de Dco, Pabp, Orb2 o Rm62 inhibe el crecimiento dendrítico de neuronas, un fenotipo predicho para represores de traducción neuronales. Estas observaciones son consistentes con la idea de que la traducción de ARN en neuritas, que promueve la ramificación dendrítica, se inhibe por la sobreexpresión de Dco, Pabp, Orb2 o Rm62. Por tanto, los datos de interacción genética, la localización molecular y una prueba funcional en dendritas indican que Dco / Dbt, PABP, Rm62 o SmD3 funcionan como represores traslacionales neuronales (Cziko, 2009).

La identificación de varios genes que codifican factores de traducción canónicos como supresores de sev-dfmr1 destaca el hecho de que las moléculas de control de la traducción individuales funcionan en complejos multicomponente y, por lo tanto, tienen varias interacciones funcionales. La PABP es un ejemplo de una proteína que actualmente se cree que realiza dos funciones opuestas de control de la traducción. Además de su papel bien estudiado como activador de la traducción, PABP puede mediar en la represión de la traducción, p.ej., de ARNm de vasopresina, aunque el mecanismo exacto sigue sin estar claro. La observación de que los niveles reducidos o elevados de PABP también sugieren papeles duales en la activación y la represión, en la unión neuromuscular de Drosophila (NMJ). Además, PABP se asocia con partículas que contienen BC1, un ARN no codificante específico de neuronas con función represora traduccional, así como un complejo CYFIP-FMRP que puede funcionar como represor en algunos contextos pero como activador en otros. De manera similar, los homólogos de Orb2 (CPEB), aunque necesarios para la activación traduccional de ARNm que contienen CPE a través de la polimerasa poli-A, también permiten la represión traduccional en combinación con las proteínas Maskin o Cup (Cziko, 2009).

Fue algo sorprendente que SmD3, un factor de corte y empalme, fuera identificado en una pantalla de represores de traducción. Sin embargo, SmD3 tiene funciones adicionales de no empalme: en Caenorhabditis elegans, las proteínas Sm son necesarias para el ensamblaje de mRNP de células germinales y la localización del ARN. Este papel en la regulación traslacional y el ensamblaje de mRNP es más consistente con las funciones predichas por los experimentos genéticos (Cziko, 2009).

Rm62 / Dmp68 es un miembro de la familia de helicasa DEAD-box que se ha demostrado que está asociado con un complejo silenciador de ARNi que contiene dFMR1. También tiene funciones adicionales durante la transcripción y el procesamiento de ARNm, así como potencialmente en el procesamiento de miARN como parte del complejo Drosha. Con base en la evidencia bioquímica de la presencia de Rm62 en complejos que contienen FMRP, no es sorprendente que rm62 mutaciones muestran fuertes interacciones genéticas con dfmr1. Sin embargo, el mecanismo de supresión sigue siendo desconocido (Cziko, 2009).

Por último, Dco / Dbt es, con mucho, la proteína más esquiva en lo que respecta a su función potencial en la vía reguladora de la traducción. Dco / Dbt, una caseína quinasa I (CKI) es mejor conocida por la biología circadiana, donde fosforila Per y acelera su degradación. La proteína dFMR1 tiene varios sitios de fosforilación, uno de los cuales en las células S2 se ha demostrado que está fosforilado por una proteína CKII. Si bien el requisito funcional para la fosforilación de dFMR1 dependiente de CKI aún no se comprende, existe evidencia considerable de que el estado de fosforilación de FMRP puede determinar realmente su papel en la traducción. Los datos bioquímicos demuestran que la mayoría de FMRP en gránulos está en estado fosforilado, mientras que FMRP en la fracción polisoma está desfosforilada, lo que sugiere un mecanismo para cambiar el estado de un activador a un represor, y una función reguladora importante para las quinasas que fosforilan FMRP (Cziko, 2009) .

Otro vínculo potencial interesante entre las dos proteínas es la observación conductual de que los pacientes con retraso mental X frágil a menudo presentan alteraciones circadianas. Este ritmo circadiano alterado también está presente en la Drosophila. dfmr1 mutantes que modelan de manera útil el síndrome de X frágil (Cziko, 2009).

La identificación de estas proteínas como sev-dfmr1 modificadores ilustra las muchas funciones posiblemente reguladoras de las proteínas asociadas al ARN. Además, los datos que asocian Dco / Dbt con la regulación del ARN indican mecanismos novedosos e inexplorados de regulación del ARN en las neuronas (Cziko, 2009).

Dado que se cree que dFMR1 / FMRP funciona en la represión traduccional dependiente de miARN, fue de particular interés preguntar si estos interactuantes dFMR1 tenían algún papel en esta vía. Para abordar este problema, un sensible en vivo Se empleó un ensayo que utiliza un reportero fluorescente para revelar la fuerza de la represión traslacional a través de un endógeno (gallito) miARN. Cuando se combina con el análisis de mosaico genético, este ensayo se puede utilizar para estudiar mutaciones nulas en genes candidatos, siempre que las mutaciones no causen letalidad celular. El ensayo parece más sensible que los ensayos basados ​​en células que se utilizan habitualmente en base a la evidencia de un análisis previo de Me31B, cuyo requisito para la función de miARN, claramente visto en el en vivo ensayo, solo es evidente en los experimentos de doble eliminación en los ensayos de cultivo celular más comúnmente utilizados (Cziko, 2009).

En vivo experimentos no revelaron ningún requisito para el sev-dfmr1 las proteínas que interactúan Dco, Orb2, Rm62 y SmD3 en la represión de miARN. Por las razones explicadas anteriormente, es poco probable que esto refleje una debilidad en el ensayo experimental para la función de miARN. Una sorpresa mayor fue el hallazgo de que el propio dFMR1 parecía prescindible para la función de miARN. en vivo. Debido a que el alelo utilizado es un alelo nulo bien caracterizado, y la ausencia de dFMR1 en los clones mutantes se confirma mediante tinción de anticuerpos, la conclusión de que dFMR1 no es un componente central, esencial de la vía RISC / miARN es fuerte. Esta conclusión no es incompatible con ninguno de los datos existentes que muestran la asociación bioquímica entre RISC y FMRP y las interacciones genéticas entre Ago1 y FMRP. Sin embargo, también es consistente con observaciones recientes que indican la capacidad de prescindir de FMRP para la función RISC en células cultivadas. Se sugiere que la función de dFMR1 y, por extensión, FMRP puede estar restringida a un subconjunto de transcripciones, por ejemplo aquellas con UTR que contienen tanto motivos de unión de FMRP como elementos diana de miARN. De hecho, se han propuesto previamente modelos similares que explican la especificidad del ARNm de FMRP (Cziko, 2009).

Estos datos proporcionan una base sobre la cual diseñar más experimentos para comprender las funciones específicas de FMR1 y sus proteínas que interactúan en el control de la traducción (Cziko, 2009).

La maquinaria de interferencia del ARN influye en la organización nuclear de un aislante de cromatina

La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo de silenciamiento conservado que puede actuar mediante la alteración de la estructura de la cromatina. Los aislantes de cromatina promueven la organización nuclear de orden superior, estableciendo así dominios de ADN sujetos a distintos controles transcripcionales. Se presenta evidencia de una relación funcional entre RNAi y el aislante gitano de Drosophila. La actividad aislante disminuye cuando se mutan los genes Argonaute requeridos para el ARNi, y la función del aislante mejora cuando se reducen los niveles de la helicasa Rm62, involucrada en el silenciamiento mediado por ARN bicatenario (dsRNA) y la formación de heterocromatina. Rm62 interactúa físicamente con la proteína aislante de unión al ADN CP190 de una manera dependiente del ARN. Finalmente, la reducción de los niveles de Rm62 da como resultado una marcada reorganización nuclear de un aislante comprometido. Estos resultados sugieren que la maquinaria RNAi actúa como un modulador de la arquitectura nuclear capaz de efectuar cambios globales en la expresión génica (Lei, 2006).

Estos resultados sugieren la existencia de una especie de ARN requerida para la formación o integridad de los cuerpos aislantes, quizás un producto del procesamiento por Argonautes y la otra maquinaria de ARNi. La supuesta ARN helicasa Rm62 puede reclutarse en complejos aislantes a través de la interacción física con CP190 y ARN. Aunque se desconoce en qué etapa mecanicista actúa Rm62 en RNAi, Rm62 puede actuar aguas abajo de Argonautes para desenrollar o remodelar complejos de proteína aislante de ARN, interrumpiendo así la actividad del aislante gitano y la organización nuclear. La localización adecuada del cuerpo del aislante requiere una matriz nuclear intacta, y las primeras observaciones identificaron al ARN como un componente importante de este andamio nuclear. Los estudios futuros deberían determinar la identidad de los ARN asociados con el aislante gitano putativo. Estos resultados sugieren una función previamente desconocida de la maquinaria de ARNi en el control de la arquitectura nuclear para efectuar cambios en la expresión génica (Lei, 2006).

La helicasa de ARN de Drosophila P68 regula la desactivación transcripcional al promover la liberación de ARN de la cromatina

La terminación de la actividad de un gen requiere que las transcripciones preexistentes se maduren o se destruyan y que la estructura de la cromatina local vuelva a una configuración inactiva. Este estudio muestra que el homólogo de Drosophila de la helicasa de ARN P68 de mamífero juega un papel novedoso en la exportación de ARN y la desactivación de genes. Las mutaciones de p68 se asemejan fenotípicamente a mutaciones en cerdas pequeñas (sbr), el homólogo de Drosophila del factor de exportación de ARNm humano NXF1. Longitud total hsp70 El ARNm se acumula en el núcleo cerca de sus sitios de transcripción después del choque térmico de los homocigotos p68, y hsp70 la parada del gen se retrasa. Las larvas mutantes sin estrés muestran defectos similares en la acumulación de transcripciones y la represión de genes en diversos loci. Se encontró que las mutaciones de p68 eran alélicas de Lighten-up, un conocido supresor de la variación del efecto de posición. Estas observaciones revelan una fuerte conexión entre la eliminación de la transcripción y la represión de genes. Es posible que se necesite P68 para eliminar rápidamente las transcripciones de un gen antes de que su actividad pueda detenerse y su cromatina se restablezca a un estado inactivo (Buszczak, 2006).

p68 los animales mutantes desactivan los genes de forma lenta e incompleta. Estos incluyen los genes de respuesta temprana a la ecdisona regulados por el desarrollo. E74 y E75, Los genes de ADNr dentro del nucleolo y muchos otros genes activos que normalmente cesan la transcripción después del choque térmico, y los propios genes de respuesta al choque térmico durante la recuperación del estrés. Esta actividad genética prolongada en p68 los animales mutantes parecen ser normales en lo que respecta a la organización de la cromatina, la producción de ARN y el procesamiento de ARN. Por ejemplo, mucho después hsp70 los genes se han desconectado en animales de tipo salvaje, hsp70 genes en p68 los mutantes retienen altos niveles de modificación de H3phosS10, abundante factor de transcripción de HSF y ARN polimerasa II activa, y continúan incorporando Br-UTP en el ARN (Buszczak, 2006).

Estos experimentos descartan varias explicaciones potenciales para la actividad genética continua en p68 animales mutantes. En primer lugar, se ha propuesto el P68 de mamífero para facilitar el empalme desenrollando el emparejamiento de bases entre el ARN de U1 y la unión de empalme 5 '. Por lo tanto, los efectos sobre el cierre de genes podrían ser secundarios a un empalme incorrecto de los reguladores de cierre directo. Sin embargo, no se encontró evidencia de que Drosophila P68 afecta el empalme. El nivel de sin empalmar hsp83 las transcripciones no aumentaron más allá de un pequeño aumento atribuible a la transcripción en curso, ni E74 o E75 las transcripciones de genes se detectan en p68 mutantes. Genes que carecen de intrones como hsp70 se vieron afectados de la misma manera que los genes que contienen intrones. En segundo lugar, el P68 de mamífero ha sido implicado como un regulador transcripcional directo y puede participar en la activación de genes diana de p53 (Bates. 2005). Sin embargo, Drosophila Parece poco probable que P68 actúe como un activador transcripcional, porque los genes afectados eran diversos y no estaban relacionados en función (incluido el nucleolo), y estaban regulados al alza en lugar de regularse a la baja (Buszczak, 2006).

Una última posibilidad es que los efectos secundarios de p68 sobre fisiología nuclear retroalimentar y detener la desactivación de genes. Por ejemplo, el retraso en la producción de HSP70 causado por p68 La mutación podría ralentizar la activación del bucle de retroalimentación negativa mediante el cual se propone que las proteínas chaperonas, incluidas HSP70, HSP90 y HSP40, bloqueen normalmente la expresión génica inducida por choque térmico después de la eliminación del estrés. Sin embargo, parece muy poco probable que los diversos genes cuya desactivación depende de p68 La función, incluidos los genes de ADNr, los genes de respuesta a la ecdisona y los genes celulares reprimidos por el choque térmico, están sujetos a dicha regulación por retroalimentación. En cambio, la evidencia disponible sostiene fuertemente que P68 funciona directamente en el cierre de la actividad genética, y consistente con tal acción directa, se observó que la abundancia de P68 aumenta en los loci antes y durante el proceso de cierre (Buszczak, 2006).

