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No hay bandas de producto digerido, pero los marcadores son visibles. ¿Cuáles podrían ser los motivos?

No hay bandas de producto digerido, pero los marcadores son visibles. ¿Cuáles podrían ser los motivos?



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Tuve que digerir mi inserto que contiene plásmido y otro vector en el que mi inserto tiene que ser ligado, cada uno con BamHI y NotI.

Tras la digestión, corrí el gel para verificar los resultados. La digestión pareció estar bien la primera vez con bandas razonablemente buenas. Como necesitaba más concentración, ejecuté el gel con la misma configuración de reacción (30 microlitros) por segunda vez.

Pozo 1 - marcador de 100 pb

Pozo 2 - Insertar en un vector (820 ng / microL, 3microL)

Pozo 3- Vector plásmido en el que se debe ligar el inserto (1000 ng / microlitro, 2 microlitros)

Las bandas marcadoras eran débiles mientras que no había absolutamente ninguna banda en los otros pozos. ¿Cuál podría ser el motivo del fallo durante la segunda ejecución? Realicé la segunda digestión en un lapso de 40 minutos después de la primera.


Por lo general, no hay problemas de mezcla. Una posible razón es la degradación. Pero dices que el marcador es débil (el marcador no se degrada). Teñir el gel con EtBr extra y volver a ver. Si reutilizó el gel, definitivamente vuelva a teñirlo porque EtBr migra hacia el cátodo.

No me parece una degradación, pero ser cauteloso para la próxima vez:

  • Utilice agua recién esterilizada en autoclave. Si no está seguro, filtre con una jeringa y conserve unos 10 ml para usted.
  • Asegúrese de que los recipientes de plástico también se esterilicen en autoclave correctamente.
  • Usa endo - kits de extracción de plásmidos, si están disponibles
  • Disuelva el plásmido en TE (solo si la concentración es alta y no necesita poner mucho en la mezcla de reacción, de lo contrario, el EDTA interfiere en las reacciones. En ese caso, use Tris-Cl pH-7.6).
  • Si tiene que digerir una gran cantidad de ADN, configure pequeñas reacciones en muchos tubos.
  • No incube la reacción durante mucho tiempo (> 6 h).
  • Inactive la enzima calentando si no está ejecutando el gel inmediatamente.
  • Asegúrese de que los tampones de gel de ejecución no sean demasiado viejos.

Plásmidos 101: Cómo verificar su plásmido mediante un análisis de resumen de restricción

¡Felicitaciones, tiene un plásmido que expresa su gen de interés (YGOI) y está listo para sumergirse en sus experimentos funcionales! Ya sea que haya clonado el plásmido usted mismo o lo haya obtenido de un colega al final del pasillo, siempre es una buena idea tomarse un tiempo para confirmar que está trabajando con la construcción correcta y verificar que el plásmido que recibió coincide con la secuencia esperada. . Aquí en Addgene, utilizamos el control de calidad basado en NGS para confirmar la secuencia de todos los plásmidos que distribuimos. Este método requiere mucho tiempo, por lo que recomendamos una variedad de formas de detectar y verificar sus plásmidos. Aquí, cubriremos el análisis de resumen de restricciones.


Preguntas frecuentes: ¿Por qué veo un frotis de ADN en un gel de agarosa después de una digestión de restricción?

Hay varias razones posibles por las que puede ver un frotis de ADN en su gel de agarosa después de una digestión de restricción. Para una discusión sobre este tema, consulte el video de arriba.

Un frotis de ADN en un gel de agarosa después de una digestión de restricción puede resultar de uno o más de los siguientes:
1. contaminación por nucleasas en la reacción de digestión
2. problemas con el tampón de funcionamiento en la caja de gel o
3. la enzima de restricción tiene una alta afinidad de unión al ADN
La fuente de contaminación por nucleasas puede provenir de la preparación de ADN, el tampón de digestión o el agua utilizada en la mezcla de digestión. Con los controles adecuados, cada uno de estos componentes puede comprobarse de forma independiente después de la incubación a la temperatura de digestión designada.
Los tampones en funcionamiento que se han mantenido a temperatura ambiente durante períodos prolongados de tiempo pueden eventualmente apagarse y afectar negativamente a la electroforesis. Si el tampón en la caja de gel parece turbio y las corridas de gel muestran resultados anormales, enjuague la caja de gel y use un gel nuevo antes de cargar su digestión para obtener mejores resultados.
Si se sospecha de unión al ADN, agregar una solución de SDS al 0.1 - 0.5% después de la digestión ayudará a que la enzima se disocie del ADN y permitirá que se muestre el patrón de bandas apropiado cuando se ejecute en el gel.
Consulte las pautas de uso de enzimas de restricción o la guía de resolución de problemas proporcionada para obtener información adicional.


Acerca del ADN plasmídico y la electroforesis en gel:

El ADN plasmídico puede existir en tres conformaciones: superenrollado, circular abierto (oc) y lineal (El ADN plasmídico superenrollado a menudo se denomina ADN circular cerrado covalentemente, ccc).
En vivo, El ADN plasmídico es un círculo superenrollado que le permite encajar dentro de la célula. En el laboratorio, después de una preparación cuidadosa del plásmido, la mayor parte del ADN permanecerá superenrollado, pero una cierta cantidad mantendrá mellas en una sola hebra. Dada la presencia de una ruptura en solo una de las hebras, el ADN permanecerá circular, pero la ruptura permitirá la rotación alrededor de la columna vertebral del fosfodiéster y se liberarán las superenrollamientos.
Un nudo superenrollado pequeño y compacto de ccc-DNA mantiene menos fricción contra la matriz de agarosa que un gran círculo abierto y flexible de oc-DNA. Por lo tanto, para el mismo tamaño total, el ADN superenrollado se ejecuta más rápido que el ADN circular abierto. El ADN lineal pasa primero a través de un extremo de gel y, por lo tanto, mantiene menos fricción que el ADN circular abierto, pero más que superenrollado. Por tanto, un plásmido sin cortar produce dos bandas en un gel, que representan las conformaciones oc y ccc. Sin embargo, si el plásmido se corta una vez con una enzima de restricción, las conformaciones superenrolladas y circulares abiertas se reducen todas a una conformación lineal.
Después del aislamiento, las mellas espontáneas se acumulan a medida que envejece la preparación del plásmido. Esto se puede ver claramente en los geles, ya que la proporción de las dos conformaciones cambia con el tiempo: las preparaciones de plásmidos que se han descongelado y vuelto a congelar muchas veces muestran más ADN oc que las preparaciones frescas.

Ésta es una fotografía en blanco y negro de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, después de la electroforesis de tres muestras de ADN. El gel estaba en una lámpara UV cuando se fotografió. Era ligeramente naranja, mientras que las bandas de ADN tenían un color naranja brillante debido a la unión específica del EthBr a las moléculas de ADN.
La migración fue de arriba hacia abajo: el ánodo (+) estaba en la parte inferior de este gel y el kathode (-) en la parte superior. Las moléculas de ADN más pequeñas migran más rápido que las grandes. Las bandas difieren en intensidad: los fragmentos más grandes se unen a más EthBr. Esto es muy bien visible en el tamaño del carril marcador 1. Todos los fragmentos en este carril se generan mediante la digestión de un ADN en particular, por lo que los fragmentos están presentes en cantidades equimolares y el brillo de las bandas corresponde a sus longitudes (conocidas).
Está claro que en carril 2 dos fragmentos están presentes en cantidades no equimolares (la banda superior debe contener moléculas de ADN más largas, pero es menos intensa que la banda inferior ..). En este caso particular, es porque representan dos formas circulares del mismo ADN plasmídico (oc arriba y ccc abajo). La proporción de las cantidades de ADN en ambas bandas depende de la edad y la calidad de la preparación del plásmido.

Consulte también SCLResources y gtLambda DNA para obtener información sobre el patrón de banda de gel de una digestión de ADN Lambda.


Generación rápida de líneas de tomate con esterilidad masculina con un uso de marcador para la producción de semillas híbridas mediante el sistema CRISPR / Cas9

Debido a su rendimiento agronómico superior, los híbridos de cultivos de hortalizas se aplican actualmente de forma extensiva. Sin embargo, la producción eficaz de híbridos requiere una laboriosa castración manual para asegurar la pureza de las semillas híbridas en el tomate debido a la falta de un sistema de esterilidad masculina eficaz. Aquí, creamos dos tipos de líneas masculinas estériles nucleares de tomate con diferentes marcadores de detección en un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9). Co-nocauts de masculino estéril 10 35 (Ms10 35 ) y glutatión S-transferasa (GSTAA) creó una línea de esterilidad masculina marcada por un hipocótilo verde. los Ms10 35 Se introdujo una mutación bialélica en el fondo del tomate lanudo, lo que dio como resultado el enlace de esterilidad masculina y un fenotipo no lanudo. Se seleccionaron fácilmente dos tipos de líneas con esterilidad masculina en la etapa de plántula por el color del hipocótilo o la densidad del tricoma y además mostraron una alta pureza de semillas durante la producción de semillas híbridas. Nuestro trabajo estableció el procedimiento para una transferencia rápida del fenotipo masculino estéril a los padres de híbridos sin modificación adicional por el sistema CRISPR / Cas9 que se puede aplicar prácticamente a la producción de semillas híbridas en tomate. Este método será la base y el ejemplo para la creación parental estéril de cultivos múltiples para la producción de híbridos con el sistema CRISPR / Cas9.

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¿Por qué veo bandas de ADN manchadas o sonrientes o una migración de ADN discrepante?

Muchos clientes usan geles prefabricados GelRed® o GelGreen® para mayor comodidad. Sin embargo, debido a que GelRed® y GelGreen® son tintes de alta afinidad diseñados para ser tintes más grandes para mejorar su seguridad, pueden afectar la migración del ADN en los geles prefabricados. Algunas muestras, como el ADN digerido por restricción, pueden migrar de forma anormal en los geles prefabricados GelRed® o GelGreen®.

Consejo n. ° 1: cargue menos ADN

Untar y sonreír en los geles prefabricados GelRed® o GelGreen® a menudo se debe a una sobrecarga de ADN. Si ve cambios en la migración de la banda o manchas y sonrisas, intente reducir la cantidad de ADN cargado. La cantidad de carga recomendada para escaleras y muestras de concentración conocida es 50-200 ng / carril. Para muestras de concentración desconocida, intente cargar la mitad o un tercio de la cantidad habitual de ADN. Esto generalmente resuelve los problemas de migración de bandas.

Consejo n. ° 2: pruebe el protocolo posterior a la tinción

Para evitar cualquier interferencia que el tinte pueda tener en la migración del ADN, recomendamos utilizar el protocolo de post tinción. Si su aplicación requiere cargar más cantidad de ADN de la recomendada, utilice el protocolo de postinción. Si bien recomendamos geles posteriores a la tinción durante 30 minutos, es posible que pueda ver bandas en tan solo cinco minutos, dependiendo de la cantidad de ADN presente. Las soluciones posteriores a la tinción se pueden reutilizar. Consulte la hoja de información del producto GelRed® o la hoja de información del producto GelGreen® para obtener protocolos detallados.


METHODBOOK

La electroforesis en gel de agarosa es la forma más fácil y común de separar y analizar el ADN. El propósito del gel podría ser observar el ADN, cuantificarlo o aislar una banda en particular. El ADN se visualiza en el gel mediante la adición de bromuro de etidio, que es mutagénico, o tintes patentados menos tóxicos como GelRed, GelGreen y SYBR Safe. El bromuro de etidio y los tintes patentados se unen al ADN y son fluorescentes, lo que significa que absorben la luz ultravioleta invisible y transmiten la energía como luz visible.

¿Qué porcentaje de gel?

La mayoría de los geles de agarosa se fabrican entre el 0,7% y el 2%. Un gel al 0,7% mostrará una buena separación (resolución) de fragmentos de ADN grandes (5 & # 821110 kb) y un gel al 2% mostrará una buena resolución para fragmentos pequeños (0,2 & # 82111 kb). Algunas personas llegan al 3% para separar fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical es más apropiado en este caso. Los geles de bajo porcentaje son muy débiles y pueden romperse cuando intenta levantarlos. Los geles de alto porcentaje son a menudo quebradizos y no se fijan uniformemente. Normalmente hago geles al 1%.

¿Qué tanque de gel?

Los geles pequeños de 8x10 cm (minigeles) son muy populares y dan buenas fotografías. Los geles más grandes se utilizan para aplicaciones como Southern y Northern Blot. El volumen de agarosa requerido para un minigel es de alrededor de 30 & # 821150 mL, para un gel más grande puede ser de 250 mL. Este método asume que estás haciendo un mini-gel.