Entonces, ¿cómo se relaciona un papel directo de P68 en el cierre del gen con la función adicional en la exportación de ARN observada para esta molécula? Pérdida de función p68 Las mutaciones dan como resultado defectos en las cerdas y en los ovarios similares a los observados en sbr mutantes, un componente conocido de la maquinaria de exportación de ARN. p68 los animales mutantes acumulan ARN en sitios de transcripción esparcidos en muchos lugares alrededor del genoma. Además, recién transcrito y procesado hsp70 las transcripciones se acumulan en el sitio de transcripción durante períodos prolongados, lo que provoca un retraso pronunciado en la traducción de HSP70. Estos hallazgos sugieren que P68 funciona en un paso muy temprano en la exportación de ARN, o en un paso nuevo antes de la exportación que se requiere para borrar las transcripciones completas de sus sitios de transcripción (Buszczak, 2006).

Durante la transcripción, varias proteínas que median el alargamiento de la transcripción, el procesamiento de ARN y la exportación de ARN recubren las transcripciones nacientes para formar grandes complejos de ribonucleoproteínas (mRNP). El trabajo en una variedad de organismos sugiere que el ensamblaje de estos mRNP se encuentra bajo estrictos controles de calidad. La interrupción del procesamiento del ARN o la asociación de factores de exportación con las transcripciones da como resultado la acumulación de ARN en los loci de genes y la activación de la vía de vigilancia del ARN. Las transcripciones defectuosas son el objetivo de la degradación por parte del exosoma, un complejo de ARNasa de múltiples subunidades conservado evolutivamente. El exosoma se asocia con factores de elongación y se localiza en genes transcritos activamente en Drosophila, lo que sugiere que las transcripciones se controlan constantemente para detectar defectos. Curiosamente, las mutaciones en el rrp6p El gen del exosoma no solo da como resultado la estabilización de los ARN, sino que también conduce a su liberación inadecuada de la cromatina. Estos resultados sugieren que el exosoma une las transcripciones a la cromatina y asegura que solo los ARN procesados ​​correctamente se liberen para la exportación. P68 puede funcionar interactuando con transcripciones nacientes de una manera que confiere competencia para que una transcripción abandone su sitio de síntesis y se transporte a los poros nucleares. Este paso sensible a P68 actuaría como un punto de control para la liberación final de una transcripción completa en el nucleoplasma (Buszczak, 2006).

Se favorece la idea de que el requisito de P68 para el cierre de genes puede explicarse por su papel propuesto como mediador de la liberación de transcripciones. Hay dos mecanismos generales por los cuales las transcripciones nacientes en el sitio de un gen activo pueden impedir la desactivación transcripcional. Primero, algunos cofactores transcripcionales que actúan positivamente se asocian con transcripciones nacientes en lugar de permanecer en regiones promotoras o potenciadoras. Los factores unidos a la transcripción permanecerían en concentraciones locales muy altas en relación con los que se disocian en el nucleoplasma antes de volver a unirse. Se esperaría que las transcripciones que contienen tales factores promuevan la actividad genética continua, como parte de un equilibrio de mecanismos de acción positiva y negativa que determinan la tasa instantánea de actividad transcripcional. Durante la represión, la liberación de ARN regulada al alza mediada por P68 disminuiría la concentración local de tales factores y ayudaría a cambiar el equilibrio hacia un estado que favorezca la desactivación de genes (Buszczak, 2006).

La actividad genética también está controlada por el estado de descondensación de la cromatina. La descondensación se correlaciona con altos niveles de acetilación de histonas y modificación de ADP-ribosa, y estas modificaciones deben revertirse para completar el cierre del gen. La presencia de mRNP voluminosos alrededor de un gen podría simplemente bloquear la cromatina para que no vuelva a ensamblarse en el estado altamente compacto característico de los genes inactivos. Las transcripciones y sus complejos proteicos asociados también podrían inhibir los procesos de remodelación de la cromatina debido a interacciones proteína-proteína específicas. El direccionamiento de P68 adicional a genes en el inicio de la desactivación del gen podría estimular la exportación de las transcripciones restantes que contrarrestarían el proceso de represión (Buszczak, 2006).

En ocasiones, varios genes dentro de una región cromosómica se desactivan de manera coordinada mediante el proceso de formación de heterocromatina. La habilidad de p68 estimular la desactivación de genes a través de la liberación de transcripciones puede desempeñar un papel en la formación de heterocromatina, así como en el cierre de genes individuales, porque p68 / Labio fue identificado previamente como un supresor de la variación del efecto de posición (Csink. 1994). Esto sugiere que la eliminación de la transcripción puede ser una parte importante de la formación y propagación de la heterocromatina. Se ha demostrado que la vía del ARNi facilita el silenciamiento heterocromático. Drosophila Se ha encontrado P68 en un complejo con Argonaute2, lo que sugiere que podría interactuar directamente con la maquinaria de ARNi (Ishizuka, 2002). Puede haber un vínculo mecanicista entre la función de P68 en el aclaramiento de la transcripción y de la vía del ARNi en la promoción del silenciamiento génico (Buszczak, 2006).

RNAi es una respuesta inmune antiviral contra un virus dsRNA en Drosophila melanogaster

Drosophila tiene un sistema inmunológico innato robusto y eficiente, que reacciona a infecciones que van desde bacterias a hongos y, como se descubrió recientemente, también a virus. Las respuestas inmunes conocidas de Drosophila se basan en actividades humorales y celulares, similares a las que se encuentran en el sistema inmunológico innato de otros animales. Recientemente, el ARNi o 'silenciamiento de ARN' ha surgido como un posible medio por el cual Drosophila puede reaccionar a patógenos específicos, transposones y elementos retrovirales, de una manera similar a la de un sistema inmune adaptativo tradicional de mamíferos en lugar de de una manera más generalizada y genómica. respuesta inmunitaria innata codificada. El ARNi es un mecanismo de defensa y regulación altamente conservado, que suprime la expresión génica a través de la degradación del ARN dirigida dirigida por ARNdc exógeno (escindido en ARNip) o miARN endógeno. En las plantas, se ha descubierto que el ARNi actúa como un sistema de respuesta inmune antiviral. Este estudio muestra que el ARNi es una respuesta antiviral utilizada por Drosophila para combatir la infección por el virus Drosophila X, un birnavirus, también. Además, múltiples genes de la vía del ARNi del núcleo, incluidos piwi, gen intrónico vasa (vig), berenjena (aub), armitage (armi), Rm62, r2d2 y Argonaute2 (AGO2) fueron identificados por tener roles vitales en esta respuesta en organismos completos. Estos hallazgos establecen a Drosophila como un modelo ideal para el estudio de las respuestas antivirales de ARNi en animales (Zambon, 2006).

Una proteína X frágil de Drosophila interactúa con componentes de ARNi y proteínas ribosómicas.

En Drosophila, Fmr1 se une y reprime la traducción de un ARNm que codifica la proteína Futsch asociada a microtubles. Se ha aislado un complejo asociado a Fmr1 que incluye dos proteínas ribosomales, L5 y L11, junto con ARN 5S. El complejo Fmr1 también contiene Argonaute2 (AGO2) y un homólogo de Drosophila de p68 ARN helicasa (Dmp68). AGO2 es un componente esencial para el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), un complejo de nucleasa específico de secuencia que media la interferencia de ARN (ARNi) en Drosophila. También se requiere Dmp68 para un ARNi eficiente. Fmr1 está asociado con Dicer, otro componente esencial de la vía de ARNi, y microARN (miARN) in vivo, lo que sugiere que Fmr1 es parte del aparato relacionado con ARNi. Estos hallazgos sugieren un modelo en el que las vías de control de la traducción mediadas por RNAi y Frm1 se cruzan en Drosophila. Los hallazgos también plantean la posibilidad de que los defectos en una maquinaria relacionada con el ARNi puedan causar enfermedades humanas (Ishizuka, 2002).

La identificación de AGO2 como una proteína que interactúa con Fmr1 es particularmente sorprendente. AGO2 es un miembro de la familia de genes Argonaute y es un componente esencial para el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), un complejo de nucleasa de secuencia específica que media el ARNi en Drosophila. Por tanto, el hallazgo de que Fmr1 forma un complejo in vivo con AGO2 sugiere que Fmr1 puede funcionar en RNAi. Para probar esto, se utilizó ARNi para suprimir las proteínas endógenas, como se había hecho anteriormente para establecer un papel para AGO2 en ARNi. La supresión de las proteínas ribosómicas L5 y L11 con dsRNA específicos enfermó tanto a las células S2 que no pudieron evaluarse sus funciones en el RNAi. Sin embargo, el tratamiento de células S2 con dsRNA homólogos a AGO2, Fmr1 o Dmp68 reduce notablemente los niveles de estas proteínas. La capacidad de estas células para realizar ARNi se probó mediante transfección con un plásmido de expresión de proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en combinación con un ARNdc de EGFP. La supresión de la expresión de AGO2 se correlaciona con una reducción pronunciada en la capacidad de las células para silenciar la EGFP informadora por RNAi. Curiosamente, el ARNi dirigido a Dmp68 da como resultado la inhibición de ARNi en las células S2. Estos resultados sugieren que la helicasa Dmp68 de DEAD-box no solo interactúa con Fmr1 sino que también es necesaria para un ARNi eficaz en las células S2. Dmp68 es un ortólogo de Drosophila de p68 humano, que se ha demostrado que desenrolla dsRNA cortos pero no largos de una manera dependiente de ATP. Se concluye que al menos dos de las proteínas que interactúan con Fmr1, AGO2 y Dmp68, son necesarias para el ARNi en células cultivadas de Drosophila S2. Por el contrario, el agotamiento de Fmr1 no pareció afectar el silenciamiento de EGFP. Por lo tanto, aunque Fmr1 interactúa fuertemente con AGO2 y Dmp68 in vivo, Fmr1 no parece ser esencial para un ARNi eficiente (Ishizuka, 2002).

Un trabajo reciente en numerosos organismos ha demostrado que el ARNi comparte características con un mecanismo regulador de genes del desarrollo que involucra miARN. Se cree que estos ARN pequeños (ARNip y miARN) se incorporan en complejos silenciadores que median la destrucción del ARNm durante el ARNi y el control de la traducción durante el desarrollo, respectivamente. Por lo tanto, se sugiere que una maquinaria de procesamiento común genera ARN guía que median tanto la iARN como la regulación de genes endógenos. AGO2 y Dmp68 son esenciales para RNAi en Drosophila. Sin embargo, Fmr1 parece ser un represor de la traducción. Debido a que Fmr1 interactúa con AGO2 y Dmp68 in vivo, fue de interés examinar si Fmr1 también está presente en un complejo asociado a AGO2 y / o Dmp68. Para hacer esto, AGO2 marcado con TAP (AGO2-TAP) o Dmp68 (Dmp68-TAP) se expresaron en células S2. Se preparó lisado citoplasmático de las células que expresan AGO2-TAP o Dmp68-TAP y se sometió a purificaciones con TAP. En ensayos recíprocos, se encontró que Fmr1 y AGO2 endógenos se asociaban entre sí. Además, se copurificó AGO2 endógeno con AGO2-TAP. También se encontró que Fmr1 y AGO2 endógenos estaban presentes en el complejo asociado a Dmp68. Debido a que AGO2 puede coinmunoprecipitarse con Dicer, que inicia RNAi procesando los activadores de silenciamiento de dsRNA en siRNA, y también procesando precursores de miRNA en miRNA maduros, se consideró la posibilidad de que Fmr1 también pudiera interactuar físicamente con Dicer. De hecho, Dicer endógeno se puede copurificar no solo con AGO2-TAP sino también con Fmr1-TAP, y también se demostró que Fmr1 permanece asociado con AGO2 después de la inducción de ARNi. Está bien establecido que los ARNip se asocian con AGO2 durante el ARNi en las células S2. Por lo tanto, estos resultados indican que Fmr1 puede ser parte de RISC. Por último, de forma análoga al complejo asociado al ortólogo de AGO2 humano (eIF2C2) que contiene una helicasa de ARN de tipo DEAD-box y miARN, fue de interés probar si los miARN también se encuentran en los complejos asociados a AGO2 y / o Fmr1. Se recuperaron moléculas de ARN copurificadas con AGO2-TAP o Fmr1-TAP, se disolvieron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 15% y se sometieron a análisis de transferencia Northern. Un miARN conocido, miR-2b, en células de Drosophila S2 podría detectarse tanto en los complejos asociados con AGO2 como con Fmr1. Juntos, estos datos muestran que Fmr1 está presente en un complejo con componentes de ARNi y miARN en células cultivadas de Drosophila S2 (Ishizuka, 2002).