¿Cuánto ADN debo cargar?

La gran pregunta. Es posible que esté preparando un gel analítico para solo mirar su ADN. Alternativamente, puede estar preparando un gel preparativo para separar un fragmento de ADN antes de cortarlo del gel para un tratamiento adicional. De cualquier manera, desea poder ver las bandas de ADN bajo luz ultravioleta en un gel teñido con bromuro de etidio. Normalmente, una banda es fácilmente visible si contiene aproximadamente 20 ng de ADN.

Ahora considere un ejemplo. Suponga que está digiriendo un plásmido que comprende 3 kb de vector y 2 kb de inserto. Está utilizando EcoRI (una enzima de restricción común) y espera ver tres bandas: el vector linealizado (3 kb), el extremo 5 'del inserto (0,5 kb) y el extremo 3' del inserto (1,5 kb). Para ver la banda más pequeña (0,5 kb), desea que contenga al menos 20 ng de ADN. La banda más pequeña es 1/10 del tamaño del plásmido sin cortar. Por lo tanto, debe cortar 10x20 ng, es decir, 200 ng de ADN (0.2 & # 181g). Entonces sus tres bandas contendrán 120 ng, 20 ng y 60 ng de ADN respectivamente. Las tres bandas serán claramente visibles en el gel y la banda más grande será seis veces más brillante que la banda más pequeña.

Ahora imagine cortar el mismo plásmido con BamHI (otra enzima de restricción popular) y que BamHI solo corta el plásmido una vez, para linealizarlo. Si digiere 200 ng de ADN en este caso, la banda contendrá 200 ng de ADN y será muy brillante.

Demasiado ADN cargado en un gel es algo malo. La banda parece correr rápido (lo que implica que es más pequeña de lo que realmente es) y, en casos extremos, puede alterar el campo eléctrico de las otras bandas, haciendo que también parezcan del tamaño incorrecto.

Muy poco ADN es solo un problema en el sentido de que no podrá ver las bandas más pequeñas porque son demasiado tenues.

Habiendo dicho todo eso, los geles de ADN son tolerantes y una amplia gama de cargas de ADN darán resultados aceptables. Por lo general, digerir y cargar 2 & # 82114 & # 181L de los 50 & # 181L obtenidos de un kit miniprep. Para las reacciones de PCR, depende de la PCR, pero en aplicaciones de rutina 10 & # 821120 & # 181L deberían ser suficientes para ver el producto en el gel.

¿Qué peine?

Esto depende del volumen de ADN que esté cargando y del número de muestras. Los peines con muchos dientes pequeños pueden contener 10 & # 181L. Esto no es bueno si desea cargar 20 & # 181L de resumen de restricción más 5 & # 181L de búfer de carga. Al decidir si un peine tiene suficientes dientes, recuerde que necesita cargar al menos un carril marcador, preferiblemente dos.

Fabricación del gel (para un gel al 1%, volumen de 50 ml)

Pesar 0,5 g de agarosa en un matraz cónico de 250 ml. Agregue 50 mL de 0.5xTBE, agite para mezclar.

Es bueno usar un recipiente grande, siempre que quepa en el microondas, porque la agarosa se desborda fácilmente.

Microondas durante aproximadamente 1 minuto para disolver la agarosa.

La solución de agarosa puede hervir muy fácilmente, así que sigue revisándola. Es bueno detenerlo después de 45 segundos y darle un remolino. Puede sobrecalentarse y NO hervir hasta que lo saque, después de lo cual hierve por todas sus manos. Entonces usar guantes y sosténgalo con los brazos extendidos. Puede usar un mechero Bunsen en lugar de un microondas, solo recuerde seguir mirándolo.

Déjelo enfriar en el banco durante 5 minutos hasta aproximadamente 60 ° C y # 176 ° C (demasiado caliente para sostenerlo con las manos desnudas).

Si tuvo que hervirlo durante mucho tiempo para disolver la agarosa, es posible que haya perdido algo de agua en vapor de agua. Puede pesar el matraz antes y después de calentarlo y agregar un poco de agua destilada para compensar este volumen perdido. Mientras la agarosa se enfría, prepare el tanque de gel listo, en una superficie nivelada.

Agregue 1 & # 181L de bromuro de etidio (10 mg / mL) y agite para mezclar

La razón para permitir que la agarosa se enfríe un poco antes de este paso es minimizar la producción de vapor de bromuro de etidio. El bromuro de etidio es mutagénico y debe manipularse con extrema precaución. Deseche la punta contaminada en un contenedor de desechos de bromuro de etidio específico. La solución de bromuro de etidio de 10 & nbspmg / mL se prepara usando tabletas (para evitar que se extraiga el polvo) y se almacena a 4 & # 176C en la oscuridad con etiquetas TOXIC.

Existen alternativas al uso de bromuro de etidio tóxico y mutágeno:

Vierta el gel lentamente en el tanque. Empuje las burbujas hacia un lado con una punta desechable. Inserte el peine y vuelva a comprobar que esté correctamente posicionado.

El beneficio de verter lentamente es que la mayoría de las burbujas permanecen en el matraz. Enjuague el matraz inmediatamente.

Deje reposar durante al menos 30 minutos, preferiblemente 1 hora, con la tapa puesta si es posible.

El gel puede parecer fraguado mucho antes, pero convertir el ADN en un gel demasiado pronto puede dar resultados terribles con bandas difusas manchadas.

Vierta 0,5 x tampón TBE en el tanque de gel para sumergir el gel a 2 & # 82115 mm de profundidad. Este es el búfer en ejecución.

Debe usar el mismo tampón en esta etapa que usó para hacer el gel. es decir. Si usó 0.6xTBE en el gel, use 0.6xTBE para el búfer de ejecución. Recuerde quitar los formadores de gel de metal si su tanque de gel los usa.

Preparando las muestras

Transfiera una cantidad adecuada de cada muestra a un tubo de microcentrífuga nuevo.

Pueden ser 10 & # 181L de una reacción de PCR de 50 & # 181L o 5 & # 181L de una digestión con enzimas de restricción de 20 & # 181L. Si está cargando los 20 & # 181L completos de una reacción de PCR de 20 & # 181L o digestión enzimática (como hago a menudo), entonces no es necesario usar tubos nuevos, simplemente agregue el tampón de carga en los tubos de PCR. Escriba en su libro de laboratorio el orden físico de los tubos para que pueda identificar los carriles en la fotografía del gel.

Agregue una cantidad adecuada de tampón de carga en cada tubo y deje la punta en el tubo.

Agregue 0.2 volúmenes de tampón de carga, p. Ej. 2 & # 181L en una muestra de 10 & # 181L. La punta se volverá a utilizar para cargar el gel.

Guardo mis marcadores ya mezclados con buffer de carga a 4 & # 176C. Sé cargar 2 & # 181L y cuánto ADN hay en cada banda. Consulte a continuación para obtener más información sobre esto.
Evite usar los pozos finales si es posible. Por ejemplo, si tiene 12 muestras y 2 marcadores, utilizará 14 carriles en total. Si su peine formó 18 pozos, entonces no utilizará 4 pozos. Es mejor no usar los pozos externos porque es más probable que funcionen de manera aberrante.

Continuar cargando las muestras y terminar con un último carril de marcador.

Carga los geles de derecha a izquierda con el gel orientado de manera que los pozos estén cerca del borde del banco y el ADN migrará lejos del borde del banco. Esto se debe a que los geles se publican, por convención, como si los pocillos estuvieran en la parte superior y el ADN se hubiera deslizado por la página.

Cierre el depósito de gel, encienda la fuente de alimentación y haga funcionar el gel a 5 V / cm.

Por ejemplo, si los electrodos están separados por 10 cm, ejecute el gel a 50 V. Está bien ejecutar el gel más lento que esto, pero no más rápido. Por encima de 5 V / cm, la agarosa puede calentarse y comenzar a derretirse con efectos desastrosos en la resolución de su gel. Algunas personas pasan el gel lentamente al principio (por ejemplo, 2 V / cm durante 10 minutos) para permitir que el ADN se mueva hacia el gel de manera lenta y uniforme, y luego acelere el gel más tarde. Esto puede dar una mejor resolución. Está bien ejecutar geles durante la noche a voltajes muy bajos, por ejemplo. 0.25 & # 82110.5 V / cm, si ya quieres ir a casa a las 11 en punto.

Verifique que fluya una corriente

Puede verificar esto en la fuente de energía, los miliamperios deben estar en el mismo rango de bola que el voltaje, pero la mejor manera es mirar los electrodos y verificar que estén generando gas (es decir, burbujas). Si no es así, compruebe las conexiones, que la fuente de alimentación esté enchufada, etc., etc. Se sabe que esto sucede si las personas usan agua en lugar de utilizar un tampón.

Controle el progreso del gel con referencia al tinte marcador.

Detenga el gel cuando el azul de bromofenol haya corrido 3/4 de la longitud del gel.

Apague y desenchufe el tanque de gel y lleve el gel (en su soporte si es posible) a la habitación oscura para mirar en la caja de luz ultravioleta.

Algunos soportes de gel no son transparentes a los rayos UV, por lo que debe colocar el gel con cuidado sobre la superficie de vidrio de la caja de luz. UV es carcinogénico y no debe permitirse que brille sobre la piel o los ojos desnudos. Por lo tanto, use protección facial, guantes y mangas largas.

El tampón de carga da color y densidad a la muestra para facilitar la carga en los pocillos. Además, los tintes están cargados negativamente en tampones neutros y, por lo tanto, se mueven en la misma dirección que el ADN durante la electroforesis. Esto le permite controlar el progreso del gel. Los tintes más comunes son el azul de bromofenol (Sigma B8026) y el xileno cianol (Sigma X4126). La densidad es proporcionada por glicerol o sacarosa.

La cantidad exacta de tinte no es importante
Almacene a 4 ° C y # 176 ° C para evitar el crecimiento de moho en la sacarosa. 10 ml de tampón de carga durarán años.

El azul de bromofenol migra a una velocidad equivalente al ADN de 200 & # 8211400 pb. Si desea ver fragmentos en cualquier lugar cercano a este tamaño, utilice el otro tinte porque el azul de bromofenol oscurecerá la visibilidad de los pequeños fragmentos. El cianol de xileno migra a aproximadamente 4 kb de equivalencia. Por lo tanto, no use esto si desea visualizar fragmentos de 4 kb.

Hay muchos tipos diferentes de marcadores de tamaño de ADN. En los viejos tiempos, el ADN definido más barato era el de bacteriófago, por lo que muchos marcadores son ADN de fagos cortados con enzimas de restricción. Muchos de estos siguen siendo muy populares, por ejemplo, lambda HindIII, lambda PstI, PhiX174 HaeIII. Estos dan bandas con tamaños conocidos pero los tamaños son arbitrarios. Elija un marcador con buena resolución para el tamaño de fragmento que espera ver en sus líneas de muestra. Por ejemplo, para productos de PCR diminutos, puede elegir PhiX174 HaeIII, pero para fragmentos de 6 kb, elegiría lambda HindIII. Más recientemente, las empresas han comenzado a producir marcadores de escalera con bandas a intervalos definidos, por ejemplo. 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 kb y así sucesivamente hasta 10 kb. Si conoce la cantidad total de ADN cargado en un carril marcador y conoce los tamaños de todas las bandas, puede calcular la cantidad de ADN en cada banda visible en el gel. Esto puede resultar muy útil para cuantificar la cantidad de ADN en sus bandas de muestra en comparación con las bandas de marcador. Es bueno cargar dos carriles de marcadores, flanqueando las muestras. Muchas empresas venden marcadores de tamaño de ADN. Vale la pena darse una vuelta por el más barato. A menudo, la empresa local de biotecnología de fregaderos de cocina vende excelentes marcadores.

TBE son las siglas de Tris Borate EDTA.

Las personas también usan TAE (Tris Acetate EDTA). Haga una reserva de 10x usando reactivos baratos. No utilice reactivos costosos de "grado analítico". La base Tris barata y el ácido bórico se pueden comprar al por mayor.

Disuelva los ingredientes en 1,9 L de agua destilada. pH a aproximadamente 8.3 usando NaOH y completar hasta 2 L.