Se cree que Fmr1 tiene funciones importantes en la traducción de algunos ARNm específicos, como el ARNm de futsch. Aunque no está claro cómo Fmr1 regula la traducción de tales ARNm, estos hallazgos pueden contener algunas pistas.Debido a que Fmr1 interactúa con el ARNr ribosómico L5 / 5S y L11, todos los cuales están ubicados en la parte superior de la subunidad ribosómica 60S, es probable que esta interacción lleve a Fmr1 a la subunidad ribosómica 60S. Por tanto, la asociación de Fmr1 con la subunidad ribosómica 60S a través de interacciones directas con el rRNA ribosómico L5 / 5S y L11 puede inhibir la traducción al impedir el ensamblaje de complejos de iniciación o al dar lugar a un cambio estructural de los ribosomas, que, a su vez, influye en un paso (s) después del inicio de la traducción. Alternativamente, debido a que el ARNr 5S es la única especie de ARN conocida que se une a proteínas ribosómicas, incluida la L5, y forma un RNP 5S antes de incorporarse a los ribosomas, Fmr1 puede interactuar con el RNP 5S citoplasmático no asociado a ribosomas, lo que, a su vez, influye la formación de la subunidad ribosómica madura 60S. Es interesante observar en este contexto que solo aproximadamente la mitad de las moléculas de ARNr 5S en células de mamíferos están asociadas con la subunidad ribosómica 60S y que aunque el ARNr 5S mejora la actividad ribosómica, no es absolutamente esencial para ello (Ishizuka, 2002).

Fmr1 está presente en un complejo aislado de células S2, que también contiene AGO2 y Dicer. AGO2 y Dicer son componentes esenciales de RNAi. La interacción entre Fmr1 y AGO2 permanece constante antes y después de la inducción de RNAi, lo que sugiere que Fmr1 es parte de RISC durante RNAi. Sin embargo, no hay evidencia que apoye la noción de que la formación de RISC sea inducida por el tratamiento de células S2 con dsRNA. Como una de las funciones del aparato de RNAi es silenciar los transposones y las secuencias repetitivas que residen naturalmente en el genoma de Drosophila, es probable que estas células estén llenas de complejos RISC preformados, independientemente del tratamiento con dsRNA. Por lo tanto, es posible que Fmr1 sea parte de los complejos RISC preformados y siga siendo parte del RISC activo después de que el ARNip dependiente de ATP se desenrolle (Ishizuka, 2002).

La participación de otra proteína que interactúa con Fmr1, Dmp68, en RNAi sugiere además la estrecha asociación de Fmr1 con RNAi. La helicasa de ARN p68 se identificó por primera vez por reacción cruzada con un anticuerpo monoclonal que se generó originalmente contra el antígeno T grande de SV40 hace dos décadas. La helicasa juega un papel importante en la proliferación celular y la maduración de órganos y pertenece a una gran familia de proteínas altamente conservadas evolutivamente, la denominada familia DEAD-box de ATPasas y helicasas putativas. Estudios recientes han revelado que varias helicasas de ARN, incluidas mut6, SDE3, mut14, drh-1 y spindle-E, son necesarias para el ARNi y las vías de silenciamiento génico postranscripcional relacionadas (PTGS). Dmp68 es similar, pero claramente no un ortólogo de estas proteínas. Por tanto, Dmp68 es un componente novedoso de RNAi. Debido a que el desenrollamiento dependiente de ATP del dúplex de ARNip remodela el RISC para generar un RISC activo en la vía del ARNi, Dmp68 puede mediar en el proceso de desenrollado. También es concebible que Dmp68 pueda estar involucrado en eventos posteriores como el reconocimiento de ARN diana, como un acompañante de ARN o una RNPasa (Ishizuka, 2002).

La conexión que se ha establecido entre Fmr1, componentes de ARNi, miARN y la maquinaria de traducción general es de considerable importancia porque proporcionan pistas intrigantes y posibles conexiones a la función de Fmr1 y las vías con las que puede cruzarse. Un trabajo reciente en numerosos organismos ha demostrado que el ARNi comparte características con un mecanismo regulador de genes del desarrollo que involucra miARN. Por ejemplo, Dicer procesa tanto los dsRNA extraños que desencadenan el RNAi como los precursores de miRNA endógenos que funcionan en el desarrollo en pequeños RNA. Los miembros de la familia de genes Argonaute también están involucrados en las rutas de ARNip y miARN. En C. elegans, Dicer, la proteína de unión a dsRNA RDE-4 y una helicasa de RNA de caja DExH conservada (DRH-1) están en un complejo con RDE-1, un ortólogo de AGO2. Además, el ortólogo de AGO2 humano, eIF2C2, está en un complejo, el miRNP, que contiene la helicasa de ARN DEAD-box Gem3. Por lo tanto, las proteínas Argonaute parecen estar en un complejo que contiene una (s) helicasa (s) de ARN, Dicer y ARN guía pequeños, y funcionan en una variedad de mecanismos dependientes de la homología que implican el apareamiento de bases entre ARN guía pequeños y ARNm diana. Los hallazgos de que Fmr1 interactúa con AGO2, Dmp68, Dicer, miARN y la maquinaria de traducción general, proporcionan un medio para vincular las enzimas ARNi a las vías de control de la traducción, y también son consistentes con el hecho de que la nucleasa RISC se fracciona con los ribosomas (Ishizuka, 2002). ).

Parece que Fmr1 es importante para el control de la traducción, posiblemente mediado por componentes relacionados con ARNi y miARN. Aunque estudios recientes han identificado una lista de ARNm que son posibles objetivos de FMRP, estos resultados sugieren además un modelo en el que FMRP puede no unirse directamente a sus objetivos de ARNm, sino que está dirigido a sus sustratos de ARNm como parte del aparato relacionado con el ARNi, que son guiado por miARN. Entonces, ¿cómo podría FMRP regular la traducción de sus objetivos de ARNm? En el caso de lin-4, un prototipo de miARN, sus dianas de ARNm (lin-14 y lin-28) están reprimidas traduccionalmente pero permanecen asociadas con polirribosomas, lo que sugiere un bloqueo en un paso después del inicio de la traducción. FMRP puede formar un complejo miRNP en sus dianas de ARNm y la asociación de este complejo con ARNr L5 / 5S ribosómico y L11 puede inhibir la traducción en uno o más pasos posteriores a la iniciación, incluyendo elongación, terminación o liberación de proteína funcional como se discutió anteriormente. Finalmente, se propone que el síndrome de X frágil puede ser el resultado de una anomalía en la síntesis de proteínas causada por un defecto o defectos en un aparato relacionado con el ARNi (Ishizuka, 2002).

El gen Lighten up (Lip) de Drosophila melanogaster, un modificador de la expresión de retroelementos, la variación del efecto de posición y los alelos de inserción del locus blanco

Este estudio se dirigió a identificar mutaciones de un solo gen que están involucradas en la regulación de la dosis de acción trans para comprender mejor el papel de dichos genes en los síndromes aneuploides, varios tipos de compensación de dosis, así como en los mecanismos reguladores. El gen Lighten up (Lip) en Drosophila melanogaster se identificó en una pantalla mutagénica para detectar modificadores dominantes de segundo sitio de sangre blanca, un alelo inducido por retrotransposón del locus del color de ojos blancos. Lip realza específicamente el fenotipo de wbl así como un subconjunto de otros alelos de inserción de retroelementos de blanco, incluido el alelo inducido por copia, albaricoque blanco (wa)y seis alelos causados ​​por la inserción de elementos I. Se identificaron seis alelos de Lip que son todos letales recesivos, aunque se recuperaron escapes heteroalélicos fenotípicamente aditivos en algunas combinaciones. El labio también suprime la variación del efecto de posición, lo que indica que puede tener un papel en la configuración de la cromatina. Además, Lip modifica la abundancia total de transcripciones tanto de la sangre como de los retrotransposones de copia, lo que tiene un efecto inverso sobre el nivel de estado estable de las transcripciones de sangre, mientras que muestra un efecto no aditivo sobre la copia de ARN (Csink, 1994). Funciones de los ortólogos Rm62 en otras especies

La proteína DEAD box p68: un nuevo coactivador transcripcional del supresor de tumores p53

La helicasa de ARN de la caja DEAD, p68, se ha implicado en varios procesos celulares y se ha demostrado que posee una función coactivadora transcripcional. Este estudio muestra que la p68 tiene una potente sinergia con la proteína supresora de tumores p53 para estimular la transcripción de los promotores dependientes de p53 y que p68 y p53 endógenas se inmunoprecipitan conjuntamente a partir de extractos nucleares. Sorprendentemente, la supresión de p68 por ARNi inhibe la expresión del gen diana de p53 en respuesta al daño del ADN, así como la apoptosis dependiente de p53, pero no influye en la estabilización de p53 ni en la expresión de genes que no responden a p53. La inmunoprecipitación de cromatina demostró que p68 se recluta en el promotor p21 de una manera dependiente de p53, de acuerdo con un papel en la promoción del inicio de la transcripción. Curiosamente, la eliminación de p68 no afecta significativamente la activación de NF-kappaB, lo que sugiere que la estimulación de la actividad transcripcional de p53 no se debe a un efecto de transcripción general. Este estudio representa el primer informe de la participación de una helicasa de ARN en la respuesta de p53 y destaca un mecanismo novedoso por el cual p68 puede actuar como un cosupresor tumoral en el gobierno de la actividad transcripcional de p53 (Bates, 2005).

Mediación del aislamiento transcripcional de CTCF por la proteína de unión a ARN p68 de DEAD-box y el activador de ARN del receptor de esteroides SRA

El factor de unión a CCCTC (CTCF) es una proteína de unión al ADN que desempeña un papel importante en la organización de la cromatina, aunque no se comprende completamente el mecanismo por el cual CTCF lleva a cabo estas funciones. Estudios recientes muestran que CTCF recluta el complejo de cohesina en los sitios de los aisladores y que la cohesina es necesaria para la actividad del aislante. Este estudio muestra que la helicasa p68 de ARN DEAD-box (DDX5) y su ARN no codificante asociado, el activador de ARN del receptor de esteroides (SRA), forman un complejo con CTCF que es esencial para la función aislante. Se detectó p68 en sitios CTCF en la región de control impresa IGF2 / H19 (ICR) así como en otros sitios CTCF genómicos. El agotamiento in vivo de SRA o p68 redujo la actividad aislante mediada por CTCF en el ICR de IGF2 / H19, aumentaron los niveles de expresión de IGF2 y aumentaron las interacciones entre el potenciador endodérmico y el promotor de IGF2. p68 / SRA también interactúa con miembros del complejo de cohesina. El agotamiento de p68 o SRA no afecta la unión de CTCF a sus sitios genómicos, pero reduce la unión de cohesina. Los resultados sugieren que p68 / SRA estabiliza la interacción de la cohesina con CTCF al unirse a ambos, y es necesaria para una función aislante adecuada (Yao, 2010).

Bates, G. J., Nicol, S. M., Wilson, B. J., Jacobs, A. M., Bourdon, J. C., Wardrop, J., Gregory, D. J., Lane, D. P., Perkins, N. D. y Fuller-Pace, F. V. (2005). La proteína de caja DEAD p68: un nuevo coactivador transcripcional del supresor de tumores p53. EMBO J 24: 543-553. ID de PubMed: 15660129

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Cómo deducir si una infección por virus de ARN o una infección por virus de ADN - Biología

NKX3.1 codifica un factor de transcripción homeodominio cuya expresión está restringida en gran medida a la próstata y controlada por andrógenos. El gen se encuentra en el cromosoma 8p21 en una región frecuentemente eliminada en los cánceres de próstata tempranos (revisado en 1, 2). Los estudios en ratones knockout para Nkx3.1 han proporcionado evidencia convincente de que Nkx3.1 es un supresor de tumores de próstata 3 & # x2013 5. Estos ratones desarrollan neoplasia intraepitelial prostática (PIN), una lesión precancerosa caracterizada por la hiperproliferación de células displásicas, lo que indica que Nkx3.1 es haploinsuficiente para la supresión de PIN 6. Estudios adicionales demostraron que el paso en serie de lesiones similares a PIN de ratones mutantes Nkx3.1 puede sufrir alteraciones histopatológicas progresivamente graves 5. Finalmente, la pérdida de Nkx3.1 puede cooperar con la pérdida de Pten y p27 en el desarrollo del cáncer de próstata en ratones 7, 8, mientras que la sobreexpresión de Nkx3.1 inhibe la proliferación celular en injertos epiteliales nulos de Pten 9. Estos datos indican que la expresión disminuida de NKX3.1 que se observa con frecuencia en los cánceres de próstata humanos 10 está implicada en la etapa inicial de la carcinogénesis de próstata. Si bien la función supresora de tumores de NKX3.1 permanece mal definida a nivel molecular, los fenotipos knockout sugirieron que Nkx3.1 controla los genes involucrados en el desarrollo, diferenciación y mantenimiento de la integridad de los tejidos de la próstata.

Al igual que otras homeoproteínas de la clase NKX, NKX3.1 puede funcionar como un represor transcripcional al unirse a un motivo de ADN de homeodominio no canónico, como el que ocurre naturalmente en el promotor del receptor de andrógenos de ratón 9 o se presenta artificialmente en genes reporteros sintéticos 11. La represión transcripcional puede implicar el reclutamiento mediado por NKX3.1 de correpresores 12 y la histona desacetilasa, HDAC1 9. Un segundo modo de trans-represión encontrado para el gen del antígeno prostático específico (PSA) ocurre independientemente de los sitios de unión del promotor NKX3.1, pero a través de la interacción represiva con activadores transcripcionales como SP1 13 y el factor ETS derivado de la próstata (PDEF 14). También se demostró que NKX3.1 activa la transcripción génica, ya sea mediante la unión directa del promotor como en el caso de PCAN1 y HK2 15, 16 o mediante la interacción con otros activadores transcripcionales como el factor de respuesta sérica (SRF) o FoxA1 y el receptor de andrógenos (AR ) 17, 18.