INTRODUCCIÓN

La clonación de ADN se ha realizado tradicionalmente mediante la digestión de un plásmido fuente o fragmento de ADN y un vector receptor con enzimas de restricción, extrayendo los fragmentos digeridos de un gel y ligando los fragmentos purificados usando ADN ligasa (ver Protocolos actuales artículo Struhl, 1991). Este enfoque es adecuado para ligar uno o dos fragmentos de ADN en un vector, pero no funciona bien para ligar múltiples fragmentos en un vector en un solo paso. Afortunadamente, se encuentran disponibles nuevos métodos de clonación que permiten el ensamblaje de varios fragmentos en un vector en un solo paso, incluidos los métodos de clonación basados ​​en homología (por ejemplo, ensamblaje de Gibson) y los métodos que se basan en enzimas de restricción de tipo IIS, como la clonación Golden Gate (nombrada en referencia a la clonación de Gateway, pero también como juego de palabras con el nombre del puente). Golden Gate se realiza mediante una reacción de ligadura de restricción en un termociclador. Los parámetros para configurar y realizar una reacción de ensamblaje de Golden Gate estándar se describen en el Protocolo básico 1 y se describen en la Figura 1. La clonación de Golden Gate requiere que el vector y los insertos tengan una estructura específica con respecto a la presencia o ausencia de sitios de restricción específicos. En el Protocolo básico 2 se proporciona un método para convertir un vector de clonación regular en un vector de clonación compatible con Golden Gate. En el Protocolo básico 3 se proporciona un ejemplo para adaptar un inserto a la clonación de Golden Gate, que explica cómo diseñar cebadores para amplificación y clonación de un gen de interés en un vector Golden Gate.

La generación de unidades de transcripción definidas y el posterior ensamblaje de unidades de transcripción en construcciones multigénicas utilizando métodos de clonación tradicionales no es una tarea sencilla. Esto se debe no solo al ensamblaje de ADN en sí, sino también a la dificultad de diseñar estrategias de clonación para grandes construcciones. Una razón de esta limitación es que los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción utilizadas en cada paso de clonación todavía están presentes en las construcciones después de la ligación. Por lo tanto, deben usarse diferentes enzimas de restricción para cada paso sucesivo, lo que hace que la planificación de una estrategia de clonación sea extremadamente difícil o imposible cuando se trabaja con un gran número de genes. Se proporciona una solución a este problema estandarizando las piezas y la estrategia de ensamblaje, combinada con el uso de la clonación Golden Gate para el ensamblaje del ADN en cada paso de clonación. Esta estrategia es empleada por el sistema de clonación modular MoClo (Engler et al., 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner y Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner y Marillonnet, 2012). El sistema MoClo se basa en el uso de partes estándar que se fabrican mediante PCR, se clonan en una estructura de vector y se secuencian. Las partes estándar contienen la secuencia de ADN de un elemento genético básico, como un promotor, una secuencia de codificación o un terminador. El Protocolo básico 4 proporciona un método para clonar partes de productos de PCR en un solo paso (Fig. 1), y un Protocolo alternativo proporciona un método para clonar partes más grandes en dos pasos sucesivos. La estructura estandarizada de las partes permite que se reutilicen en muchas construcciones diferentes sin la necesidad de amplificación por PCR. También permite la estandarización del procedimiento de montaje. Las construcciones multigénicas se ensamblan a partir de piezas básicas mediante una serie de pasos de ensamblaje en un solo recipiente. La estrategia de clonación y los diferentes pasos de clonación utilizados con el sistema MoClo se describen en el Protocolo básico 5.

1: REALIZACIÓN DE UNA REACCIÓN TÍPICA DE CLONACIÓN DE GOLDEN GATE

El principio de la clonación Golden Gate consiste en usar una enzima de restricción de tipo IIS y ligasa en una ligadura de restricción para ensamblar varios fragmentos de ADN en un orden lineal definido en un vector en un solo paso (Fig. 2A). Las enzimas de restricción de tipo IIS escinden el ADN fuera de la secuencia de su sitio de reconocimiento de ADN. Por ejemplo, el sitio de restricción de BsaI (GGTCTC N ↓ N1norte2norte3norte4) consta de una secuencia de sitio de reconocimiento de ADN (GGTCTC) y un sitio de escisión de ADN (↓) que conduce a una proyección de ADN monocatenario de 4 nt (N1norte2norte3norte4) después de la digestión. Para ser adecuados para la clonación de Golden Gate, todos los fragmentos de ADN deben estar flanqueados por sitios de restricción para una enzima de restricción de tipo IIS, con una orientación hacia adentro tal que las secuencias del sitio de reconocimiento de ADN se escinden de los fragmentos de ADN durante la etapa de digestión (Fig. 2B). . El vector de destino también debe contener dos sitios de restricción para el mismo tipo de enzima IIS, pero con una orientación hacia afuera tal que los sitios de reconocimiento de ADN también se escinden del vector mediante la etapa de digestión. Finalmente, todos los salientes monocatenarios de 4 nt (también llamados sitios de fusión) en los extremos de los fragmentos de ADN y el vector deben ser únicos y complementarios para permitir la hibridación al final del siguiente fragmento o vector. Debido a que la molécula de ADN recombinante circular esperada no contiene sitios de restricción para la enzima utilizada, no se puede volver a digerir, lo que permite realizar la restricción y la ligadura en la misma mezcla de reacción. Esto permite que los fragmentos de ADN que se ligaron de nuevo en su esqueleto plásmido inicial se sometan a más ciclos de digestión y ligación hasta que finalmente se incorporen al producto recombinante deseado (Fig. 2C). Esto es útil para la transferencia de un fragmento de un vector al siguiente, pero es cada vez más importante cuando es necesario clonar varios fragmentos en un solo paso. Esto se debe a que el número de posibles eventos de ligadura aumenta exponencialmente con el número de plásmidos en la mezcla de ligadura, mientras que la posibilidad de obtener un producto ligado correctamente en un solo paso se vuelve cada vez más improbable (Fig. 2D). La ligadura de restricción conduce a una alta eficiencia de clonación y permite ligar hasta 24 fragmentos en una única reacción de clonación (Potapov et al., 2018).

Los fragmentos de ADN utilizados pueden ser fragmentos lineales obtenidos por PCR, pero también pueden ser secuencias clonadas en un plásmido circular. Este protocolo describe cómo realizar una reacción de clonación Golden Gate cuando tanto las partes del ADN como el vector de destino están disponibles como plásmidos.

Materiales

  • ADN plasmídico purificado:
    • Vector de destino Golden Gate (consulte el Protocolo básico 2 o disponible en Addgene u otros investigadores)
    • Insertos (ADN plasmídico)
    • 10 U / µl BsaI (New England Biolabs, cat. No. R0535L)
    • 10 U / µl BpiI (Thermo Fisher Scientific, n. ° de catálogo ER1012)
    • 10 U / µl BsmBI (New England Biolabs, cat. No. R0580s)
    • Espectrofotómetro (por ejemplo, Nanodrop 1000, Peqlab)
    • Placas de PCR de 0,2 ml (Thermo Fisher Scientific, nº de catálogo AB0600)
    • Sellos adhesivos para placas de PCR (Thermo Fisher Scientific, n. ° de catálogo AB0588)
    • Ciclador térmico (por ejemplo, C1000 Touch, BioRad)
    • Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
    • Incubadora de bloques a 37 ° y 42 ° C (p. Ej., Eppendorf ThermoMixer)
    • Incubadora de 37 ° C y agitadora
    • Matraces o tubos de cultivo
    • Software de análisis de ADN (por ejemplo, Vector NTI, Thermo Fisher Scientific)

    NOTA: Enzimas de tipo IIS que generan un saliente de 3 nt tras la escisión, como LguI (Thermo Fisher Scientific, nº de cat. ER1931), también se puede utilizar.

    Realizar ligadura de restricción

    1. Mida la concentración de ADN de los plásmidos del inserto y del vector utilizando un espectrofotómetro.

    2. Agregue cantidades iguales de cada inserto y vector a la mezcla de reacción. Utilice 20 fmol de cada plásmido en un volumen de reacción total de 15 o 25 µl de la siguiente manera:

    • X1 µl de ADN de vector
    • X2 µl inserto 1
    • X3 µl inserto 2
    • X4 µl inserto 3
    • 1,0 µl de ADN ligasa de T4
    • 0,5 µl de enzima tipo IIS
    • 1,5 µl de tampón de ligación 10 ×
    • H2O a 15 µl
    • X1 vector de µl
    • X2 µl inserto 1
    • X3 µl inserto 2
    • … …
    • Xnorte inserto de µl norte
    • 1,5 µl de ADN ligasa de T4
    • 1,0 µl de enzima tipo IIS
    • 2,5 µl de tampón de ligación 10 ×
    • H2O a 25 µl

    El volumen de cada plásmido de ADN se calcula mediante la fórmula: 20 (fmol) x tamaño (pb) / concentración (ng / µl) / 1520. Si el volumen calculado es demasiado bajo para un pipeteo preciso (& lt0,3 µl), el plásmido debe diluirse 10 veces en agua y debe agregarse un volumen 10 veces mayor de esta dilución.

    3. Incube la mezcla en un termociclador con las siguientes condiciones:

    • 50 ciclos: 37 ° C durante 2 min, 16 ° C durante 5 min
    • 50 ° C durante 5 min
    • 80 ° C durante 10 min
    • 16 ° C

    Cuando se usa BsaI, el paso final de digestión de 5 minutos se realiza a 50 ° C, ya que BsaI puede digerir tanto a 37 ° C como a 50 ° C. Por el contrario, cuando se usa BpiI, el paso de digestión final todavía se realiza a 37 ° C, ya que esta es la temperatura de digestión óptima para esta enzima.

    Transformar el producto en E. coli

    4. Agregue toda la mezcla de ligadura (15 o 25 µl) a 50 µl competente E. coli células e incubar en hielo durante 30 min.

    5. Choque térmico a 42 ° C durante 90 s. Deje que las células se recuperen en hielo durante 2 min.

    6. Añada 500 µl de medio LB o SOC y agite las células durante 45 min a 37 ° C en un ThermoMixer.

    7. Coloque en placas LB que contengan el antibiótico apropiado y X-gal. Incubar durante la noche a 37 ° C.

    Para reacciones de clonación con uno a tres insertos, placa de 10 a 20 µl. Placas de mayor volumen para un mayor número de insertos, porque el número de colonias obtenidas será menor. Por ejemplo, placa de 50 µl o más para las construcciones que constan de más de tres fragmentos.

    Elija colonias y evalúe clones

    8. Recoger colonias individuales e inocular 5 ml de medio LB. Incubar durante la noche a 37 ° C en una incubadora agitadora.

    Los vectores de clonación Golden Gate generalmente contienen un fragmento LacZ para el cribado azul-blanco (a veces se usa un operón de biosíntesis de carotenoides como marcador para el cribado rojo-blanco). Se recogen las colonias blancas. Para reacciones de clonación que no requirieron PCR para la preparación de los fragmentos, generalmente es suficiente recoger dos colonias. Para las reacciones de clonación hechas a partir de fragmentos amplificados por PCR, pueden ser necesarios más de dos clones para encontrar uno que no contenga mutaciones inducidas por PCR.

    9. Preparar el ADN con un kit miniprep, eluyendo en un volumen de 50 μl.

    10. Digerir 1 µl de eluato en una reacción de 10 µl usando una enzima adecuada (a menudo BsaYo o BpiCuando utilice el sistema MoClo, consulte el Protocolo básico 4) para confirmar el montaje correcto mediante huellas dactilares de ADN.

    11. Si se utilizó amplificación por PCR para preparar los fragmentos de ADN, secuencie el plásmido.

    2: ALOJAMIENTO DE UN VECTOR PARA LA CLONACIÓN DE GOLDEN GATE

    La clonación de Golden Gate requiere que los fragmentos de ADN y el vector receptor cumplan con requisitos específicos, como la presencia de sitios de restricción de enzimas de tipo IIS en los extremos de los fragmentos y el vector, y la falta de los mismos sitios de restricción en las secuencias internas de los fragmentos y vector. Muchos vectores adecuados para la clonación de Golden Gate están disponibles en varios grupos de investigación, y es probable que el número de vectores disponibles aumente en el futuro. Sin embargo, a veces se requiere convertir un vector de clonación estándar en un vector de clonación Golden Gate para las necesidades específicas de un usuario. Hay muchas estrategias para hacer eso, incluido el uso de ensamblaje de ADN de Gibson o la clonación de Golden Gate.