El perfil transcriptómico combinado con el mapeo global de & gt 9.500 sitios de unión genómica por secuenciación de ChIP reveló un conjunto de 282 genes diana directos putativos que se expresaron diferencialmente en próstatas jóvenes NKX3.1 - / - que no mostraban PIN 16, 19. Un subconjunto de genes diana NKX3.1 también fue regulado por Myc con ambos factores de transcripción mostrando antagonismo mutuo [16]. Dado que la sobreexpresión de Myc coopera con la pérdida de Nkx3.1 en la tumorigénesis de próstata de ratón, el mantenimiento de un control adecuado de los genes diana Nkx3.1 / Myc comunes puede estar implicado en la función supresora de tumores de Nkx3.1 & # x2019s 16. Un estudio similar en ratones de edad avanzada que ya mostraban PIN reveló una firma de expresión genética indicativa de una respuesta deteriorada al estrés oxidativo 20. Curiosamente, estos cambios se correlacionaron con un aumento de 5 veces en el daño oxidativo del ADN en próstatas Nkx3.1 - / -. Se desconoce si el daño oxidativo del ADN es una consecuencia directa de la pérdida de NKX3.1 o una consecuencia secundaria del desarrollo de PIN.

Otra clave para comprender la función supresora de tumores de NKX3.1 reside potencialmente en sus socios de interacción de proteínas. Se han descrito varios que modulan los efectos transcripcionales de NKX3.1 & # x2019s (por ejemplo, SRF 17, 21, PDEF 14, HDAC1 9, SP1 13, MYC 16 y AR 18). Además, se demostró que NKX3.1 se une y aumenta la actividad de la topoisomerasa I, lo que sugiere que funciona en la reparación del ADN 22, 23. NKX3.1 se localiza en los sitios de daño del ADN, promueve la actividad ATM y ATR y mejora la supervivencia de las células expuestas al daño del ADN 24. La pérdida de la función de NKX3.1 en las células prostáticas premalignas puede, por tanto, acelerar la adquisición de daño en el ADN, potencialmente agravado por la acumulación constante de especies reactivas de oxígeno promoviendo así la transformación celular 24. Sin embargo, actualmente no está claro si la función de NKX3.1 en la reparación del ADN está mediada indirectamente a través de efectos transcripcionales o directamente a través de interacciones físicas con la maquinaria de reparación del ADN.

En este informe, presentamos un análisis del interactoma de la proteína NKX3.1 que reveló vínculos físicos íntimos de NKX3.1 con la maquinaria de reparación del ADN, a saber, componentes del holocomplejo de la proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PK) (XRCC5 / Ku80, XRCC6 / Ku70) y poli (ADP) ribosa polimerasa (PARP1). Además, el perfil transcriptómico de las células epiteliales prostáticas inmortalizadas tras la activación aguda de NKX3.1 reveló una respuesta transcripcional rápida y compleja que es una imagen casi especular de la firma de expresión génica del PIN humano desprovisto de NKX3.1. En conjunto, estos datos arrojan nueva luz sobre la elusiva actividad supresora de tumores de NKX3.1, lo que implica directamente a esta homeoproteína en la reparación del ADN y en la conducción de una firma de expresión génica indicativa de una función esencial en el mantenimiento del estado de diferenciación de las células epiteliales de la próstata luminal.

Materiales y métodos Cultivo de tejidos, plásmidos, virus, anticuerpos

La línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP se obtuvo de ATCC y se mantuvo en RPMI 1640 (Hyclone, Cat. # SH30027.01) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma, Cat. # F6178-500ML), 50 unidades / ml de penicilina, y 50 unidades / ml de estreptomicina (Thermo Scientific HyClone, nº de cat. SV30010). El ADNc de NKX3.1 se amplificó a partir del ARNm de LNCaP, se confirmó la secuencia y se clonó en pFLAG uniendo así tres etiquetas de epítopo FLAG consecutivas al extremo N-terminal. Para la transfección de ADN, las células LNCaP se cultivaron hasta un 50% de confluencia en una placa de 150 mm y se transfectaron con 30% de ADN plasmídico usando reactivo DOTAP de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Roche, Indianapolis, IN). Las células epiteliales de próstata humana inmortalizadas (células LH, amablemente proporcionadas por el Dr. W. Hahn 25) se mantuvieron en medios basales de células epiteliales de próstata (Lonza, n.o de cat. CC-3165), incluidos factores de crecimiento, citocinas y suplementos (PREGM Singlequots, Lonza , Cat. # CC-4177).

Para la producción de adenovirus, se utilizó el sistema ADEASY como se describió anteriormente 26. El ADNc de NKX3.1 se clonó en el vector lanzadera pADTRACK1. El plásmido resultante se transformó en células BJ-ADEASY mediante electroporación. El ADN adenoviral generado por recombinación en células BJ-ADEASY se aisló y se transfectó en células 293 (ATCC) usando procedimientos estándar de fosfato cálcico. El virus se recogió de las células y se amplificó mediante la infección de células 293. El virus amplificado se tituló y se utilizó en una multiplicidad de infección de

Se utilizaron los siguientes anticuerpos: monoclonal de ratón Flag (Sigma-Aldrich Cat # F1804, RRID: AB_262044), monoclonal de ratón NKX3.1 para inmunotransferencia (Invitrogen Cat # 35-9700, RRID: AB_138690), policlonal de cabra anti-NKX3.1 humano (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat # sc-15022, RRID: AB_650285) para inmunoprecipitación, GFP monoclonal de ratón (Clontech Cat # 632380, RRID: AB_10013427), actina monoclonal de ratón (MP Biomedicals, Irvine, CA, Cat. # ICN691001) , Policlonal de conejo BANF (EMD Millipore Cat # 09-893, RRID: AB_1977041), monoclonal de ratón Ku70 (GeneTex Cat # GTX23114, RRID: AB_367103), monoclonal de ratón Ku80 (GeneTex Cat # GTX72225, RRID: AB_383445), policlonal de conejo MYC ( Epitomics Cat # 1472-1, RRID: AB_562270), monoclonal de conejo p21 (Cell Signaling Technology Cat # 2947S, RRID: AB_823586), policlonal de conejo HSPA8 (Sigma-Aldrich Cat # SAB2101098, RRID: AB_10604580), monoclonal de ratón PARP (BD Biosciences Cat # 556494, RRID: AB_396433), policlonal de conejo HOXB13 (Invitrogen Cat # 422500, RRID: AB_1500227).

Purificación por afinidad FLAG-NKX3.1

Las células de una placa de 150 mm transfectadas con pFLAF-NKX3.1 o vector vacío se lisaron en cada 1 ml de tampón de lisis IP (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X 100 al 1%) en hielo. Por purificación por afinidad, se acoplaron 4 & # x00b5g de anticuerpo FLAG M2 (Sigma-Aldrich Cat # F1804, RRID: AB_262044) a 50 & # x03bcl perlas magnéticas en trietanolamina 0,2 M, pH 8,2 y dimetil pimelimidato 20 mM con mezcla rotacional a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se detuvo resuspendiendo las perlas en 1 ml de Tris 50 mM, pH 7,5 durante 15 min. Después de cinco lavados en tampón de lisis IP, las perlas se añadieron al lisado celular. Tras la incubación durante 4 ha 4 ° C, el lisado se retiró y se almacenó como lisados ​​empobrecidos a -20 ° C, mientras que las perlas se lavaron 5 veces con 1 ml de tampón de lisis IP. Después del lavado final, las perlas se resuspendieron en 50 & # x00b5l de tampón de elución (5 & # x00b5g de péptido triple FLAG en PBS) y se incubaron a 4 & # x00b0C durante 30 minutos con agitación en vórtex. La muestra se analizó mediante inmunotransferencia (10%), tinción de plata (2%) y LC-MS / MS (88%).

Cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS)

El análisis LC-MS / MS de los complejos FLAG-NKX3.1 purificados por afinidad se realizó como se describió previamente en detalle 27, 28. En resumen, los eluidos se digirieron en solución con tripsina y los péptidos se separaron mediante cromatografía de fase inversa. Los péptidos se analizaron en un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific San José, CA). El método MS / MS dependía de los 4 datos principales. Se habilitó la exclusión dinámica. Los datos se buscaron en una base de datos de proteínas humanas con índice internacional de proteínas (IPI) utilizando Sorcerer-SEQUEST (SageN Research Milpitas, CA).

Análisis semicuantitativos mediante recuento espectral

Los recuentos espectrales son el número de veces que un péptido ionizado es seleccionado por el espectrómetro de masas para MS / MS, en el modo dependiente de datos y proporcionan estimaciones semicuantitativas ampliamente aceptadas de la abundancia relativa de proteínas 29. QTools, que son macros básicas visuales desarrolladas internamente (disponibles en: www.dieter-wolf-lab.org/protocols) para el análisis de conteo espectral automatizado, se utilizaron para calcular los conteos espectrales de las proteínas, utilizando la salida de PeptideProphet de la trans. -tubo proteómico (TPP Institute for Systems Biology, Seattle, WA 30).

Filtrado de proteínas posterior a la identificación

Las purificaciones de FLAG-NKX3.1 se realizaron por cuadriplicado (es decir, 4 réplicas biológicas), comenzando cada vez con un nuevo lote de células. En total, ocho muestras de purificaciones por afinidad (cuadriplicados de simulacro y FLAG-NKX3.1) se analizaron repetidamente (3 veces por muestra, es decir, 3 réplicas técnicas de cada muestra) por LC-MS / MS para un total de 24 LC-MS / MS carreras.

En total, identificamos 315 proteínas humanas (conjunto de datos 1A). Para compilar un interactoma de proteína NKX3.1 de alta confianza, primero realizamos una resta de fondo, es decir, el recuento de espectro obtenido para cada proteína en las purificaciones simuladas se restó del recuento de espectro obtenido para esa misma proteína en la purificación de FLAG-NKX3.1 correspondiente. (Conjunto de datos 1B). A continuación, se sumaron los recuentos espectrales restados de las 4 purificaciones independientes. Si se obtuvieron valores negativos después de la suma (es decir, si una proteína fue consistentemente más abundante en la purificación simulada que en la purificación FLAG-NKX3.1), se descartó la proteína. Esto dio como resultado una lista de 250 proteínas con un recuento de espectro promedio de 9,94 (conjunto de datos 1B). De esta lista de datos sustraídos de fondo, eliminamos todas las proteínas con recuentos de espectro por debajo del promedio (& # x2264 10) para excluir proteínas de baja abundancia potencialmente asociadas no específicamente con NKX3.1. Esto dio como resultado una lista de 71 proteínas de fondo sustraídas y filtradas en abundancia. En el siguiente paso, colapsamos las entradas de la base de datos de proteínas redundantes (que a menudo resultan de múltiples isoformas de proteínas que no fueron distinguidas por los péptidos identificados por LC-MS / MS) en entradas únicas agregando sus recuentos de espectro tanto en las purificaciones simuladas como NKX3.1 . Esto resultó en una lista no redundante de 58 proteínas, a las que nos referimos como el interactoma de alta confianza (conjunto de datos 1B).

Dado que los recuentos del espectro dependen del tamaño de la proteína (las proteínas más grandes dan lugar a más péptidos trípticos), normalizamos los recuentos del espectro a los pesos moleculares de las proteínas, que previamente hemos descubierto que es un método apropiado de normalización 31. Los números de recuento de espectro normalizados sumados de todas las proteínas no redundantes se utilizaron para ensamblar la lista final sustraída de fondo de 58 proteínas que interactúan con NKX3.1 (denominadas Sum NKX3.1 & # x2013 Mock). Los números de recuento de espectro normalizados sumados también se usaron para determinar el enriquecimiento de una proteína en la muestra NKX3.1 sobre la simulación (Suma NKX3.1 / Mock). Ambas listas se ordenaron según la abundancia y se compararon en la Figura 1D para ilustrar que ambos métodos de filtrado de fondo (sustracción o división) producen una lista superpuesta de interactores NKX3.1 de alta confianza. El mapa de intensidad del recuento de espectro en la Figura 1C reitera la mayoría de los pasos descritos anteriormente, presentando así una vista completa del análisis.

Figura 1. El interactoma de la proteína NKX3.1.