    Aquí se proporciona un ejemplo para convertir el vector pET-28b (+) para su uso con la clonación Golden Gate. En este ejemplo, un LacZ fragmento alfa flanqueado por dos BsaLos sitios I se insertan en el vector, reemplazando el sitio de clonación múltiple (Fig. 3A). los LacZ El fragmento se utilizará más tarde para el cribado azul-blanco. Aquí, los dos sitios de fusión que flanquean el LacZ Los fragmentos son AATG y GCTT, correspondientes al estándar MoClo para la clonación de secuencias codificantes (ver Protocolo básico 4). Sin embargo, pueden ser cualquier otra secuencia que desee un usuario, siempre que sean diferentes entre sí y no palindrómicas. De hecho, los salientes que consisten en secuencias palindrómicas pueden aparearse con el mismo saliente de una copia adicional del mismo fragmento en la otra orientación, lo que conduce a productos de ligación estables que, no obstante, son incorrectos y dan como resultado una reducción significativa de la eficacia de la clonación. En el ejemplo proporcionado aquí, el ATG que es parte del primer sitio de fusión corresponde a un codón de inicio de metionina, que se clona en marco con una etiqueta His presente en las secuencias del vector cadena arriba. El vector y el LacZ Los fragmentos se obtienen mediante PCR y el ensamblaje se realiza utilizando una segunda enzima de tipo IIS, BpiYa que hay cuatro BpiI en el vector, se eliminan utilizando cebadores diseñados para insertar mutaciones de un solo nucleótido en las secuencias de reconocimiento de ADN.

    Materiales adicionales (consulte también el Protocolo básico 1)

    • Cebadores de genes específicos de proveedores comerciales (por ejemplo, Eurofins Genomics)
    • Plantilla de plásmido para amplificación de LacZ casete (por ejemplo, pUC19, New England Biolabs, cat. no. N3041S)
    • Vector de ADN plasmídico (por ejemplo, pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, nº de cat. 69418)
    • Kit de amplificación por PCR de alta fidelidad (p. Ej., ADN polimerasa KOD Hot Start, Millipore Sigma, VWR, nº de cat. 71086-3)
    • Kit de purificación de fragmentos de PCR (p. Ej., NucleoSpin Gel y PCR Clean-up, Macherey Nagel, nº de cat. 740609.250)

    1. Diseñar cebadores para amplificar LacZ fragmento.

    Las ubicaciones y secuencias de los cebadores para este ejemplo se muestran en la Figura 3. Los dos primeros cebadores, Pr1 y Pr2, están diseñados para amplificar la LacZ fragmento de pUC19. pUC19 se selecciona como plantilla porque tiene un gen de resistencia a antibióticos diferente (Amp R) del vector receptor (Kan R). Esto reduce la probabilidad de obtener construcciones incorrectas por arrastre del vector plantilla no digerido cuando se seleccionan clones después de la transformación. El fragmento amplificado contiene una unidad funcional para el LacZ marcador para tramado azul-blanco. Los cebadores Pr1 y Pr2 tienen BpiI sitios de restricción (gaagac en la Fig. 3B) con sitios de fusión de 4 nt correspondientes a las secuencias AATG y GCTT, respectivamente. Los sitios de fusión en los dos cebadores van seguidos de BsaI sitios de restricción en orientación opuesta (complemento inverso de ggtctc = gagacc en la Fig. 3B). los BsaLos sitios I pasarán a formar parte del vector resultante y se utilizarán para la clonación de Golden Gate una vez que se haya creado el vector.

    El vector pET-28b contiene cuatro BpiI sitios de restricción en secuencias internas, que deben eliminarse mediante sustituciones de un solo nucleótido (un proceso llamado domesticación). Se necesitan ocho cebadores para este propósito (Pr3 y Pr6-14). Las mutaciones silenciosas se realizan para sitios de restricción ubicados en secuencias codificantes (en este caso, el represor Lac I, que tiene dos BpiI sitios). Se hace un par final de cebadores (Pr4 y Pr5) para evitar tener que amplificar fragmentos mayores de 2 kb, este par de cebadores es opcional. Todos los cebadores Pr3-14 tienen BpiI con un sitio de fusión seleccionado para que sea compatible con el sitio de fusión del fragmento al que se ligará.

    Al realizar el pedido, es suficiente obtener la menor cantidad posible (es decir, 0,01 µmol) con una purificación mínima (sin sal).

    1. Configure una reacción de PCR de 50 μl con el par de cebadores Pr1-2 utilizando pUC19 como plantilla.
    2. Configure seis reacciones de 50 μl con pares de cebadores Pr3-4 a Pr13-14 utilizando pET-28b (+) como plantilla.

    3. Ejecute 5 µl de cada reacción en un gel para ver si la PCR fue exitosa.

    4. Purifique los 45 μl restantes de cada reacción con un kit de columna (es decir, el kit de limpieza de ADN Macherey Nagel NucleoSpin).

    Esto separará el producto de PCR de cualquier ADN polimerasa y dNTP restantes, así como de los dímeros de cebadores que se producen a varios niveles en la mayoría de las reacciones de PCR.

    5. Cuantifique los productos de PCR purificados utilizando un espectrómetro como un Nanodrop.

    6. Realice la reacción de clonación Golden Gate (consulte el Protocolo básico 1) utilizando la enzima BpiTransformar el producto en E. coli (ver Protocolo básico 1) y seleccione colonias azules.

    En este ejemplo particular, los transformantes deben colocarse en placas sobre LB que contiene kanamicina y X-gal. Las colonias correctas no deben ser blancas, sino azules.

    7. Prepare el ADN con un kit miniprep.

    8. Digerir 1 µl con BsaYo en una reacción de 10 µl.

    Se esperan dos fragmentos de 5,3 kb y 506 pb para esta construcción particular.

    Es deseable secuenciar todo el plásmido con cebadores diseñados en varias posiciones dentro del plásmido porque se usó PCR para la amplificación del vector completo. Sin embargo, dado que algunas regiones necesarias para la replicación o expresión del marcador LacZ deberían ser funcionales si el plásmido se replica y las colonias son azules, es posible que no sea necesario secuenciar el plásmido completo. Como mínimo, se deben secuenciar todos los elementos que se requerirán posteriormente para la expresión del gen, incluida la región que se extiende desde el promotor T7 hasta el terminador. La secuenciación de la región que contiene los dos sitios BsaI introducidos es esencial para asegurarse de que la secuencia de los dos sitios de fusión sea la esperada.

    El vector de clonación ahora se puede utilizar para la clonación de Golden Gate.

    3: ADAPTACIÓN DE UN INSERT PARA LA CLONACIÓN DE GOLDEN GATE

    Este protocolo explica cómo diseñar cebadores para acomodar una secuencia de interés para la clonación de Golden Gate y luego clonar los fragmentos amplificados en un vector de destino de Golden Gate. Se da un ejemplo de clonación de la secuencia codificante de un Arabidopsis thaliana isoflavona reductasa amplificada de un Arabidopsis Plantilla de ADNc (acceso a Genbank NM_106183).

    Materiales adicionales (consulte también los protocolos básicos 1 y 2)

    • ADNc o plantilla de ADN para PCR (aquí, ADNc de Arabidopsis)
    • ADN plásmido del vector de destino Golden Gate

    1. Diseñar mutaciones silenciosas en el marco de lectura abierto de la secuencia de interés. en silico utilizando software de clonación (por ejemplo, Vector NTI).

    En este ejemplo, la secuencia de codificación contiene una BsaSitio I (Fig. 4A). Se elimina in silico mediante una sustitución de un solo nucleótido, lo que da como resultado una mutación silenciosa (mostrada en rojo en la Fig. 4B).

    2. Agregue a la secuencia de codificación dos sitios de fusión flanqueantes para compatibilidad con el vector.

    En este caso, agregue una A antes del codón de inicio para dar AATG y agregue GCTT después del codón de terminación.

    La secuencia agregada se muestra en rojo en la Figura 4B, y los sitios de fusión se muestran en azul.

    3. Seleccione un sitio de fusión en el sitio de la mutación.

    Se amplificarán dos fragmentos de PCR, uno a cada lado de la mutación (I y FR en la Fig. 4A), y luego se ensamblarán mediante un sitio de fusión que se solapa o está cerca del nucleótido mutado. El sitio de fusión debe ser diferente de los otros sitios de fusión (AATG y GCTT) y no debe ser palindrómico. Debe contener al menos una G o C (más, si es posible), ya que los sitios que contienen solo As o Ts pueden funcionar menos bien para el ensamblaje de ADN (Potapov et al., 2018). Cuando se necesitan muchos sitios de fusión, se puede utilizar el programa Ligase Fidelity Viewer (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) para verificar la idoneidad de todos los sitios. En el presente ejemplo, se selecciona una única secuencia, GGAC (mostrada en amarillo en la Fig. 4B).

    4. Diseñe cebadores comenzando en todos los sitios de fusión. Seleccione dos cebadores en orientación opuesta para cada sitio mutado (en este caso, solo un sitio). Haga que los cebadores sean lo suficientemente largos para dar una temperatura de fusión adecuada para la amplificación por PCR.

    5. Agregue la secuencia del BsaI sitio de reconocimiento (tt ggtctc a) al comienzo de todos los cebadores.

    La lista final de cebadores se muestra en la Figura 4C.

    6. Amplifique los dos fragmentos de PCR utilizando los pares de cebadores apropiados (Isof1-2 e Isof3-4 Fig. 4A) del Arabidopsis Plantilla de ADNc en una reacción de 50 µl. Ejecute 5 µl en un gel para comprobar que se amplificó el fragmento correcto. Purifique los 45 µl restantes utilizando un kit de columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

    7. Configure y realice la reacción de montaje como se describe (consulte el Protocolo básico 1).

    Debido a que este ejemplo describe una clonación simple con solo dos fragmentos clonados en el vector, una incubación simple a 37 ° C durante 2 horas, 50 ° C durante 5 minutos y 80 ° C durante 10 minutos debería ser suficiente.

    8. Transforme la mezcla de ligadura en competente E. coli, placa sobre LB que contiene kanamicina y X-gal, y criba las colonias resultantes.

    Las minipreparaciones se digieren con dos enzimas con sitios de restricción que flanquean el inserto o con enzimas que tienen sitios en el vector en el inserto. Debido a que se usó PCR para la clonación, el inserto clonado debe secuenciarse usando cebadores para las secuencias en el vector que flanquea el inserto.

    4: GENERACIÓN DE PIEZAS ESTANDARIZADAS PEQUEÑAS COMPATIBLES CON CLONACIÓN MODULAR JERÁRQUICA (MoClo) UTILIZANDO VECTORES DE NIVEL 0

    El ensamblaje de fragmentos de ADN de plásmidos mediante la clonación Golden Gate se puede realizar de manera rápida y eficiente. Por el contrario, el ensamblaje a partir de productos de PCR requiere más trabajo, porque los productos de PCR a menudo contienen dímeros de cebadores formados por anillamiento incorrecto de cebadores durante la amplificación por PCR. Debido a que los dímeros de los cebadores están flanqueados por los mismos sitios de restricción de tipo IIS que los productos de la PCR, se pueden clonar, lo que da como resultado construcciones incorrectas y reduce la eficacia de la clonación (Fig. 5). Incluso si no se producen dímeros de cebadores, las construcciones clonadas deben secuenciarse para asegurarse de que no contienen mutaciones inducidas por PCR. Por lo tanto, tiene mucho sentido tener un sistema en el que las partes de ADN clonadas y secuenciadas se puedan reutilizar en diferentes construcciones. Por ejemplo, las partes que contienen secuencias reguladoras como promotores y terminadores pueden reutilizarse en muchas construcciones diferentes.

    El sistema de clonación modular MoClo fue diseñado para facilitar la reutilización de partes clonadas en diferentes construcciones (Fig. 6). Se basa en el uso de piezas básicas que se ensamblan mediante la clonación de Golden Gate. Las partes básicas se clonan como módulos de nivel 0 y se ensamblan en vectores de clonación de nivel 1 para hacer unidades de transcripción. Las construcciones de nivel 1 luego se ensamblan para hacer construcciones multigénicas de nivel M y P. Las partes básicas contienen la secuencia de codificación de un elemento genético básico flanqueado por dos BsaI sitios de restricción en orientación opuesta (Fig. 7). La clonación de las partes básicas requiere la amplificación a partir de ADN o ADNc como plantilla. El producto amplificado se clona en un vector receptor usando clonación Golden Gate. Los pasos de clonación consisten en definir el tipo de pieza, diseñar primers que contienen BsaI sitios de restricción en los extremos de los fragmentos, eliminando sitios de las secuencias internas y clonando los fragmentos amplificados en un vector.