(A) Purificación representativa de FLAG-NKX3.1 a partir de células LNCaP transfectadas. Los lisados ​​celulares se absorbieron en resina anti-FLAG M2 y las proteínas retenidas específicamente se eluyeron con péptido FLAG y se separaron mediante SDS-PAGE. Se resalta una banda que migra con el peso molecular esperado de FLAG-NKX3.1 y que está ausente de la purificación simulada (vector vacío). (B) Diagrama de Venn de cuatro vías para indicar el grado de superposición en el contenido de proteína detectado en cuatro purificaciones independientes de FLAG-NKX3.1. (C) Mapa de intensidades de recuento de espectro en los cuatro FLAG-NKX3.1 independientes y purificaciones simuladas. El mapa también contiene la suma de los recuentos de espectros de todas las purificaciones, así como los datos sumados después del ajuste de los pesos moleculares de las proteínas. Las dos columnas más a la derecha presentan dos formas distintas de corrección de fondo, ya sea restando valores simulados de los valores NKX3.1 (NKX3.1 & # x2013 Mock) o calculando el factor de enriquecimiento en la muestra NKX3.1 sobre simulacro (NKX3. 1 / Simulacro). Consulte la sección Materiales y métodos para obtener detalles sobre el análisis y el procesamiento de datos. (D) Mapas de intensidad de recuento de espectro de los 25 componentes más abundantes del interactoma NKX3.1. Los datos se ordenaron por factor de enriquecimiento (panel izquierdo, NKX3.1 / Mock ordenados) o por valores restados de fondo (panel derecho, NKX3.1 & # x2013 Mock ordenados). La fuente de tipo negro indica las proteínas que se encuentran en ambas listas independientemente del método de clasificación basada en la abundancia.

El interactoma NKX3.1 se analizó con el complemento Cytoscape Reactome FI 32. La lista de proteínas que interactúan con NKX3.1 se cargó en Cytoscape y se utilizó para construir redes Reactome que permiten genes enlazadores. Las redes se agruparon en módulos y se identificaron las rutas enriquecidas en los módulos (FDR & # x2264 0.01) (Figura 2A).

Figura 2. NKX3.1 interactúa con proteínas reparadoras del ADN.

(A) La lista de proteínas que interactúan con NKX3.1 se cargó en Cytoscape y se usó para construir redes de interacción funcional Reactome. Las redes se agruparon en módulos (indicados por colores) y se identificaron las rutas enriquecidas en los módulos (FDR & # x2264 0.01). Los diamantes representan componentes de la red que no se identificaron como proteínas que interactúan con NKX3.1. (B) Se transfectaron células LNCaP con FLAG-NKX3.1 (+) o vector vacío (-) seguido de absorción de lisado celular en resina FLAG M2 para purificar FLAG-NKX3.1. Las proteínas de reparación del ADN co-purificadoras se detectaron mediante inmunotransferencia. Los cuatro paneles inferiores son de la misma purificación por afinidad resuelta en un gel separado. El asterisco denota una reactividad cruzada inespecífica del anticuerpo HSPA8. Se muestran imágenes de transferencia recortadas; consulte la Figura S7 para obtener imágenes completas. (C) Se preparó una fracción de proteína nuclear a partir de células LNCaP y se empleó para inmunoprecipitación con anticuerpos NKX3.1 o un control de IgG como se indica. Se muestran las mismas muestras antes (& # x201cB & # x201d) y después (& # x201cA & # x201d) de la inmunoprecipitación para documentar el agotamiento específico de NKX3.1 endógeno. Los tres paneles inferiores son del mismo inmunoprecipitado resuelto en un gel separado. Las imágenes de transferencia recortadas se muestran; consulte el Suplemento de la Figura S7 para obtener imágenes completas.

Se utilizaron muestras de ARN duplicadas recogidas de células LH transducidas con adenovirus NKX3.1 o de células LH transducidas con el virus de control GFP para el análisis de micromatrices en la plataforma Illumina. Se utilizaron los BeadChips de expresión Human 6-V2 (Illumina), que contienen

46.000 sondas de transcripción. Los datos primarios se recopilaron utilizando el fabricante & # x2019s BeadArray Reader utilizando el software de escáner suministrado. El análisis de datos se realizó en tres etapas. Primero, se calcularon las intensidades de expresión para cada transcripción sondada en la matriz para todas las hibridaciones usando el software Illumina & # x2019s Beadstudio # 2. En segundo lugar, se controló y normalizó la calidad de los valores de intensidad. El control de calidad se llevó a cabo utilizando el valor p de detección de Illumina Beadstudio establecido en & lt 0,05 como punto de corte. Esto eliminó las sondas cuyas señales eran demasiado bajas para ser detectadas de manera confiable en la matriz. Después de este paso, la inicial

46.000 sondas se redujeron a 22.319 (conjunto de datos 2A). A continuación, las mediciones se normalizaron utilizando la rutina normalize.quantiles del paquete Affymetrix en Bioconductor. Este procedimiento tuvo en cuenta cualquier variación en la intensidad de hibridación entre las matrices individuales. Una evaluación de varias técnicas de normalización diferentes utilizando la rutina maCorrPlot de Bioconductor sugirió que normalize.quantiles era el más apropiado para los datos. Por último, estos datos normalizados se importaron a GeneSpring y se analizaron en busca de genes expresados ​​diferencialmente. Los conjuntos de datos sin procesar se enviaron a la base de datos GEO (número de acceso GSE47030).

Para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre células LH infectadas con Ad-GFP y Ad-GFP-NKX3.1, se promediaron las réplicas biológicas para cada punto de tiempo (7 hy 10 h). Los conjuntos de datos se interrogaron en busca de genes con diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (es decir, +/- NKX3.1) en función de los resultados de la prueba t de Welch (prueba paramétrica, las varianzas no asumieron un valor de p de corte igual a 0,05). Para encontrar los genes con los cambios de expresión más robustos, los datos se trazaron como un & # x201cVolcano Plot & # x201d (Figura complementaria S2B), que permite medir la significación estadística junto con el grado de cambio de expresión. Se reunieron listas de ARNm que cambiaban significativamente 3 o 5 veces tras la expresión de NKX3.1 (Conjunto de datos 2C).

Aislamiento de ARN y análisis Q-PCR

Se infectaron células LH con 20 & # x00b5l de virus Ad-GFP o Ad-GFP-NKX3.1 y se aisló el ARN total después de 6, 8, 10 y 12 h usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Las concentraciones de ARN se determinaron midiendo la absorción a 260 nm en un espectrofotómetro. Se sometieron a transcripción inversa alícuotas de 2 & # x03bcg de ARN total de cada muestra en ADNc usando un kit Omniscript RT (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA) y el sistema de PCR en tiempo real Mx3000 (Stratagene). Los cebadores específicos de genes se diseñaron utilizando el algoritmo Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) como se muestra a continuación. Las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con el protocolo de la mezcla maestra Brilliant SYBR Green QPCR. Brevemente, se llevó a cabo la PCR usando una concentración final de 0,2 & # x03bcmol de los pares de cebadores, 50 ng de plantilla de ADNc y 12,5 & # x03bcl de Brilliant & # x00ae SYBR Green QPCR Master Mix. El volumen se ajustó a 25 & # x03bcl añadiendo agua libre de RNasa. El protocolo de termociclado comenzó con una desnaturalización de 3 minutos a 95 ° C, un programa de amplificación de 40 ciclos que constaba de 30 segundos de desnaturalización a 95 ° C, un recocido de 1 minuto a 55 ° C y una extensión de 30 segundos a 95 ° C. Tras la conversión de los valores de ct en bruto a valores X (0) relacionados linealmente, los valores de expresión se normalizaron a GAPDH, y los cambios de expresión se expresaron como proporciones de niveles de ARNm en células infectadas con NKX3.1 frente a células infectadas con GFP (NKX3.1 / GFP). Las proporciones se transformaron log2 y se promediaron a través de dos réplicas técnicas, y se calcularon las desviaciones estándar.

Secuencias de cebadores utilizadas para Q-PCR:

Medida de la proliferación celular.

Se sembraron células LH en placas de 384 pocillos a una densidad de 2000 células por pocillo. Después de 24 horas, las células se transdujeron con Ad-GFP-NKX3.1 o adenovirus Ad-GFP de control durante los tiempos indicados en la Figura 6D & # x2013F. La proliferación (es decir, la síntesis de ADN) se midió usando el kit Click-iT & # x00ae EdU Alexa Fluor & # x00ae 594 HCS (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió 10 & # x00b5M 5-etinil-2 & # x2032-desoxiuridina (EdU) al medio de cultivo durante una hora, y las células se fijaron con formaldehído al 3,7%, se lavaron con PBS dos veces, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS, teñido con colorante Click-iT Alexa Fluor 594 y contrateñido con 1 & # x00b5g / mL Hoechst 33342 (azul). Las placas se escanearon y analizaron utilizando un citómetro automático Celigo de longitud de onda dual para detectar el colorante Hoechst (recuento total de células) y Alexa Fluor 594 (células que incorporan EdU y, por lo tanto, se someten a síntesis de ADN). Se obtuvieron cuatro imágenes por pocillo en cada longitud de onda, y se calculó el porcentaje de células en proliferación dividiendo el número de células positivas a Alexa por el número total de células.

Se añadieron inhibidores de MAP quinasa y anticuerpos neutralizantes dos horas después de la transducción viral. Los inhibidores de JNK SP600125 (EMD Chemicals Inc, San Diego, CA) y el inhibidor de p38 SB203580 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) se usaron a 20 & # x00b5M. Se usaron IgG de ratón dirigida contra TNF & # x03b1 (Clon 6401, R & ampD Systems, Minneapolis, MN) e IgG de ratón completo como control (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a 5 & # x00b5 g / ml.

Análisis de rutas y redes

Se utilizó el análisis de la ruta de ingenio (IPA, Ingenuity Systems) para el análisis de la ruta y la red. La mayor parte del análisis se realizó con el conjunto de datos 5 & # x00d7 (los ARNm que muestran un cambio significativo & # x2265 de 5 veces tras la expresión de NKX3.1). El conjunto de datos 3 & # x00d7 se utilizó para la red MYC. Los conjuntos de datos se importaron a IPA y se analizaron con las siguientes configuraciones: Conjunto de referencia: Base de conocimientos de Ingenuity (Genes + Químicos endógenos) Análisis de red: Relaciones directas e indirectas Fuente de datos: Ingenuity Expert Hallazgos Confianza: Observación experimental Especies: Mamíferos (humanos, ratones, rata) y Sin categorizar (por ejemplo, productos químicos) Líneas celulares y de tejidos: Todas.

El conjunto de datos 5 & # x00d7 se cargó en el servidor NextBio a través del portal Sanford-Burnham. 153 de las 158 características del conjunto de datos 5 & # x00d7 fueron reconocidas y podrían ser interpretadas por NextBio. El análisis se realizó utilizando la configuración predeterminada. Se identificaron sitios de unión de factor de transcripción significativamente enriquecidos a través de los correspondientes Biogrupos. La superposición entre el conjunto de datos 5 & # x00d7 y el estudio de expresión génica de Nanni et al. 33 se identificó mediante una búsqueda en todos los estudios seleccionados.

Tinción de inmunofluorescencia indirecta

Se sembraron células LNCaP transfectadas con Flag-NKX3.1 sobre cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-lisina de 15 mm y se fijaron usando formaldehído (3,7% en PBS). Las muestras se tiñeron con anticuerpos FLAG monoclonales de ratón (Sigma) o NKX3.1 policlonales de cabra (Santa Cruz). Como anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpos conjugados IgG anti-ratón de burro Alexa Fluor 568 (rojo) y IgG de burro anti-IgG de cabra Alexa Fluor 488 (verde) (Life Technologies Cat # A10037, RRID: AB_11180865 y Cat # A11055, RRID: AB_10564074). Los núcleos se tiñeron con 4 & # x2019 & # x20136 & # x2019 diamidino - 2 - fenilindol (DAPI). Se obtuvieron imágenes de las muestras en un microscopio fluorescente invertido Nikon Tipo 120 usando un aumento de 60 & # x00d7.

Resultados El interactoma NKX3.1

Con el razonamiento de que el interactoma NKX3.1 puede perfilarse más eficazmente en células que expresan naturalmente esta proteína, expresamos transitoriamente NKX3.1 etiquetado con epítopo FLAG en células de cáncer de próstata humano LNCaP. FLAG-NKX3.1 era aproximadamente 5 veces superior al NKX3.1 endógeno (Figura complementaria S1A) pero se localizaba principalmente en los núcleos celulares (Figura complementaria S1B). El inhibidor de proteasoma MG132 se añadió 4 horas antes de la preparación del lisado con el fin de ralentizar el rápido aclaramiento a través de la ruta de ubiquitina-proteasoma a la que NKX3.1 normalmente se somete 34, 35. El lisado celular se absorbió en resina anti-FLAG M2 y las proteínas retenidas específicamente se eluyeron con péptido FLAG. Se realizaron cuatro purificaciones de afinidad independientes en paralelo con purificaciones simuladas de lisado de células transfectadas con vector vacío. Los eluidos se examinaron mediante SDS-PAGE (Figura 1A) y se sometieron a análisis LC-MS / MS para determinar su composición proteica.En total, se identificaron 315 proteínas con una tasa de falsos positivos de & # x2264 0,01 (conjunto de datos 1A).

El conjunto de datos de proteínas se sometió a sustracción de fondo y filtrado basado en abundancia para llegar a una lista de 58 proteínas que interactúan con NKX3.1 de alta confianza (ver Materiales y métodos y Conjunto de datos 1B). Se identificaron cincuenta y cinco de las 58 proteínas en al menos dos purificaciones independientes, y 27 se identificaron en al menos tres purificaciones (Figura 1B, Conjunto de datos 1C). Cinco proteínas se identificaron consistentemente como socios de interacción NKX3.1 en las cuatro purificaciones independientes, a saber, NKX3.1, las proteínas de reparación del ADN XRCC5 / Ku80 y PARP1, y las proteínas de síntesis de proteínas RPS9 y PABPC1.