    Materiales adicionales (consulte también los protocolos básicos 1 y 2)

    • ADNc o plantilla de ADN para PCR (aquí, ADNc de Arabidopsis)
    • Vector de clonación universal de nivel 0 pAGM9121 (Addgene, plásmido n. ° 51833)

    1. Defina el tipo de módulo de nivel 0 (parte).

    Las partes pueden consistir en promotores, secuencias codificantes con o sin un codón de parada, etiquetas de fusión C- o N-terminales y terminadores (Fig. 7A). Cada parte está flanqueada por dos BsaI sitios en orientación opuesta (Fig. 7B). Las secuencias de 4 pb del BsaLos sitios de escisión (sitios de fusión) son específicos para cada tipo de módulo y definen qué partes se pueden fusionar. Por ejemplo, un módulo promotor con TACT como el sitio de fusión 3 '(Pro en la Fig. 7A) puede fusionarse solo con una secuencia líder no traducida con el mismo sitio de fusión en el extremo 5' (5UTR2 en la Fig. 7A). Para cada tipo de parte, está disponible un vector de clonación específico con sitios de fusión compatibles. Alternativamente, todos los tipos de partes se pueden clonar en el vector de clonación de nivel 0 universal pAGM9121 (Figuras 7D y 8) como se describe en este protocolo. Los módulos de nivel 0 también pueden estar compuestos de varias partes básicas. Por ejemplo, las construcciones que contienen una unidad de transcripción completa se pueden clonar directamente como módulos de nivel 0 entre los sitios de fusión GGAG y CGCT. También se pueden clonar otros tipos de elementos genéticos, como un sitio de recombinación de fagos o una región de unión a matriz, como módulos de nivel 0 entre los sitios de fusión GGAG y CGCT.

    2. Introducir mutaciones silenciosas en la secuencia genética. en silico.

    Las partes básicas no deben contener sitios de restricción para las enzimas de tipo IIS que se utilizan con el sistema MoClo (BsaI, BpiYo, y opcionalmente BsmBI). Los sitios de restricción se eliminan mediante la introducción de mutaciones de un solo nucleótido, que se realiza primero en silico. La eliminación de sitios internos en secuencias de codificación siempre se puede realizar con una mutación silenciosa. La eliminación de secuencias en las regiones promotoras es más difícil porque no siempre se conocen las secuencias importantes para la función promotora. Por lo tanto, después de domesticar las secuencias promotoras, será necesario validar experimentalmente en el organismo huésped que el promotor todavía funciona como se esperaba. Domesticación del Arabidopsis El gen UGT78D2 (acceso a GenBank NM_121711) se presenta aquí como ejemplo. Este gen contiene uno BsaYo sitio, dos BpiI sitios, y uno BsmSitio BI (Fig. 9A), que se eliminan mediante la introducción de cuatro mutaciones silenciosas (rojo en la Fig. 10).

    3. Agregue los dos sitios de fusión estándar que flanquean la pieza.

    Debido a que este módulo será una secuencia de codificación con un codón de terminación (CDS1), se agrega una A antes del codón de inicio para dar AATG, y la secuencia GCTT se agrega después del codón de terminación (ambos sitios de fusión están resaltados en azul en la Fig.10) .

    4. Agregue secuencias para compatibilidad con el vector de clonación universal.

    En este ejemplo, la parte se clonará en el vector de clonación de nivel 0 universal pAGM9121. Por lo tanto, CTCA y CGAG se agregan al principio y al final del fragmento para proporcionar la compatibilidad necesaria (resaltada en verde en la Fig. 10). Estas secuencias pasarán a formar parte del BsaI sitios de restricción que flanquearán el módulo final de nivel 0.

    5. Seleccione los sitios de fusión no estándar que se utilizarán para el ensamblaje de fragmentos de PCR.

    Estas son las secuencias de 4 nt que se utilizarán para ensamblar los productos de PCR durante la clonación. Deben ser diferentes entre sí y de los sitios de fusión que se utilizarán en el vector (CTCA y CTCG para el vector de clonación universal, o AATG y GCTT para el vector de clonación específico de CDS1). También deben ser diferentes del complemento inverso de cualquiera de los sitios de fusión seleccionados para evitar la ligadura de fragmentos inapropiada. Las secuencias seleccionadas están resaltadas en amarillo en la Figura 10.

    6. Diseñe imprimaciones comenzando en todos los sitios de fusión, estándar y no estándar.

    Para los sitios de fusión en los sitios mutados para eliminar los sitios de restricción, los cebadores se diseñan en ambas orientaciones. Las imprimaciones deben ser lo suficientemente largas para tener una temperatura de fusión adecuada. Esto se puede calcular utilizando cualquiera de los muchos programas disponibles en línea o se puede hacer manualmente.

    7. Agregue la secuencia de reconocimiento de enzimas de tipo IIS.

    Porque BpiI se utiliza para el montaje, la secuencia tt gaagac aa se añade a todos los cebadores. Las secuencias y ubicaciones de los cebadores se muestran en la Figura 9.

    8. PCR amplifique los fragmentos.

    Amplifica cinco fragmentos de Arabidopsis ADNc en reacciones separadas de 50 µl utilizando pares de cebadores Gtpr1-2 a Gtpr9-10 y una polimerasa correctora. Ejecute 5 µl en un gel para comprobar que cada fragmento se amplificó como se esperaba.

    9. Purificar los fragmentos en columna.

    Los fragmentos amplificados deben purificarse para eliminar la polimerasa, los cebadores y los dNTP restantes, y la mayoría de los dímeros de los cebadores que a menudo están presentes en la reacción. Si se amplificó un solo fragmento, basta con utilizar un kit de purificación de ADN (p. Ej., El kit de purificación de ADN Macherey Nagel). Puede ser necesaria la extracción en gel de los fragmentos de PCR del tamaño correcto si se amplificaron varios fragmentos de ADN.

    10. Configure la clonación en el vector pAGM9121 de nivel universal 0 como se describe (consulte el Protocolo básico 1).

    11. Transformar en E. coli y elija dos colonias blancas. Se pueden recoger más colonias más tarde si la secuenciación de estos clones no muestra la secuencia correcta.

    12. Examine las colonias digiriendo el ADN de miniprep con BsaI.

    13. Secuenciar los clones utilizando los cebadores vectoriales lev0seqf y lev0seqr (Fig. 9B).

    : GENERANDO GRANDES PIEZAS ESTANDARIZADAS COMPATIBLES CON LA CLONACIÓN MODULAR JERÁRQUICA (MoClo) USANDO NIVEL –1 VECTORES

    Mientras que las partes pequeñas (& lt1.2 kb) pueden secuenciarse usando cebadores estándar ubicados en secuencias de vector flanqueantes, las partes grandes no pueden secuenciarse completamente a partir de cebadores de vector. Se deben diseñar cebadores de secuenciación adicionales dentro de la parte para secuenciar su sección central. Para facilitar la secuenciación sin la necesidad de cebadores de secuenciación personalizados para cada parte, una estrategia alternativa consiste en clonar fragmentos de partes (subpartes) que no tengan más de 1-1.2 kb de longitud, secuenciar las subpartes utilizando cebadores vectoriales y luego ensamblar las sub-partes secuenciadas usando una segunda reacción de ensamblaje para hacer el módulo final de nivel 0 (Fig. 11). Las subpartes se clonan en un vector de clonación de nivel universal -1 (pAGM1311, Fig. 12).

    Materiales adicionales (consulte también el Protocolo básico 4)

    1. Defina el tipo de parte, introduzca mutaciones silenciosas, agregue los sitios de fusión estándar y agregue secuencias para compatibilidad con el vector de clonación universal como se describe (consulte el Protocolo básico 4, pasos 1-4).

    2. Seleccione los sitios de fusión no estándar que se utilizarán para el ensamblaje de fragmentos de PCR.

    Estas son las secuencias de 4 nt que se utilizarán para ensamblar los productos de PCR durante la clonación. Deben ser diferentes entre sí y de los sitios de fusión que se utilizarán en el vector (en este caso, ACAT y TTGT para el vector de nivel universal –1, consulte el paso 5 a continuación). También deben ser diferentes del complemento inverso de cualquiera de los sitios de fusión seleccionados para evitar la ligadura de fragmentos inadecuada. Las secuencias seleccionadas son las mismas que las del Protocolo básico 4 (resaltadas en amarillo en la Fig. 10).

    3. Diseñe cebadores comenzando en todos los sitios de fusión, estándar y no estándar, como se describe (consulte el Protocolo básico 4, paso 6).

    4. Agregue la secuencia de reconocimiento de enzimas de tipo IIS.

    Para la clonación en vectores de nivel -1, BsaI se usa para el ensamblaje y, por lo tanto, la secuencia tt ggtctc se añade a al extremo 5 'de todos los cebadores.

    5. Agregue secuencias para compatibilidad con el vector de clonación de nivel universal -1.

    Los dos sitios de fusión del vector de clonación universal son ACAT y TTGT, y contienen parte de un BpiI sitio de restricción que flanqueará la subparte después de la clonación (Fig. 12). Por tanto, las secuencias ACAT y ACAA (complemento inverso de TTGT) deben sumarse a los dos cebadores que delimitan el grupo de fragmentos de PCR que se clonarán juntos. Estas secuencias se añaden inmediatamente 3 ′ de la BsaI y antes del sitio de fusión del vector de nivel 0 universal (CTCA o CTCG). En este ejemplo, los primeros tres productos de PCR se clonarán juntos en el vector pAGM1311 de nivel universal 1, y los productos cuarto y quinto también se clonarán juntos en pAGM1311. Las secuencias del cebador y las ubicaciones para la construcción de primer nivel –1 (Gtpr1 ′ a 6 ′) y la construcción de segundo nivel –1 (Gtpr7 ′ a 10 ′) se muestran en la Figura 11.

    6. PCR amplifique los fragmentos (consulte el Protocolo básico 4, paso 8) utilizando los pares de cebadores apropiados (Gtpr1′-2 ′ a Gtpr9′-10 ′).

    7. Purificar los fragmentos en columna (Protocolo básico 4, paso 9).

    8. Configure dos reacciones de clonación Golden Gate como se describe (consulte el Protocolo básico 1) utilizando el vector pAGM1311 de nivel universal –1. Clone los primeros tres productos juntos en una reacción y los productos cuarto y quinto en la segunda reacción (módulos de nivel -1 en la Fig. 11A).

    9. Transformar en E. coli y elija dos colonias blancas. Se pueden recoger más colonias más tarde si la secuenciación de estos clones no proporciona la secuencia correcta.

    10. Examine las colonias digiriendo el ADN de minipreparación con BpiI.

    11. Secuenciar los clones usando los cebadores de vector Levm1seqF y Levm1seqR (Fig. 11B).

    12. Ensamble los módulos de nivel 0 de las subpartes de nivel –1. Configure una reacción de clonación Golden Gate para ensamblar los dos clones de nivel -1 seleccionados en el vector de clonación de nivel 0 universal pAGM9121 (consulte el Protocolo básico 1).

    13. Transformar en E. coli células.

    14. Examine las colonias digiriendo el ADN de minipreparación con BsaI.

    Dado que no se utilizó PCR para hacer estas construcciones, no se requiere secuenciación.

    5: MONTAJE DE UNIDADES DE TRANSCRIPCIÓN Y CONSTRUCCIONES MULTIGÉNICAS UTILIZANDO VECTORES MoClo DE NIVEL 1, M Y P

    El montaje de construcciones multigénicas utilizando el sistema MoClo se realiza de forma jerárquica (Fig. 6). El primer paso es ensamblar partes de nivel 0 en vectores de destino de nivel 1 para hacer construcciones que usualmente contienen una unidad de transcripción. El segundo es el ensamblaje de construcciones multigénicas que se realiza en etapas alternas utilizando vectores de nivel M y P. Se pueden ensamblar hasta seis unidades de transcripción en un vector de clonación de nivel M para hacer una construcción multigénica de nivel M. Luego, se pueden ensamblar hasta seis construcciones de nivel M en un vector de nivel P para hacer una construcción de nivel P que contenga hasta 36 unidades de transcripción. Las construcciones de nivel P se pueden ensamblar en vectores de nivel M para hacer construcciones aún más grandes. Este proceso puede repetirse indefinidamente, hasta que las construcciones sean demasiado grandes para ser clonadas como plásmidos en E. coli. Uso de ensamblajes de nivel M y P Bsayo y BpiYo de forma alterna.

    Materiales adicionales (consulte también el Protocolo básico 1)

    • Nivel 0 partes
    • Vectores de destino de nivel 1, M y P de MoClo Toolkit (Addgene, kit n. ° 1000000044)

    Ensamblar unidades de transcripción en vectores de nivel 1

    1. Seleccione piezas de nivel 0 estándar.

    El primer paso para planificar el montaje de una construcción multigénica es identificar todas las partes básicas necesarias para cada unidad de transcripción. Por ejemplo, para hacer una construcción que contenga cuatro unidades de transcripción, cada una compuesta de tres partes, incluido un promotor con 5′-UTR (pro + 5U), una secuencia codificante (CDS1) y una 3′-UTR con terminador (3U + Ter): se requiere un total de doce partes.