A continuación, realizamos una cuantificación relativa del interactoma NKX3.1 basada en el conteo espectral 29. Al sumar los recuentos de espectro ajustados por peso molecular de cada proteína en las cuatro purificaciones simuladas y NKX3.1, obtuvimos cuantificaciones corregidas de fondo restando los valores simulados sumados de los valores del cebo NKX3.1 sumados (NKX3.1 & # x2013 Mock) o por dividir los valores de cebo NKX3.1 de los valores simulados (NKX3.1 / Mock) para obtener el factor por el cual se enriqueció una proteína en las muestras de cebo NKX3.1 sobre la muestra simulada. Ambos métodos confirmaron la expectativa de que NKX3.1 era la proteína más abundante identificada en las purificaciones por afinidad FLAG (Figura 1C, D). También realizamos el análisis de interacción funcional de Reactome para construir una red de interacción funcional de proteínas de unión a NKX3.1 derivadas de datos de la literatura curados manualmente [32]. La red se agrupó en módulos y se identificaron vías / reacciones funcionales enriquecidas (Figura 2A).

Entre las 10 proteínas co-purificadoras más abundantes se encontraban los componentes de la holoenzima de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK), XRCC5 / Ku80, XRCC6 / Ku70 y poli (ADP) ribosa polimerasa (PARP1) (Figura 2A). DNA-PK y PARP1 tienen funciones importantes en la reparación, recombinación y mantenimiento de los telómeros de la rotura de la doble hebra del DNA, pero también participan en el control de la cromatina y la transcripción 36 & # x2013 38. Por ejemplo, las proteínas Ku se asocian con una serie de proteínas homeodominio (HOXC4, OCT1, OCT2, DLX2) y las reclutan en los extremos del ADN donde son fosforiladas por el ADN-PK 39. Se propuso que tal fosforilación conduciría a cambios dependientes del daño del ADN en sus actividades transcripcionales. La ribosilación de ADP mediada por PARP1 puede estimular la capacidad de DNA-PK para fosforilar sustratos proteicos [40]. Nuestros datos de interactoma proporcionan un posible mecanismo subyacente a la localización previamente observada de NKX3.1 en sitios de daño del ADN 24, aunque las consecuencias funcionales de estas interacciones para la actividad transcripcional de NKX3.1 aún no se han establecido. Independientemente, los experimentos de co-inmunoprecipitación de seguimiento mostraron que NKX3.1 sobreexpresado interactuaba fácilmente con XRCC5 / Ku80, XRCC6 / Ku70 y PARP1 endógenos (Figura 2B). La interacción de DNA-PK con NKX3.1 expresado ectópicamente se informó muy recientemente en un estudio independiente 41. Mostramos aquí que NKX3.1 endógeno también interactúa con XRCC5 / Ku80, XRCC6 / Ku70 y PARP1 (Figura 2C).

Entre las proteínas que interactúan con NKX3.1 de clasificación superior también se encontraba el factor de unión potenciador de interleucina 2 (ILF2 / NFAT 45 kDa) (Figura 1D). Anteriormente se demostró que esta proteína interactúa con el complejo 42 de ADN-PK-Ku y forma parte de un ensamblaje de ribonucleoproteína que contiene ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), la proteína de choque térmico HSPA8, la proteína de unión poli-A PABC1, nucleolina (NCL). , y varias proteínas ribosomales 43, todas las cuales también fueron identificadas aquí como componentes del interactoma NKX3.1 (Figura 1C, D, Conjunto de datos 1A). La mayoría de estas interacciones también estaban representadas en la red Reactome (Figura 2A). También se identificaron dos subunidades adicionales de esta partícula, ILF3 e YBX1, aunque a niveles bajos (conjunto de datos 1A). Los hnRNP funcionan en múltiples procesos, incluido el empalme, la dinámica, la estabilidad y la traducción del ARNm, el mantenimiento de los telómeros, la reparación del ADN y la remodelación y transcripción de la cromatina 44. También son constituyentes principales del proteoma nucleolar, que además comprende muchas de las proteínas que interactúan con NKX3.1 enumeradas anteriormente, incluido el complejo ADN-PK, PARP1, HSPA8 y proteínas ribosómicas, así como las helicasas de ARN DDX3 y DDX5 45, 46. . Aunque la importancia de estas interacciones sigue sin estar clara, pueden reflejar un acoplamiento físico estrecho de la transcripción del ARNm dependiente de NKX3.1 al procesamiento del ARNm 47 y / o el papel hasta ahora no apreciado de NKX3.1 en la biogénesis del ribosoma nucleolar y el transporte del ARNm citoplasmático. Se hizo una propuesta similar para racionalizar el interactoma del factor de transcripción SOX2, que comparte una superposición notable con el interactoma NKX3.1 48.

Otro interactor NKX3.1 muy abundante es el regulador de ensamblaje nuclear y cromatina BANF1 (Figura 1D). Esta interacción fue confirmada por co-inmunoprecipitación (Figura 2B). Anteriormente se demostró que BANF1 se une a otras dos proteínas identificadas en el interactoma NKX3.1, la emerina (EMD) y la timopoyetina (TMPO) 49. Además, BANF1 interactúa con varios otros factores de transcripción del homeodominio y regula la actividad transcripcional de uno de ellos, CRX 50. Por tanto, es probable que BANF1, en complejo con emerina y timopoyetina, esté implicado en la regulación génica mediada por NKX3.1. Las proteínas de unión a la matriz nuclear SAFA / HNRNPU y SAFB, que también fueron identificadas como proteínas que interactúan con NKX3.1, también pueden participar en este proceso.

Finalmente, identificamos una interacción de NKX3.1 con el factor de transcripción homeobox HOXB13 (conjunto de datos 1C). Esta interacción fue confirmada por co-inmunoprecipitación (Figura 2A). HOXB13 también interactúa con el receptor de andrógenos y regula la respuesta celular al andrógeno 51. Además, las mutaciones de la línea germinal de HOXB13 aumentan significativamente el riesgo de cáncer de próstata hereditario a través de mecanismos desconocidos 52. Sin embargo, estudios posteriores descartaron la intrigante posibilidad de que la mutación de HOXB13 altere su interacción con NKX3.1 (CCY & amp DAW, observación no publicada).

Programa transcripcional inducido por NKX3.1

Determinaciones previas de firmas de expresión génica dependientes de NKX3.1 han perfilado próstatas de ratones que se desarrollaron y envejecieron en ausencia completa de NKX3.1 16, 19, 20. Por lo tanto, estas firmas pueden describir cambios adaptativos que ocurren en respuesta al agotamiento a largo plazo de NKX3.1 además de sus efectos inmediatos sobre la expresión génica. Por lo tanto, hemos optado por introducir de forma aguda NKX3.1 en células epiteliales de próstata humana inmortalizadas (células LH 25) que no expresan niveles detectables de proteína NKX3.1 (datos no mostrados). Producimos adenovirus que impulsan la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1 a partir de promotores separados (virus Ad-GFP y Ad-GFP-NKX3.1, respectivamente). Las células LH se infectaron con estos virus de acuerdo con el esquema de la Figura 3A. La señal de GFP se volvió detectable por primera vez mediante microscopía de fluorescencia de células vivas 6 horas después de la infección (datos no mostrados). Por lo tanto, recolectamos cultivos duplicados de células para inmunotransferencia 7 y 10 horas después de la infección y determinamos que NKX3.1 y GFP se expresaron en ambos puntos de tiempo (Figura 3B). No se observaron efectos citopáticos de la infección por adenovirus dentro del período de tiempo del experimento. En paralelo, preparamos muestras de ARN duplicadas de los puntos de tiempo de 7 horas y 10 horas para el análisis del transcriptoma.

Figura 3. La expresión de NKX3.1 mediada por adenovirus en células epiteliales de próstata LH regula ARNm específicos.

(A) Representación esquemática del curso temporal del experimento. Las células LH se infectaron por duplicado con adenovirus que dirigían la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1 de dos promotores separados. La expresión de GFP se hizo evidente por primera vez mediante microscopía de fluorescencia 6 horas después de la transfección (datos no mostrados). (B) Se prepararon lisados ​​de células duplicadas 7 y 10 horas después de la infección, y se examinó la expresión de GFP y NKX3.1 mediante inmunotransferencia. La expresión de NKX3.1 ya era detectable en el punto de tiempo más temprano (7 horas). (C) Análisis cuantitativo de RT-PCR de 9 ARNm cuya expresión cambia en respuesta a NKX3.1. Las células LH se infectaron con adenovirus que dirigían la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1, y el ARNm se aisló después de los puntos de tiempo indicados (6, 8, 10, 12 horas). Las muestras de ARN se analizaron mediante Q-PCR, y los valores de expresión se muestran como relaciones transformadas log2 del nivel de ARNm en células infectadas con NKX3.1 frente a células infectadas con GFP (NKX3.1 / GFP). Las barras de error indican las desviaciones estándar obtenidas de dos mediciones repetidas. El panel izquierdo muestra datos para 5 ARNm que fueron regulados positivamente por NKX3.1 en el conjunto de datos de la matriz, mientras que el panel derecho muestra datos para cuatro ARNm que fueron regulados negativamente.

Los cambios globales en los niveles de transcripción observados en respuesta a la expresión de NKX3.1 fueron muy similares en los puntos de tiempo de 7 horas o 10 horas (Figura complementaria S2A). Se observaron cambios estadísticamente significativos para varios cientos de ARNm. Para reducir el número de cambios de ARNm para ser interrogados más a un número manejable, establecimos arbitrariamente un límite de cambio de 5 veces. Esto produjo listas de 158 genes expresados ​​diferencialmente para el punto de tiempo de 7 horas (Figura complementaria S2B) y 165 para el punto de tiempo de 10 horas. Dado que hubo una superposición considerable de ambas listas, limitamos el análisis adicional a la muestra de 7 horas. Los conjuntos de datos 2A y B resumen todos los datos de expresión de ARNm. La Tabla complementaria 1 presenta una lista clasificada de los 107 ARNm con una regulación positiva de & gt 5 veces, mientras que la Tabla complementaria 2 presenta una lista correspondiente de los 51 ARNm con una regulación a la baja de & gt 5 veces en las células LH que expresan NKX3.1 (ver también Conjunto de datos 2C) . Elegimos 5 ARNm regulados positivamente y 5 regulados negativamente para la validación por Q-PCR con un nuevo conjunto de muestras de ARN replicadas preparadas a partir de células infectadas con Ad-GFP o Ad-GFP-NKX3.1 durante períodos de tiempo crecientes. Nueve de los 10 cambios de expresión confirmaron la tendencia observada en los microarrays, aunque la variabilidad fue sustancial para algunas mediciones (Figura 3C). No pudimos confirmar la inducción de ARNm de KRT17 aparente a partir de los datos de la matriz (no mostrados). La validación adicional por Q-PCR e inmunotransferencia se muestra en varias secciones a continuación (ver Figura 6).

El examen de las listas de cambios de ARNm reveló una reprogramación fundamental de la expresión génica en las células LH tras la expresión aguda de NKX3.1. En general, los cambios indicaron la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la diferenciación celular. Por ejemplo, se indujeron fuertemente 9 marcadores de diferenciación epitelial (citoqueratinas 5, 6B, 7, 8, 17, 18, 19, estratifina, calicreína 5). Además, se indujo la vía Notch, que a menudo está regulada a la baja en los cánceres de próstata 53 (DLL1, HES1, JAG2). También se incrementó el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 (CDKN1A), que inhibe la progresión del ciclo celular e induce la diferenciación celular 54.

De manera tranquilizadora, muchos de los ARNm inducidos por NKX3.1 más fuertes codifican proteínas que anteriormente se demostró que estaban reguladas a la baja en el cáncer de próstata humano según la inmunohistoquímica (Tabla complementaria 1). Esto incluyó, por ejemplo, las proteínas de unión al calcio S100A2 y A14 55, la proteína 14-3-3 estratifina 56, 57, laminina A 58, claudina 7 59, prostasina 60, P cadherina 61 y calicreína 5 62. La ciclina D2 se considera un activador de la progresión del ciclo celular, pero fue inducida por NKX3.1. Sin embargo, sorprendentemente, la ciclina D2 está típicamente regulada a la baja en los cánceres de próstata humanos 63. Se regularon positivamente cuatro ARNm que codifican HSP70 (Tabla complementaria 1). La expresión de HSP70 se pierde con frecuencia en cánceres de próstata agresivos 64 y la sobreexpresión experimental de HSP70 inhibe la tumorigenicidad de los xenoinjertos de cáncer de próstata en ratones 65. Asimismo, tres genes que codifican las co-chaperonas DnaJ / HSP40 de HSP70 se regularon al alza & gt 5 veces. Por último, dos glutatión transferasas fueron reguladas positivamente por NKX3.1, un hallazgo que es consistente con la demostración previa de que NKX3.1 regula positivamente la defensa del estrés oxidativo 20.

La lista de genes regulados negativamente (Tabla complementaria 2) incluía genes implicados en la migración celular (relacionados con actina / miosina, colágenos 1A1, 5A1, 5A2), varios factores de crecimiento y la vía del interferón / STAT. Se demostró previamente que muchos de los genes más regulados a la baja se sobreexpresaban en el cáncer de próstata y otros cánceres (Tabla complementaria 2). Esto se aplica, por ejemplo, al factor de elongación de traducción eucariota 1 alfa (EEF1A2) que es un oncogén potencial 66, el antagonista de BMP gremlin 1 67 y el factor de transcripción FOXD1 68. La N-cadherina, que frecuentemente reemplaza las formas epiteliales de cadherina en los cánceres de próstata (& # x201ccadherin switch & # x201d) también fue fuertemente regulada a la baja 69. Significativamente, NKX3.1 también regulaba positivamente la P cadherina, invirtiendo así el interruptor de cadherina.

También comparamos nuestra lista de 331 ARNm que fueron modificados & # x2265 3 veces por NKX3.1 con una lista reciente de 282 genes de ratón que se cree que son objetivos directos de NKX3.1 basados ​​en una combinación de expresión y datos de ChIP-seq 16. A pesar de la diferencia de especies y las estrategias diametrales (sobreexpresión versus knockout), se representaron 10 genes en ambas listas (Tabla complementaria 3). Esta superposición es muy significativa si se considera que 8 de estos 10 genes fueron regulados por NKX3.1 en la misma dirección.

Para evaluar los módulos funcionales y las vías de señalización afectadas por NKX3.1, realizamos un análisis global con el paquete Ingenuity Pathway Analysis (IPA). El análisis se realizó con el conjunto de datos de ARNm cambiando más de 5 veces (& # x201c5 & # x00d7 conjunto de datos & # x201d) o, cuando se indique, con un conjunto de datos más grande de ARNm que cambia más de 3 veces (& # x201c3 & # x00d7 conjunto de datos & # x201d, 357 genes). Dado que se obtuvieron rutas idénticas de puntuación máxima con ambos conjuntos de datos, el análisis se restringió en gran medida al conjunto de datos más pequeño de 5 & # x00d7, a menos que se indique lo contrario.

De acuerdo con la participación de NKX3.1 en el desarrollo de la próstata, encontramos una sobrerrepresentación muy significativa de IPA & # x201cFunctions & # x201d pertenecientes al desarrollo, movimiento celular, proliferación y crecimiento celular (Figura 4A). De particular interés fue el término & # x201c Enfermedad de los sistemas reproductivos & # x201d, que incluía el subgrupo & # x201cNeoplasia intraepitelial prostática & # x201d (PIN). El PIN es la lesión precursora más temprana conocida del cáncer de próstata y, con frecuencia, muestra niveles reducidos de NKX3.1 70. La función & # x201cPIN & # x201d contenía los siete genes enumerados en la Figura 4B. Un estudio anterior determinó que seis de estos genes estaban regulados negativamente en PIN frente a próstata normal, mientras que uno estaba regulado positivamente 71. Sorprendentemente, cinco de los siete genes mostraron una imagen especular de los cambios que ocurren en PIN cuando se examinaron en células LH que expresan NKX3.1 (Figura 4B). Estos hallazgos sugieren que los cambios en la expresión génica en el PIN temprano pueden estar relacionados causalmente con la pérdida de NKX3.1.

Figura 4. Funciones y vías que están sobrerrepresentadas en el programa de expresión génica NKX3.1.

(A) Seleccione IPA & # x201cFunctions & # x201d significativamente sobrerrepresentadas en el conjunto de ARNm 5 & # x00d7. (B) Lista de ARNm con expresión inversa en neoplasia intraepitelial prostática (PIN 71) y células LH que expresan NKX3.1. Los ARNm que se muestran en rojo están regulados al alza, mientras que los que se muestran en verde están regulados a la baja. (C) Seleccione IPA & # x201cCanonical Pathways & # x201d sobrerrepresentados en el conjunto de datos 5 & # x00d7. La abscisa en la parte superior indica la fracción porcentual de todos los posibles componentes de la vía que estaban representados en el conjunto de datos. Dado que este conjunto de datos solo contenía un número relativamente pequeño de 158 ARNm, un pequeño porcentaje de sobrerrepresentación de los componentes de la vía es estadísticamente altamente significativo (p & lt 0.05, ver gráfico amarillo).

Como se muestra en la Figura 4C, una serie de vías estaban sobrerrepresentadas que no eran evidentes a partir de la curación manual de las listas de genes presentadas anteriormente. Por ejemplo, el análisis indicó una regulación positiva por NKX3.1 de las vías p53 e IL1, además de la vía de señalización Notch. La señalización de interferón, a su vez, pareció estar desactivada por la expresión aguda de NKX3.1.

Red TNF & # x03b1. Para obtener una mejor comprensión de los circuitos reguladores que subyacen a la modulación inducida por NKX3.1 de vías funcionales particulares, realizamos un análisis de red utilizando el software Ingenuity IPA. La red de mayor rango presentada en la Figura 5A presentaba TNF & # x03b1, un gen que fue inducido por NKX3.1 (Tabla complementaria 1, Figura 6A), en el centro con bordes que llegaban a 27 nodos distintos. Dieciocho de estos bordes se definieron por una relación de regulación de genes (es decir, borde de expresión), lo que significa genes que se sabe que son inducidos o suprimidos por la señalización de TNF & # x03b1. Una anotación adicional de la red TNF & # x03b1 también conectó TNF & # x03b1 a la supresión del movimiento celular inducida por NKX3.1 a través de la regulación a la baja de los componentes de movilidad basados ​​en acción-miosina y la mejora de la adhesión celular a través de la regulación al alza de lamininas (Figura 5A). Ambos procesos se consideran características auténticas de la supresión tumoral. Un examen minucioso de cada borde de expresión de TNF & # x03b1 reveló una concordancia considerable entre la definición del borde (basada en la literatura publicada) y la expresión real del nodo diana en respuesta a NKX3.1. Catorce nodos de primer grado que se predice que serán activados por TNF & # x03b1 también fueron regulados positivamente por NKX3.1 (Tabla complementaria 4). De acuerdo con que la señalización de la MAP quinasa es una importante vía descendente activada por TNF & # x03b1, encontramos que un inhibidor químico de JNK pero no p38 podría antagonizar parcialmente la expresión inducida por NKX3.1 de HSPA6 y HES1 (Figura 6B).

Figura 5. Análisis de la red IPA del programa transcripcional NKX3.1.

(A) Red TNF & # x03b1. Los colores de los nodos representan el nivel de regulación hacia arriba (rojo) o hacia abajo (verde) tras la expresión de NKX3.1. (B) Red supresora de tumores p53. El cuadrilátero p53-TERT-EGF-JUN está resaltado por bordes azul oscuro. (C) Red MYC. Los bordes de primer grado de MYC se resaltan en azul claro. (D) Red PDGFB / TGF & # x03b2. Los bordes de primer grado se resaltan en azul claro, el enlace PDFGB-TGF & # x03b2 en azul oscuro.

Figura 6. Cambios inducidos por NKX3.1 en la expresión de genes y proteínas.

(A) Análisis cuantitativo de RT-PCR de ARNm de TNF & # x03b1. Las células LH se infectaron con adenovirus que dirigían la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1, y el ARNm se aisló después de los puntos de tiempo indicados (6, 8, 10, 12 horas). Las muestras de ARN se analizaron mediante Q-PCR con dos conjuntos de cebadores diferentes que amplificaban el ARNm de TNF y # x03b1, y los valores de expresión se muestran como relaciones transformadas log2 del nivel de ARNm en células infectadas con NKX3.1 frente a células infectadas con GFP (NKX3.1 / GFP). Las barras de error indican las desviaciones estándar obtenidas de dos mediciones repetidas. (B) Las células LH se infectaron con adenovirus que impulsan la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1. Después de 4 horas, se añadieron 10 & # x03bcM del inhibidor de JNK SP600125 o 10 & # x03bcM del inhibidor de quinasa p38 SB203580 seguido de aislamiento de ARNm después de 6 horas. Los niveles de HSPA6 y HES1 se analizaron mediante Q-PCR. Los valores de expresión se muestran como relaciones transformadas log2 del nivel de ARNm en células infectadas con NKX3.1 frente a células infectadas con GFP (NKX3.1 / GFP). Las barras de error indican las desviaciones estándar obtenidas de dos mediciones repetidas.(C) Se infectaron células LH con adenovirus que conducen a la expresión de GFP sola o GFP y NKX3.1, y se prepararon lisados ​​de proteínas después de los puntos de tiempo indicados (6, 8, 10, 12 horas). La expresión de las proteínas indicadas se determinó mediante inmunotransferencia. Se muestran imágenes de transferencia recortadas, consulte la Figura S8. para imágenes completas. (D) Se infectaron células LH con virus Ad-GFP y Ad-GFP-NKX3.1, y se midió la velocidad de síntesis de ADN mediante la incorporación de EdU después de los tiempos indicados (gráficos superiores). El porcentaje de células positivas para GFP se determinó como una medida de la eficacia de la infección (gráficos inferiores). (E) Las células LH se infectaron con el virus Ad-GFP-NKX3.1 y el efecto del inhibidor de JNK (SP600125, 20 & # x03bcM) o el inhibidor de la quinasa p38 (SB203580, 20 & # x03bcM) sobre la supresión mediada por NKX3.1 de la síntesis de ADN se midió mediante la incorporación de EdU. El porcentaje de células positivas para GFP se determinó como una medida de la eficacia de la infección (gráficos inferiores). (F) Se infectaron células LH con el virus Ad-GFP-NKX3.1, y se midió el efecto de los anticuerpos neutralizantes contra TNF & # x03b1 o IgG de control sobre la supresión de la síntesis de ADN mediada por NKX3.1 mediante la incorporación de EdU. El porcentaje de células positivas para GFP se determinó como una medida de la eficacia de la infección (gráficos inferiores).

red p53. Otra red de alta puntuación presentó el supresor de tumores p53 en el centro con bordes de primer grado en 8 nodos. Aunque p53 no estaba regulado al alza ni a nivel de ARNm ni de proteína (Figura 6C), un hallazgo que es consistente con la activación bien establecida de p53 en el nivel postraduccional, la red indicó una inducción robusta de algunos de sus genes diana conocidos. Como se muestra en la Figura 5B, esto incluyó la proteína sigma 14-3-3 estratifina (SFN), un marcador de diferenciación epitelial que falta en muchos cánceres de próstata 56, 72, el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21 (CDKN1A, 73) y el p53 Efector de apoptosis PERP 74. La inducción de la proteína p21 por NKX3.1 se confirmó mediante inmunotransferencia (Figura 6C). También se sabe que la anexina A8 (ANXA8) está regulada al alza por p53 75. Usando el conjunto de datos 3 & # x00d7, identificamos 7 ARNm adicionales que están regulados positivamente por NKX3.1 como objetivos conocidos de p53 (Figura complementaria S3). Estos hallazgos sugirieron que la vía supresora de tumores p53 se activa mediante la inducción aguda de NKX3.1 en células LH. La red contenía tres nodos adicionales altamente conectados, telomerasa (TERT), EGF y JUN, que formaban un cuadrilátero con p53. Aunque el ARNm de JUN no fue inducido por NKX3.1, previamente se informó un efecto positivo de p53 en JUN 76.

Red MYC. Otra red de alta puntuación que se obtuvo con el conjunto de datos 3 & # x00d7 se organizó alrededor del oncogén MYC (Figura 5C). El propio MYC se redujo 4 veces mediante la expresión de NKX3.1, un efecto que se validó mediante inmunotransferencia (Figura 6C). Esto coincidió con la regulación a la baja de varios genes que previamente se encontró que requerían la función MYC para su expresión (TXNIP, IFI16 77). Además, el socio de interacción MYC PARP10 se reguló negativamente tras la expresión de NKX3.1. Por el contrario, dos genes que están regulados negativamente por MYC se activaron tras la expresión de NKX3.1 (PERP 78, NDRG 79), lo que sugiere que la regulación a la baja de MYC inducida por NKX3.1 alivia su efecto represivo sobre estos genes. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la restauración de la expresión de NKX3.1 en las células LH condujo a la regulación a la baja de las vías normalmente activadas por MYC. Esto puede contribuir a bloquear la proliferación y promover la diferenciación celular por NKX3.1. El antagonismo de NKX3.1 y MYC en la regulación del gen diana y la tumorigénesis de próstata también se demostró recientemente en un modelo de ratón [16].