    En la Figura 7 se muestra una lista de todos los tipos de piezas. Las piezas que aún no están disponibles se clonan como se describe (consulte el Protocolo básico 4). Algunos ya están disponibles para plantas (MoClo Plant Parts Kit, Addgene, kit # 1000000047), Clamidia (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al., 2018) y cianobacterias (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Seleccione los vectores de destino de nivel 1.

    Se encuentran disponibles catorce vectores de nivel 1: siete para clonar una unidad de transcripción en la orientación directa en siete posiciones diferentes en la construcción final, y siete para la orientación inversa (Fig. 13A). Todos contienen dos BsaI sitios y los sitios de fusión GGAG y CGCT para proporcionar compatibilidad con módulos de nivel 0. También contienen dos BpiI sitios para la escisión de la unidad de transcripción ensamblada en el siguiente paso del ensamblaje. los BpiLos sitios de I fusion están diseñados para proporcionar compatibilidad de un vector a otro. En un ejemplo en el que se clonan cuatro unidades de transcripción en la orientación directa, se seleccionan los vectores para las posiciones 1 a 4 para la orientación directa (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3 y pL1F-4).

    los BpiEl sitio de fusión I al final del vector 7 (TGCC) es el mismo que el sitio al comienzo del vector 1, lo que permite clonar más de siete genes en una construcción multigénica reutilizando los mismos siete vectores indefinidamente. Por tanto, se clona una octava unidad de transcripción utilizando el vector 1, se clona una novena unidad de transcripción utilizando el vector 2, y así sucesivamente (Fig. 13C).

    En el ejemplo de la Figura 13C, se clonan dos unidades de transcripción en orientación inversa y, por lo tanto, se seleccionan los vectores para la clonación en orientación inversa. La elección de si una unidad de transcripción debe clonarse en una orientación u otra se decide únicamente por las necesidades del usuario.

    3. Reúna construcciones de nivel 1.

    Las construcciones se ensamblan mediante cuatro reacciones de clonación Golden Gate, cada una de las cuales contiene las tres partes básicas seleccionadas y el vector de nivel 1. En la Figura 14 se muestra un ejemplo de clonación de la primera unidad de transcripción. La reacción de clonación se realiza como se describe (ver Protocolo básico 1). Debido a que los vectores de nivel 1 contienen un LacZ fragmento para el cribado azul-blanco, se seleccionan dos colonias blancas. Como las unidades de transcripción ensambladas están flanqueadas por BpiI, el ADN de miniprep es verificado por BpiYo digestión.


    Cómo leer las bandas de electroforesis en gel

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    La electroforesis en gel es un tipo de biotecnología que separa moléculas en función de su tamaño para interpretar el ADN de un organismo. Se usa una enzima para separar una hebra de ADN de una fuente y el ADN se suspende en un tinte. Luego, el tinte se aplica a un gel cargado negativamente en un lado de una hoja. El ADN viaja automáticamente a través de un conjunto de franjas horizontales en la hoja para alcanzar el gel cargado positivamente en el otro lado. La electroforesis en gel es útil para determinar la relación entre dos o más especies o muestras individuales. También puede ayudar a establecer una huella dactilar de ADN.


    Materiales y métodos

    Tipo de reactivo (especie) o recursoDesignacionFuente o referenciaIdentificadoresInformación adicional
    Software, algoritmoMATLAB Release 2015a y 2018a Caja de herramientas de procesamiento de señales, Caja de herramientas de ajuste de curvas, Caja de herramientas de estadísticas y aprendizaje automáticoThe MathWorks Inc, 2020, Natick, Massachusetts, EE. UU.Fuente_ID: SCR_001622
    Software, algoritmoAdobe Illustrator CS6 y CC 2018 Adobe Inc, 2020, Dublín, República de IrlandaFuente_ID: SCR_010279
    Software, algoritmoFieldTrip 20170829Oostenveld et al., 2011 Stolk et al., 2018Fuente_ID: SCR_004849http://www.fieldtriptoolbox.org/
    Software, algoritmoEEGLAB_14_0_0bDelorme y Makeig, 2004Fuente_ID: SCR_007292https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php
    Software, algoritmoFreeSurfer 5.3.0Dale et al., 1999 Fischl, 2012Fuente_ID: SCR_001847https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/
    Software, algoritmoFormador de haz LCMVVan Veen y col., 1997
    Software, algoritmoIRASA (análisis autoespectral de remuestreo irregular)Wen y Liu, 2016b
    Software, algoritmoAnálisis espectral multipuntoPrerau et al., 2017
    Software, algoritmoFOOOF (Ajuste de oscilaciones y One Over F)Haller y col., 2018https://pypi.org/project/fooof/
    Software, algoritmoeBOSC (mejor detección extendida de OSCillation)Kosciessa et al., 2020bhttps://github.com/jkosciessa/eBOSC
    Software, algoritmoInformación mutuaQuian Quiroga y Panzeri, 2009http://prerau.bwh.harvard.edu/multitaper/
    Software, algoritmoBioSig Toolbox - Transformación LogitSchlogl y Brunner, 2008 Fuente_ID: SCR_008428
    Software, algoritmoModelo linear generalSiegel et al., 2015
    Software, algoritmoDetección de ondas lentasHelfrich et al., 2018 Staresina et al., 2015
    Software, algoritmoIntercambio aleatorio de bloques (estadísticas)Canolty et al., 2006 Aru et al., 2015
    Software, algoritmoConectividadiPLV (valor de bloqueo de fase imaginario) - Nolte et al., 2004 rhoortho (correlación de potencia orhtogonalizada) - Hipp et al., 2012
    OtroN / A

    Participantes

    Recopilamos cuatro conjuntos de datos independientes para este estudio a fin de evaluar la base neurofisiológica de los estados de excitación reducida, a saber, la anestesia general y el sueño. Registramos electroencefalografía no invasiva del cuero cabelludo (EEG) o EEG intracraneal (electrocorticografía ECoG) usando una rejilla subdural y electrodos de tira y electrodos de profundidad colocados estereotácticamente (SEEG para cobertura, ver Figura 1 - Figura suplemento 1).

    Anestesia

    Los estudios de EEG y de anestesia intracraneal se realizaron en el Hospital Universitario de Oslo. Todos los participantes o sus padres dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices del comité de ética local (Comités Regionales de Ética en Investigación Médica y Sanitaria en Oslo, caso número 2012/2015 y extensión 2012 / 2015–8) y la Declaración de Helsinki.

    Estudio 1 - EEG de anestesia del cuero cabelludo

    Diez pacientes (dos mujeres) sometidas a discectomía cervical anterior y fusión participaron en el Estudio uno y recibieron anestesia intravenosa total con remifentanilo y propofol. Tenían un estatus I - III de la American Society of Anesthesia, tenían entre 46 y 64 años (53,3 ± 5,7 años de media ± DE) y por lo demás sanos. Los datos se registraron desde la inducción de la anestesia hasta la recuperación del EEG de 25 canales según el diseño 10-20 (EEG Amplifier, Pleasanton, California, EE. UU.) Con una fila adicional de electrodos (F9, F10, T9, T10, P9, P10 ) a una tasa de digitalización de 512 Hz, o en el caso de un paciente a 256 Hz. El electrodo de referencia se colocó en CP1. Tres pacientes no se registraron durante todo el período de tiempo planificado: un registro solo se inició después de la inducción, mientras que dos se detuvieron antes de la recuperación (Juel et al., 2018).

    Estudio 2 - EEG intracraneal de anestesia

    En el Estudio 2 participaron un total de 12 pacientes (tres mujeres) con epilepsia intratable. Tenían entre 8 y 52 años (26,6 ± 13,2 años de media ± DE). Los datos se recogieron durante la explantación de los electrodos intracraneales desde la inducción de la anestesia hasta el punto de su extracción. Todos los pacientes recibieron anestesia intravenosa total con propofol y remifentanilo en el Hospital Universitario de Oslo. Todos los pacientes volvieron a recibir su medicación antiepiléptica habitual antes del procedimiento. Los datos se registraron en un sistema Natus NicoletOne con una capacidad de 128 canales y una tasa de digitalización de 1024 Hz para hasta 64 o 512 Hz para hasta 128 canales.

    Manejo anestésico

    Todos los pacientes recibieron una premedicación con 3,75 a 7,5 mg de midazolam (Dormicum, Basilea, Suiza); el grupo de EEG del cuero cabelludo con anestesia (Estudio 1) recibió 1 g adicional de paracetamol oral (Paracet, Weifa, Oslo, Noruega), así como 10 mg de oxicodona de liberación sostenida tableta (OxyContin, Dublín, Irlanda) para el manejo del dolor posoperatorio. El propofol (Propolipid, Fresenius Kabi, Uppsala, Suecia) y el remifentanilo (Ultiva, GlaxoSmithKline, Parma, Italia) se administraron mediante bombas de infusión controladas por computadora (B Braun Perfusor Space, Melsungen, Alemania) utilizando un programa de infusión controlada por objetivo (TCI). (Schnider para propofol y Minto para remifentanilo) para lograr concentraciones plasmáticas suficientes para la anestesia y analgesia. Antes del inicio de la anestesia, todos los pacientes recibieron una infusión de acetato de Ringer (5 ml / kg) para prevenir la hipotensión durante la inducción de la anestesia, así como 3-5 ml de lidocaína al 1% por vía intravenosa para prevenir el dolor durante la inyección de propofol. Todos los pacientes fueron pre-oxigenados con oxígeno al 100% y recibieron cisatracurio, un relajante muscular no despolarizante para intubación (Nimbex, GlaxoSmithKline, Oslo, Noruega). Después de la intubación, la fracción inspiratoria de oxígeno se redujo al 40% y no se utilizó óxido nítrico.

    Dormir

    Estudio 3 - EEG del cuero cabelludo del sueño

    El estudio tres se realizó en la Universidad de California en Berkeley. Todos los participantes fueron informados y dieron su consentimiento por escrito de acuerdo con el comité de ética local (Comité de Berkeley para la Protección de Sujetos Humanos número de protocolo 2010-01-595). Analizamos las grabaciones de 20 participantes jóvenes sanos (20,4 ± 2,0 años, media ± DE 12 mujeres). La polisomnografía se registró durante un período de 8 horas, así como durante 5 minutos de reposo en reposo con los ojos cerrados antes y después de dormir. Los datos se registraron en un sistema Grass Technologies Comet XL (Astro-Med, Inc, West Warwick, RI) con un EEG de 19 canales utilizando la configuración estándar 10-20, así como tres electromiografías (EMG) y cuatro electrooculografías (EOG ) electrodos en el canthi exterior. El EEG se hizo referencia a las mastoides vinculadas bilaterales y se digitalizó a 400 Hz (0,1 a 100 Hz Helfrich et al., 2018 Mander et al., 2015 Mander et al., 2014 Mander et al., 2013). La estadificación del sueño fue realizada por personal capacitado (B.A.M.) y según guías recientes (Iber et al., 2007).

    Estudio 4 - EEG intracraneal del sueño

    El estudio cuatro se realizó en el Centro Médico de la Universidad de California en Irvine. En este estudio se incluyeron diez pacientes con epilepsia (seis mujeres) que se sometieron a una localización prequirúrgica invasiva de su foco convulsivo. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado de acuerdo con los comités de ética locales de la Universidad de California en Berkeley y en Irvine (Comité para la Protección de Sujetos Humanos de la Universidad de California en Berkeley Protocolo número 2010-01-520 Protocolo de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California en Irvine Número 2014-1522, UCB se basa en el número de confianza de UCI 1817) y dio su consentimiento por escrito antes de la recopilación de datos. Tenían entre 22 y 55 años (33,1 ± 11,5 años media ± DE). La colocación de los electrodos fue dictada únicamente por criterios clínicos (Ad-Tech, SEEG: 5 mm de espacio entre electrodos Integra, Rejillas: 1 cm, 5 o 4 mm de espacio). Los datos se registraron con un sistema de grabación Nihon Kohden (amplificador de 256 canales, modelo JE120A), filtrado analógico por encima de 0,01 Hz y muestreado digitalmente a 5 kHz. Para facilitar la estadificación del sueño estándar de oro, se registró EOG, electrocardiografía (ECG) simultánea de cinco derivaciones y EEG mediante electrodos ejemplares de la configuración 10-20, según la localización de los electrodos intracraneales, pero en su mayoría consistentes en Fz, Cz, C3, C4 y Oz. Una señal EMG sustituta se derivó del ECG y EEG mediante filtrado de paso alto por encima de 40 Hz. La estadificación del sueño fue realizada por personal capacitado (B.A.M.) según guías recientes (Iber et al., 2007).

    Preprocesamiento de datos

    Estudio 1 - EEG de cuero cabelludo con anestesia

    Los datos se importaron a FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) y se clasificaron en segmentos de 10 s. Un análisis de componentes independientes (fastica Hyvärinen, 1999) se utilizó para limpiar los datos de artefactos sistemáticos como el ECG. La limpieza adicional de datos se realizó manualmente después de la inspección de un neurólogo (R.T.K.) y un anestesiólogo (J.D.L). En promedio, los pacientes tuvieron 1183 ± 81,42 épocas de diez segundos de las cuales 196 ± 103,19 se marcaron como ruidosas (15,81 ± 3,15%). No se excluyeron ni interpolaron canales. Los datos se referenciaron utilizando el promedio común, degradados y sin tendencia. Los períodos de vigilia se definieron como el tiempo antes de la inducción y después de la anestesia cuando los pacientes respondieron de manera confiable a las órdenes verbales del personal del estudio. Los períodos de anestesia se definieron como el tiempo transcurrido desde la inducción hasta la finalización de la aplicación de propofol.

    Estudio 2 - EEG intracraneal de anestesia

    Los datos se registraron con una tasa de digitalización de 512 Hz en ocho pacientes. Se registraron cuatro pacientes adicionales con una tasa de digitalización de 1024 Hz y estos conjuntos de datos se redujeron a 512 Hz. Luego, los datos se importaron a FieldTrip (Oostenveld et al., 2011), se clasificaron en segmentos de diez segundos y fueron inspeccionados por un neurólogo (R.T.K.) para detectar actividad epiléptica y luego se limpiaron manualmente de artefactos epilépticos y otros no neuronales. El estado de vigilia se definió como el tiempo antes del inicio del propofol, la anestesia se definió como el tiempo después de la pérdida del conocimiento (falta de respuesta a las órdenes verbales evaluadas por el personal del estudio y el anestesista asistente). Después de fusionar la resonancia magnética ponderada en T1 previa a la implantación y la tomografía computarizada (TC) posterior a la implantación, los electrodos se localizaron automáticamente mediante un atlas cerebral disponible abiertamente (Freesurfer Fischl, 2012) utilizando la caja de herramientas FieldTrip (Stolk et al., 2018) y con validación cruzada mediante inspección manual independiente realizada por dos neurólogos (RTKRFH). Se descartaron contactos en materia blanca o lesiones. Las señales restantes fueron luego bipolares referenciadas a su vecino lateral, degradado y sin tendencia.

    Estudio 3 - EEG del cuero cabelludo del sueño

    Se hizo referencia al EEG a mastoides vinculados bilaterales y los datos se importaron a EEGLAB (Delorme y Makeig, 2004) y se clasificaron en segmentos de 5 s. Las épocas que contenían artefactos (por ejemplo, parpadeo o movimiento de los ojos) fueron inspeccionadas manualmente y rechazadas por un anotador capacitado (B.A.M.). Ninguno de los canales fue descartado ni interpolado. En promedio, los participantes tuvieron 5748,9 ± 10,01 de estas cinco segundas épocas y 946,95 ± 542,68 de ellas fueron rechazadas (16,44 ± 2,98%), comparable a los registros de EEG de cuero cabelludo de anestesia. Los datos de los participantes del sueño saludable se han informado antes y se limpiaron con un enfoque comparable (Helfrich et al., 2018 Mander et al., 2015 Mander et al., 2014 Mander et al., 2013). Para un análisis más detallado en MATLAB (MATLAB Release R2018b, The MathWorks, Inc, Natick, Massachusetts, Estados Unidos), los datos se importaron a FieldTrip (Oostenveld et al., 2011).

    Estudio 4 - EEG intracraneal del sueño

    Los datos se importaron a FieldTrip (Oostenveld et al., 2011), se redujeron a 500 Hz y se segmentaron en segmentos de 30 s para su posterior análisis de datos. La localización anatómica se llevó a cabo fusionando imágenes de resonancia magnética (MRI) ponderadas en T1 antes de la implantación con MRI posimplantación y etiquetado automático y manual de la posición del electrodo (Stolk et al., 2018). Como se indicó anteriormente, se descartaron los epilépticos, la sustancia blanca y los canales con otros artefactos. Los datos fueron bipolares referenciados, degradados y sin tendencia.

    Análisis espectral

    (1) Para obtener espectros de potencia promedio, después de la eliminación del artefacto, los datos se clasificaron en segmentos de diez segundos para la anestesia y segmentos de 30 segundos para el sueño. (2) La descomposición de frecuencia de tiempo se logró utilizando una Transformación Rápida de Fourier (mtmfft, FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) de 0,5 Hz a 45 Hz en pasos de 0,5 Hz. El análisis se limitó a 45 Hz debido al ruido de línea a 50 Hz en las grabaciones de Oslo y luego se adoptó en todos los estudios consecutivos para mantener la coherencia. Para obtener estimaciones espectrales confiables, utilizamos un enfoque Multitaper (Prerau et al., 2017) basado en secuencias eslepianas prolate discretas (dpss anestesia: 9 conicidades para segmentos de 10 s, sin superposición, suavizado de frecuencia de ± 0,5 Hz sueño: 29 conicidades para segmentos de 30 s, sin superposición, suavizado de frecuencia de ± 0,5 Hz). (3) El espectro de potencia de cada estado se promedió sobre todas las muestras del estado (vigilia y anestesia o reposo, vigilia, etapa 3 del sueño con movimientos oculares no rápidos (N3) y sueño con movimientos oculares rápidos (REM)), canales y sujetos (Figura 1b, cy Figura 2b, c). Para una mejor comparación, visualizamos el efecto a nivel del cuero cabelludo. Para el Estudio 2, las grabaciones de EEG simultáneas no estaban disponibles.

    Para el análisis de control de la influencia de la longitud del segmento y el número de ahusamientos en la estimación de la pendiente espectral, los registros de EEG de anestesia se dividieron en segmentos de 30 s, mientras que el sueño se dividió en segmentos de 10 s. La descomposición de frecuencia de tiempo se realizó nuevamente con FieldTrip's mtmfft con un suavizado de frecuencia de ± 0,5 Hz y dpss disminuciones resultando en 29 para la anestesia y nueve para dormir. Tenga en cuenta que el número de conicidades es un resultado directo de la elección de la longitud del segmento y el suavizado de frecuencia (Prerau et al., 2017):

    Comparación de múltiples cónicos, conicidad única, periodograma y método de Welch

    Para la comparación de las relaciones señal-ruido de diferentes cálculos de potencia (Figura 2 — figura 6), se calculó la descomposición espectral Multitaper (Prerau et al., 2017) como se describe anteriormente. Para todos los cálculos posteriores, los datos del sueño se dividieron en segmentos de 30 s.

    Para el análisis de conicidad única, la potencia se calculó mediante la transformación rápida de Fourier mtmfft de FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) sin superposición después de aplicar un cono de Hanning. Las estimaciones espectrales se obtuvieron entre 0,5 y 45 Hz en pasos de 0,5 Hz.

    Para el cálculo del Periodograma, utilizamos MATLAB periodogram.m (MATLAB y Signal Processing Toolbox Release R2018b, MathWorks, Inc, EE. UU.) y la ventana rectangular predeterminada y el número de puntos definidos por la frecuencia de muestreo de 400 Hz. Para obtener el mismo número de observaciones que en los enfoques de conicidad múltiple y simple, se eligieron las frecuencias más cercanas a las elegidas en el enfoque de conicidad múltiple y simple anterior (0,5 a 45 Hz en pasos de 0,5 Hz) para un análisis más detallado .

    Para el método de Welch, la potencia se calculó con un tamaño de ventana de 30 sy sin superposición, lo que resultó en una sola ventana de Hamming empleando MATLAB pwelch.m función (MATLAB y Signal Processing Toolbox Release R2018b, MathWorks, Inc, EE. UU.). El número de puntos se definió por la tasa de muestreo. Nuevamente, las frecuencias más cercanas al enfoque de conicidad múltiple / simple se seleccionaron para un análisis más detallado a fin de permitir una comparación directa de las relaciones señal / ruido (SNR).

    La SNR se calculó dividiendo la potencia promedio de cada frecuencia en cada canal por la desviación estándar de esta frecuencia y canal.

    Estimación de pendiente espectral

    Calculamos la pendiente espectral ajustando una línea de regresión lineal al espectro de potencia en log-log espacio entre 30 y 45 Hz, ya que se había demostrado previamente que este rango se correlaciona mejor con cambios en la excitación en roedores y monos, así como con diferentes relaciones de excitación-inhibición en simulaciones (Gao et al., 2017). De acuerdo con informes anteriores, excluimos las frecuencias bajas que contienen una fuerte actividad oscilatoria, que puede distorsionar el ajuste lineal, así como el rango por encima de 50 Hz, que se confunde con el ruido de línea (50 Hz en Europa, 60 Hz en los EE. UU. ) así como los artefactos musculares de banda ancha.

    Luego adaptamos este rango al cálculo de la pendiente en los otros estudios por razones de coherencia. Para calcular una estimación resuelta en el tiempo de la pendiente espectral, calculamos el mejor ajuste de línea a los segmentos de 10 (anestesia) o 30 (sueño) segundos de los espectros de potencia de múltiples cintas (ver arriba) en log-log espacio usando ajuste de curva polinomial (polyfit.m, MATLAB y Curve Fitting Toolbox Release R2015a, The MathWorks, Inc, Natick, Massachusetts, Estados Unidos). Un sujeto en el Estudio 3 (EEG del sueño) exhibió un nivel de ruido excesivo durante la vigilia, por lo tanto, sus datos tuvieron que ser excluidos de todas las comparaciones de pendientes con la vigilia.

    Análisis de control de la estimación de pendiente espectral

    Para la evaluación de diferentes frecuencias centrales para la regresión lineal, la pendiente espectral se estimó a partir de registros del sueño intracraneal (Estudio 4) en función de diferentes frecuencias centrales (± 10 Hz alrededor de la frecuencia central comenzando desde 20 hasta 150 Hz) y diferentes ajustes longitudes (de 30 Hz en adelante con un aumento de 10 Hz de la longitud de ajuste hasta 100 Hz) utilizando el mismo procedimiento que se describe anteriormente (Figura 2 — Figura suplemento 5).

    Además, la pendiente espectral se estimó a partir de bajas frecuencias en diferentes registros: (1) EEG de cuero cabelludo de anestesia (Estudio 1) en el rango de 1 a 40 Hz como se informó anteriormente (Colombo et al., 2019) y (2) en EEG de cuero cabelludo en sueño ( Estudio 3) de 1 a 5 Hz con una longitud creciente de 5 Hz adicionales por ajuste después de descontar los componentes oscilatorios del espectro de potencia por medio de remuestreo irregular (IRASA Wen y Liu, 2016a Figura 2 — Figura suplemento 5c). La razón fundamental para utilizar este método fue excluir las fuertes oscilaciones de baja frecuencia, como las ondas lentas, que posiblemente podrían distorsionar la estimación de la pendiente.

    Además, estimamos la pendiente espectral desde el rango de 30 a 45 Hz utilizando dos algoritmos adicionales, el paquete FOOOF (Haller et al., 2018) y el algoritmo eBOSC (Kosciessa et al., 2020a) tanto en anestesia como en EEG del cuero cabelludo durante el sueño (Estudio 1 y 3). Mientras que eBOSC realiza una regresión lineal en log-log espacio usando MATLAB robustfit.m, FOOOF estima la parte oscilatoria y aperiódica del espectro de potencia con un ajuste del modelo: Primero se realiza un ajuste exponencial al espectro de potencia en semi-log espacio, entonces este ajuste se resta de la densidad espectral de potencia (PSD). La señal residual se trata como una combinación de oscilaciones y ruido y se ajusta repetidamente con múltiples ajustes gaussianos para detectar posibles picos oscilatorios hasta que se alcanza el piso de ruido. A continuación, los picos detectados se validan frente a la señal mixta oscilatoria / de ruido y se restan del PSD original. La nueva señal residual se vuelve a ajustar para una mejor estimación de la señal aperiódica. Ambos, los ajustes Multi-Gaussianos y el ajuste aperiódico mejorado se combinan en un modelo (comparar con la Figura 3 (Haller et al., 2018). Cuando el PSD no contiene una flexión, también llamada rodilla, en la señal aperiódica, entonces el algoritmo es equivalente a ajustar una línea en log-log espacio (Haller et al., 2018).