Red PDGFB / TGF & # x03b2. Otra red presentaba PDGF & # x03b2 (PDGFB y PDFGBB), que fue inducida 5.1 veces por NKX3.1. La inducción de ARNm de PDGFB y la expresión de muchos de sus nodos de interacción de primer grado es consistente con la señalización de PDGFB regulada al alza por NKX3.1. Por ejemplo, tres nodos que fueron regulados al alza por NKX3.1 (CRYAB, SERPINA3, CDKN1A) y dos nodos que fueron regulados a la baja (DAB2, TAGLN) fueron previamente controlados por PDGFB de la misma manera (Figura complementaria S4 80, 81) . También se sabe que PDGFB activa la transcripción dependiente de PPAR / RXR & # x03b1. En particular, RXR & # x03b1 está regulado positivamente por NKX3.1 (5,7 veces), lo que explica la sobrerrepresentación de la señalización de PPAR en el análisis de la vía canónica anterior (Figura 4C). Dado que se sabe que la señalización de PPAR suprime la proliferación de células de cáncer de próstata 82, puede ser relevante para la supresión de tumores mediada por NKX3.1.

PDGFB comparte varios nodos con otro factor de crecimiento, TGF & # x03b2 (Figura 5D). Aunque el ARNm de TGF & # x03b21 no fue alterado por NKX3.1, el TGF & # x03b22 expresado más abundantemente fue regulado negativamente (Tabla Suplementaria 5). La mayoría de los nodos de primer grado que emanan de TGF & # x03b2 fueron regulados negativamente por la expresión de NKX3.1 (Figura complementaria 3). 25 genes adicionales en la vía de señalización de TGF & # x03b2 fueron regulados a la baja o no modificados por NKX3.1, lo que sugiere además que NKX3.1 no activa la señalización de TGF & # x03b2 (Tabla complementaria 5). Dado que TGF & # x03b2 es un potente impulsor de la transición epitelial a mesenquimal (EMT, 83), la supresión de la señalización de TGF & # x03b2 mediada por NKX3.1 puede contribuir a su actividad inductora de diferenciación.

En un intento por obtener una visión más coherente de los efectos globales de NKX3.1 en la expresión del gen de la próstata, fusionamos redes individuales. Por simplicidad, solo los bordes de expresión se incluyeron en la Figura 7A. No sólo TNF & # x03b1 y p53 se unieron directamente a través de un borde basado en la expresión, sino que varios de sus nodos de primer grado individuales eran objetivos de los bordes que emanaban tanto de TNF & # x03b1 como de p53. Por ejemplo, TFP12 y CASP4 están regulados positivamente tanto por TNF & # x03b1 como por p53 76, 84 & # x2013 86.

Figura 7. Marco del programa transcripcional NKX3.1.

(A) La red TNF & # x03b1-p53 fusionada. Los enlaces de red están resaltados en amarillo. Los bordes directos entre TNF & # x03b1, p53 y JUN se enfatizan en color azul. (B) Construcción de una red que contiene los principales factores implicados en el programa transcripcional NKX3.1, incluidos FOS / AP1, MYC y p53. Los módulos activados por la expresión NKX3.1 están sombreados en rojo y los suprimidos en verde. (C) Marco tentativo de cambios dependientes de NKX3.1 en módulos celulares. Basado en la inducción de ARNm de TNF & # x03b1 y FOS por NKX3.1, y los efectos antagonistas de los inhibidores de JNK sobre la expresión génica mediada por NKX3.1 y la proliferación celular, el marco propone que la señalización de TNF & # x03b1 da como resultado la activación de AP1 y la modulación de genes descendentes y módulos funcionales (los cuadrados rojos simbolizan la regulación positiva / activación, los cuadrados verdes la regulación negativa). Vías adicionales (líneas punteadas) pueden incidir en SRF y otros factores de transcripción (no mostrados).

La subunidad JUN del factor de transcripción AP1, que formaba parte de la red p53 (Figura 5B), se vinculó a TNF & # x03b1 dando como resultado una configuración triangular (Figura 7A). Mientras que se sabe que tanto TNF & # x03b1 como p53 estimulan la expresión de la actividad JUN y AP1 76, 87, la expresión de NKX3.1 no afectó significativamente el nivel de ARNm de cJUN (cambio de -1,21 veces) o JUND (cambio de + 1,25 veces ). Sin embargo, el compañero de interacción JUN FOS aumentó 3.9 veces por NKX3.1. Dado que FOS mantiene exactamente los mismos bordes dentro de la red que JUN (datos no mostrados), la actividad transcripcional de AP1 parece estar regulada al alza en respuesta a la expresión de NKX3.1.

Finalmente, integramos manualmente la red TNF & # x03b1 con las conexiones a todos los factores principales que el análisis de la red había implicado en el programa transcripcional NKX3.1, incluidos FOS / AP1, MYC y p53. A pesar de la complejidad de la red resultante, se está haciendo evidente un marco tentativo para los cambios transcriptómicos inducidos por NKX3.1 (Figura 7B, C). Según este marco, la expresión de NKX3.1 en células LH da como resultado la activación de la vía TNF & # x03b1. Esto a su vez conduce a la activación de las vías p53, Notch, PDGFB y AP1. Por el contrario, las vías MYC e interferón / STAT están apagadas. Mediante Q-PCR e inmunotransferencia, ya hemos confirmado varias de estas predicciones (consulte la Figura 3C para p53, Notch, PDGFB, STAT y la Figura 6 para TNF & # x03b1, MYC y p53). Además, la transducción con virus que expresa NKX3.1 condujo a la inhibición del crecimiento de células LH en relación con el virus que expresa GFP solo (Figura 6D). En particular, la inhibición del crecimiento fue parcialmente rescatada por el inhibidor de JNK y por un anticuerpo neutralizante contra TNF & # x03b1 (Figura 6E, F). Estas observaciones apoyan además un papel de NKX3.1 en la inducción de un bloqueo de la división celular y la promoción de la diferenciación celular a través de vías dependientes de TNF & # x03b1 / JNK / AP1.

Enriquecimiento de los sitios de unión del factor de transcripción

A continuación, empleamos la plataforma NextBio para relacionar nuestros datos de expresión con datos genómicos a gran escala publicados anteriormente. Un conjunto de datos que coincidió con alta significación estadística (p = 4.5E-11) presentó un conjunto de 1082 genes que contienen sitios de unión genómica conservados evolutivamente para AP1 88. Veintiséis de estos genes estaban representados en nuestra lista de

150 genes que responden a NKX3.1, 20 de los cuales son inducidos por NKX3.1 (Tabla complementaria 1, Tabla complementaria 2, Figura complementaria 5A, conjunto de datos 2D). Combinado con la evidencia del análisis de redes y la regulación positiva de FOS, estos hallazgos sugieren que NKX3.1 causa la activación de AP1 y / o coopera con AP1 en la activación de genes. De acuerdo con esta conjetura es la inducción bien conocida de la actividad de la quinasa N-terminal de JUN (JNK) por la señalización de TNF & # x03b1, que mejora la actividad transcripcional de JUN. Finalmente, NF & # x03baB, que también es inducido por la señalización de TNF & # x03b1, puede cooperar con AP1 en algunos promotores 89.

Un segundo motivo de unión al ADN que estaba sobrerrepresentado (p = 1.6E -5) en los genes que responden a NKX3.1 se ajusta a un sitio de unión para el factor de respuesta del suero (SRF). 216 genes humanos contienen el motivo del elemento de respuesta del suero (SRE) en un contexto proximal del promotor que se conserva en el ratón, la rata y el perro 88. Estos 216 genes incluían 9 genes que estaban representados en nuestro conjunto de datos, todos menos uno de los cuales fue suprimido por NKX3.1 (Tabla complementaria 2, Figura complementaria 5B, Conjunto de datos 2E). Dado que se sabe que NKX3.1 interactúa físicamente con SRF 17, nuestros datos sugieren fuertemente que NKX3.1 coopera con SRF en la supresión transcripcional.

Comparación con los datos del cáncer de próstata humano

El análisis de Nextbio también reveló una coincidencia muy significativa con un estudio que comparaba la expresión génica en tejidos de cáncer de próstata humano 33. Este estudio describió 22 líneas celulares derivadas de muestras quirúrgicas de pacientes con cáncer de próstata con enfermedad clínicamente localizada y ausencia de tratamiento hormonal neoadyuvante antes de la cirugía. De acuerdo con estos criterios de selección para los cánceres tempranos, las líneas celulares (y los tumores primarios de los que se derivaron) habían sufrido la pérdida de 8p21 (es decir, NKX3.1) pero no mostraban anomalías genéticas típicas de los cánceres de próstata más avanzados (p. Ej., Pérdida de PTEN , amplificación de MYC y receptor de andrógenos). 3415 ARNm cambiaron significativamente en las líneas celulares de cáncer de próstata en relación con la próstata normal.

De 153 genes expresados ​​diferencialmente en nuestro conjunto de datos, 82 (53%) también se cambiaron en las líneas celulares derivadas del cáncer de próstata (PCaDCL), una superposición muy significativa (p = 2,0E -36, conjunto de datos complementario de la figura 6 2F). De los 82 genes superpuestos, 60 fueron regulados negativamente y 22 fueron regulados positivamente en PCaDCL versus PrEC. Sorprendentemente, el 93% de los ARNm regulados negativamente en PCaDCL fueron inducidos por la expresión de NKX3.1 en células LH (Tabla complementaria 1). Además, 19 de los 20 genes regulados positivamente en PCaDCL fueron regulados negativamente por NKX3.1 (Tabla complementaria 2). Además, muchos de los cambios de expresión de ARNm observados en el estudio de microarrays de PCaDCL se confirmaron de forma independiente a nivel de proteína mediante inmunohistoquímica de muestras de tejido de cáncer de próstata (Tabla complementaria 1 y Tabla complementaria 2). Estos análisis sugieren fuertemente que las principales redes reguladoras de genes que se ven afectadas por la expresión de NKX3.1 en las células LH están inversamente perturbadas en el cáncer de próstata humano temprano marcado por la pérdida de este supresor de tumores.

Hemos empleado una serie de enfoques globales para explorar la función supresora de tumores de NKX3.1. El interactoma NKX3.1 reveló un patrón complejo de interacciones con proteínas reparadoras del ADN y con otros reguladores transcripcionales como ILF2 y BANF1 que predicen un programa transcripcional igualmente complejo ejecutado por NKX3.1. De hecho, el análisis global del patrón de expresión génica activado por la expresión aguda de NKX3.1 en células epiteliales de próstata humana inmortalizadas con un fenotipo basal (células LH 25, 90) reveló una reprogramación rápida y extensa con 158 ARNm cambiando & # x2265 5 -fold y 331 mRNAs cambiando & # x2265 3 veces. Este patrón complejo fue interrogado por el análisis de redes para explicar el reconocimiento de que la representación de los procesos y reacciones celulares como vías lineales es a menudo una simplificación excesiva que no refleja con precisión la complejidad del cableado intracelular 91.

El análisis de red indicó la modulación dependiente de NKX3.1 de una serie de módulos funcionales interconectados y permitió un marco tentativo para el programa transcripcional inducido por NKX3.1 en células epiteliales de próstata humana. En términos generales, la activación de NKX3.1 culmina en la regulación a la baja de la motilidad celular, así como la actividad de MYC e IFN / STAT y en la regulación al alza de la actividad de p53, la vía Notch y la señalización de PDGF (Figura 7C). Muchos de estos cambios son fácilmente compatibles con la función supresora de tumores de NKX3.1 observada en ratones knockout 3 & # x2013 5.

Es importante destacar que el análisis de redes nos permitió identificar varias vías imprevistas en las que parece incidir NKX3.1. Por ejemplo, el análisis sugirió un papel principal para TNF & # x03b1 cuyo ARNm fue inducido por NKX3.1. TNF & # x03b1 es un inductor bien establecido de la señalización de MAP quinasa, incluidas las quinasas JNK y p38. Significativamente, IL1 & # x03b1 también fue inducida por NKX3.1 (Tabla complementaria 1) aumentando así aún más la activación de MAPK. JNK activa la actividad transcripcional de AP1, racionalizando así fácilmente la fuerte sobrerrepresentación de los sitios de unión de AP1 en genes que responden a NKX3.1. La señalización localizada de TNF & # x03b1-JNK mediada por NKX3.1 en células epiteliales de próstata puede promover y mantener su estado de diferenciación suprimiendo así la tumorigénesis. El importante papel de la señalización de JNK en la diferenciación celular está bien establecido 92, 93. El hallazgo de que las citocinas proinflamatorias también desestabilizan la proteína 35 NKX3.1 indica un bucle de retroalimentación negativa que puede contrarrestar su función proapoptótica (Figura 7C).

Es importante destacar que la firma genética inducida por NKX3.1 es, en gran medida, una imagen especular del patrón de expresión génica que se encuentra en los primeros cánceres de próstata humanos desprovistos de NKX3.1 33. Este patrón inverso sugiere además que NKX3.1 es un impulsor clave de la diferenciación celular luminal, mientras que la pérdida de NKX3.1 permitiría que las células luminales se desdiferenciaran a un estado con mayor capacidad proliferativa, lo que las haría más vulnerables a la adquisición de eventos oncogénicos adicionales, tal vez. aumentado por defectos concurrentes en la reparación del ADN. Claramente, tales eventos adicionales son esenciales para la carcinogénesis de próstata dado que PIN en ratones knockout NKX3.1 no progresa a cáncer de próstata manifiesto, a menos que se incurran en cambios genéticos adicionales 5 & # x2013 8.

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figshare: Conjunto de datos de expresiones e interacciones NKX3.1. Doi: 10.6084 / m9.figshare.1002064 94