    Información mutua

    La Información Mutua (MI) es una métrica teórica de la información, que cuantifica la dependencia mutua de las dos señales, específicamente la cantidad de información obtenida sobre una variable al observar la otra (Quian Quiroga y Panzeri, 2009). Esto es particularmente útil para señales agrupadas no lineales. La información mutua entre las dos señales X e Y se definió como

    donde p (x, y) representa la función de probabilidad conjunta y p (x) yp (y) indican las probabilidades de clase. Las probabilidades se normalizaron por su suma. Para el análisis de IM (Figura 2b, Figura 2 — suplementos de figura 2, 5, 8 y 10), clasificamos la pendiente resuelta en el tiempo en segmentos de 30 s (el hipnograma se organizó en épocas de 30 s) y lo discretizamos en cinco contenedores (Wake , REM, N1, N2, N3) utilizando el discretizar.m función de MATLAB Signal Processing Toolbox Release R2015a (MathWorks Inc, EE. UU.). La información mutua se calculó utilizando el MutualInformation.m función de MATLAB Central File Exchange (Dwinell, 2010).

    Análisis de Beamformer

    Localizamos en origen la diferencia de pendiente entre la vigilia y el sueño en el EEG del cuero cabelludo (Estudio 3, n = 19, un paciente tuvo que ser excluido debido a pruebas de vigilia insuficientes Figura 2 - Figura suplemento 3). Las fuentes corticales de los datos de EEG a nivel del sensor se reconstruyeron utilizando un enfoque de formación de haces LCMV (variación mínima de restricción lineal) (Van Veen et al., 1997) para estimar la serie de tiempo para cada vóxel en la cuadrícula. Se utilizó una plantilla de resonancia magnética T1 estándar y un modelo de cabeza BEM (método de elemento de contorno) de la caja de herramientas FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) para construir una cuadrícula de plantilla 3D con un espacio de 1 cm en el espacio MNI estándar. La ubicación del electrodo se derivó de una plantilla estándar 10/20 de la caja de herramientas FieldTrip (Oostenveld et al., 2011). Antes de la proyección de la fuente, los datos del nivel del sensor eran un promedio común referenciado y cronometrado en segmentos de 30 s. Para minimizar la carga computacional, seleccionamos un segmento de datos de dos segundos del centro de cada época para construir la matriz de covarianza. A continuación, se calculó el filtro espacial LCMV utilizando la matriz de covarianza de los datos de EEG a nivel del sensor con una regularización del 5%. Se construyeron filtros espaciales para cada una de las posiciones de la cuadrícula por separado para suprimir al máximo la actividad de todas las demás fuentes. Los cursos de tiempo resultantes en el espacio fuente se sometieron a un análisis espectral utilizando una transformada de Fourier después de aplicar una ventana de Hanning. A continuación, se estimó la pendiente de PSD de cada segmento mediante regresión lineal en el rango de 30 a 45 Hz como se describió anteriormente. Los valores de la pendiente media durante el sueño se restaron de la pendiente media durante la vigilia en cada vóxel en el espacio fuente y luego se interpolaron en la fuente en un cerebro de plantilla estándar en el espacio MNI.

    Empleamos un enfoque basado en regiones de interés (ROI) que se centra en las subregiones de la corteza prefrontal (PFC), ya que una localización de fuente confiable de la actividad del lóbulo temporal medial (MTL) utilizando EEG de 19 canales sigue siendo un desafío. De acuerdo con nuestros resultados del estudio del sueño intracraneal (Estudio 4, Figura 2C y Figura 2 — figura del suplemento 4), definimos el mPFC y el PFC dorsolateral (dlPFC) como ROI. Para identificar el ROI a nivel de fuente, utilizamos el atlas de etiquetado anatómico automatizado (AAL) implementado en FieldTrip (Oostenveld et al., 2011). El ROI mPFC abarcó las siguientes regiones: 23 y 24 - ‘Frontal_Sup_Medial_L and R’, 25 y 26 - ‘Frontal_Med_Orb_L and R’, 27 y 28 - ‘Rectus_L and R’, 31 y 32 - Cingulum_Ant_L and R ’. El ROI dlPFC consistió en las siguientes etiquetas de tejido atlas: 3 y 4 - 'Frontal_Sup_L y R', 7 y 8 - 'Frontal_Mid_L y R', 11 y 12 - 'Frontal_Inf_Oper_L and R', 13 y 14 - 'Frontal_Inf_Tri_L and R' y 15 y 16 'Frontal_Inf_Orb_L and R'.

    Análisis de clasificación

    Empleamos un análisis discriminante lineal (LDA) para evaluar si la potencia de onda lenta o la pendiente espectral eran un mejor predictor de la vigilia o el sueño (Figura 1 — Suplemento de figura 4, Figura 3a-c). Utilizamos un enfoque de validación cruzada de dejar un ejemplo fuera que se repitió 50 veces después de muestrear al azar un número igual de ensayos de sueño y REM para igualar el número de muestras (clasificar.m, MATLAB y Statistics and Machine Learning Toolbox Release R2015a, MathWorks Inc, EE. UU.). Luego, cada muestra de la distribución submuestreada se retiró del conjunto de datos de entrenamiento una vez. El clasificador LDA se entrenó en las muestras restantes y se probó en la muestra de prueba retenida. A continuación, se evaluó el rendimiento del clasificador como porcentaje correcto. Dos de los 20 participantes con electroencefalograma del sueño tuvieron que ser excluidos debido a un número insuficiente de ensayos de vigilia. Los rendimientos de LDA se transformaron logit (logit.m de la caja de herramientas de BioSig (Schlogl y Brunner, 2008) y promediado entre canales antes de la comparación estadística.

    Modelo lineal general multivariado

    Para modelar las contribuciones únicas, así como la interacción entre la potencia de onda lenta (& lt1.25 Hz) y la pendiente espectral en la predicción de estados de excitación, primero escalamos ambos parámetros por medio de una puntuación z y luego calculamos una escala lineal general. modelo usando MATLAB fitlm.m (MATLAB y Statistics and Machine Learning Toolbox Release R2018b, MathWorks Inc, EE. UU.). Este método ofreció la posibilidad de modelar tanto los efectos principales como la interacción entre los dos predictores (Figura 3d-f). Críticamente, utilizamos un diseño desequilibrado, que implícitamente ortogonaliza la contribución de diferentes factores y, por lo tanto, destila la varianza explicada única no superpuesta (Siegel et al., 2015), que posteriormente se cuantificó mediante el tamaño del efecto (eta al cuadrado).

    Estimación de pendiente espectral durante una onda lenta

    Se detectaron eventos de ondas lentas (Figura 4, Figura 2, figura suplementaria 10) para cada canal según los algoritmos establecidos (Helfrich et al., 2018 Staresina et al., 2015): La señal sin procesar se filtró con un filtro de paso de banda entre 0,16 y 1,25 Hz y se detectaron cruces por cero. Luego, los eventos se seleccionaron usando un tiempo (0,8 a 2 s de duración) y un criterio de amplitud (percentil 75%). A continuación, los datos brutos se clasificaron en una época relativa al valle de la onda lenta (± 2,5 s). La descomposición de tiempo-frecuencia se calculó en ventanas de tiempo de 500 ms con una superposición de 250 ms utilizando FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) (mtmfft, suavizado de frecuencia de ± 2 Hz y conicidad de un dpss). La pendiente espectral se calculó mediante el mejor ajuste de línea en estas ventanas de tiempo en log-log espacio entre 30 y 45 Hz mediante ajuste de curva polinomial (polyfit.m, MATLAB y Curve Fitting Toolbox Release R2015a, MathWorks Inc, EE. UU.).

    Prueba estadística

    La pendiente espectral del estado despierto y anestesiado se comparó mediante la prueba t de Student para muestras pareadas (Figura 1b, c). Los valores t observados se compararon luego con una distribución sustituta después de volver a calcular la estadística de prueba 10,000 veces con etiquetas barajadas aleatoriamente (llamadas prueba t de permutación en el manuscrito). Las pruebas t post hoc fueron corregidas por Bonferroni para múltiples comparaciones.

    Para comparar tres estados (despierto, NREM y REM), utilizamos el análisis de varianza de medidas repetidas unidireccionales corregidas de Greenhouse-Geisser (Figura 2b yc RM-ANOVA). Adoptamos un enfoque similar al prueba t de permutación, donde la salida RM-ANOVA original se comparó con una distribución aleatoria después de voltear aleatoriamente las etiquetas de condición 10,000 veces (prueba de permutación ANOVA de medidas repetidas). El tamaño del efecto se calculó utilizando el método d de Cohen.

    Para evaluar la extensión espacial de los efectos observados en el EEG, calculamos las pruebas de permutación basadas en conglomerados para corregir las comparaciones múltiples como se implementó en FieldTrip (Oostenveld et al., 2011) (método de Monte-Carlo, criterio de tamaño máximo de 1000 iteraciones). Se obtuvo una distribución de permutación barajando aleatoriamente las etiquetas de condición y luego se comparó con la distribución real para obtener una estimación de la significancia. Los grupos espaciales se forman mediante pruebas t independientes de umbral de las diferencias de pendiente entre vigilia y anestesia (Figura 1b) o vigilia y sueño (Figura 2b) a un valor p & lt 0,05. Todos los resultados fueron corregidos por Bonferroni para múltiples comparaciones. Para controlar la EMG como un posible factor de confusión en el EEG del sueño (Estudio 3), utilizamos una correlación parcial (Spearman) que parcializó la pendiente de la EMG fuera de la correlación antes de calcular la prueba de permutación basada en grupos (Figura 2— figura suplemento 2b). Los coeficientes de correlación (valores r) se transformaron en valores t utilizando la siguiente fórmula (N = número de sujetos):

    Para la evaluación estadística de la Información Mutua (MI), empleamos pruebas sustitutivas (Figura 2b, Figura 2 — suplemento de figura 2a). Para obtener una distribución sustituta de los datos observados, utilizamos un procedimiento de intercambio de bloques aleatorios (Aru et al., 2015 Canolty et al., 2006). El número de repeticiones fue igual al número de etapas de sueño disponibles. En cada iteración, volvimos a calcular el MI de estos hipnogramas intercambiados en bloque con la pendiente discretizada resuelta en el tiempo para crear una distribución sustituta con la que pudiéramos comparar nuestra observación original. Para comparar los resultados entre sujetos, calificamos los valores restando la media de la distribución sustituta del IM observado y dividiéndolo por la desviación estándar de la distribución sustituta. Tenga en cuenta que una z = 1,96 refleja un valor p de dos colas no corregido de 0,05, mientras que una puntuación z de & gt2,8 indica un valor p significativo corregido por Bonferroni (p & lt0,05 / 19 canales = 0,0026). Los valores z se transformaron en valores p para la representación topográfica (Figura 2b Figura 2 — figura suplementaria 2a) con base en una función de distribución acumulativa normal (de dos colas).

    Conectividad

    Para el análisis de la conectividad fronto-parietal (Figura 2 - Figura suplemento 10), elegimos el electrodo Fz y Pz en nuestros registros de EEG del sueño (Estudio 3 n = 20) para calcular la coherencia de magnitud al cuadrado de frecuencias de 0.1 a 64 Hz en 0.1 Pasos de Hz usando el mscohere.m función de MATLAB Signal Processing Toolbox (Release R2015a, MathWorks, Inc, EE. UU.) como se describió anteriormente (Pal et al., 2016 Pal et al., 2015). Tenga en cuenta que las estimaciones de coherencia reflejan tanto los cambios de potencia como los cambios en la sincronía de fase. Por lo tanto, también calculamos el valor de bloqueo de fase (PLV) y las correlaciones de amplitud (rho) para desenredar los efectos de fase y potencia, respectivamente. Para descontar los efectos del diferencial de volumen, calculamos el PLV imaginario (Nolte et al., 2004) (iPLV) y las correlaciones de potencia ortogonalizadas (Hipp et al., 2012) (rhoortho).

    Luego cuantificamos la información mutua (MI ver arriba) para comparar qué tan bien los resultados capturan los cambios entre las diferentes etapas del sueño durante la noche (Quian Quiroga y Panzeri, 2009). Para este análisis solo utilizamos los valores de pendiente del electrodo Fz (ya que estábamos calculando las otras medidas en Fz-Pz) y definimos theta de 4 a 10 Hz análogo a Pal et al., 2016 Pal et al., 2015.


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