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Experimentos in vitro frente a aquellos con organismos muertos y tejido fijado

Experimentos in vitro frente a aquellos con organismos muertos y tejido fijado



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¿El término in vitro implica necesariamente que el organismo / órganos / células de estudio son muerto?

Si no es así, ¿existe un término latino alternativo para referirse a los estudios de muerto materia biológica? (por ejemplo, en Connectomics donde el tejido está biológicamente muerto y ha sido fijado y seccionado con un micrótomo)


¿El término in vitro ¿Implica necesariamente que el organismo / órganos / células de estudio están muertos?

No, in vitro Los estudios a menudo se llevan a cabo con células vivas, solo piense en in vitro fertilización. Lo más cercano que se me ocurre para lo que quieres es histología, pero creo que incluso esto abarca estudios de células y tejidos vivos.


Macrófagos tisulares: heterogeneidad y funciones

Los macrófagos están presentes en todos los tejidos de los vertebrados, desde la mitad de la gestación hasta la vida, constituyendo un sistema de órganos ampliamente disperso. Promueven la homeostasis respondiendo a cambios internos y externos dentro del cuerpo, no solo como fagocitos en defensa contra microbios y en la eliminación de células muertas y senescentes, sino también a través de funciones tróficas, reguladoras y reparadoras. En esta revisión, describimos la heterogeneidad fenotípica de los macrófagos en diferentes entornos tisulares, prestando especial atención a las funciones específicas de los órganos.


Biología Capítulo 1

El ADN migra por toda la célula e interactúa directamente con otras moléculas del citoplasma.

El ADN se traduce en proteína y luego se transcribe a ARN.

La información en el ADN se transcribe a ARN y luego generalmente se traduce en proteína.

A-Los individuos de una población de cualquier especie varían en muchos rasgos hereditarios.

B-Los individuos con rasgos hereditarios que se adaptan mejor al entorno local generalmente producirán un número desproporcionado de descendientes sanos y fértiles.

C-Una población de cualquier especie tiene el potencial de producir mucha más descendencia de la que sobrevivirá para producir descendencia propia.

Biologia de sistemas . reduccionismo

descendencia de un antepasado común. adaptación a través de la selección natural

asegura que la variable que se está probando se mida sin errores

asegura que las hipótesis se puedan confirmar con certeza

permite el rechazo de hipótesis

Observación no sistemática y análisis de datos.

Si los animales observados requieren moléculas orgánicas como nutrientes, entonces se puede concluir que todos los animales requieren moléculas orgánicas como nutrientes.

Debido a que los gusanos carecen de huesos, se clasifican como invertebrados.

Un paramecio se mueve mediante el movimiento rítmico de sus cilios.

alguna observación o experimento concebible podría revelar si una hipótesis dada es incorrecta

se ha demostrado que la hipótesis es incorrecta

solo un experimento controlado puede probar si la hipótesis es correcta o incorrecta

al reformular una hipótesis alternativa

durante la formulación de una hipótesis

durante la (s) observación (es) inicial (es)

explicar los eventos que ocurren naturalmente

determinar las causas físicas de los fenómenos físicos

Formular hipótesis comprobables en la búsqueda de causas naturales para fenómenos naturales.

que el fármaco parece tener poco efecto sobre la transmisión viral en la dosis administrada

nada, porque no se utilizó ningún grupo de control en la prueba de la droga

que el fármaco es eficaz y que deben comenzar las pruebas en humanos

cultivar plantas de frijol con y sin sodio

buscar sodio en los tejidos de las hojas mediante autorradiografía

medir la cantidad de sodio en algunas plantas de frijoles

es demasiado difícil para los investigadores que realizan trabajo de campo

no es necesario si el científico obtiene suficiente información de antecedentes

siempre debe hacerse cambiando una variable

No, no es necesario probar solo una variable por experimento, especialmente cuando el tiempo es esencial.

Siempre que el experimento se repita un número suficiente de veces, no importa cuántas variables se utilicen.

Sí, un experimento debe probar solo una variable a la vez. De esa forma, el experimento deberá realizarse solo una vez.

un concepto bien fundamentado que tiene un amplio poder explicativo

una idea mal apoyada que tiene poco respaldo pero que puede ser correcta

no es correcto a menos que tenga varios años

Ninguna de las respuestas enumeradas es correcta.

tanto la retroalimentación negativa donde la vía se cierra como la retroalimentación positiva donde la vía se acelera

retroalimentación negativa donde el camino no cambia

retroalimentación negativa donde el camino se acelera

retroalimentación positiva donde el camino se cierra

Independientemente de si los modelos se colocaron en la playa o en el hábitat interior, el modelo camuflado siempre actuó como el grupo __________.

Molécula, tejido, célula, orgánulo, órgano

Comunidad, población, ecosistema, hábitat, biosfera

Organismo, ecosistema, comunidad, población, biosfera

Tejido, sistema de órganos, órgano, célula, organismo

transcripción, traducción y plegamiento de proteínas

traducción, transcripción y plegamiento de proteínas

plegamiento, traducción y transcripción de proteínas

plegamiento, transcripción y traducción de proteínas

son bacterias, arqueas y eukarya

son animalia, plantae y hongos

son bacterias, arqueas y animales

son bacterias, protistas y animalia

nos permite reducir los sistemas complejos a componentes más simples que son más manejables de estudiar

comienza a escala global para estudiar biología

se centra en la información que se ve desde el espacio

nunca se utiliza en el estudio de la biología

formando y probando hipótesis

análisis y comentarios de la comunidad

exploración y descubrimiento

beneficios y resultados sociales

Implica el ciclo químico desde la energía luminosa del sol para la producción de energía química en los alimentos hasta la descomposición y el retorno de los productos químicos al ciclo.

Implica el ciclo químico desde la energía química en los alimentos hasta la energía luminosa del sol y la pérdida de calor del ecosistema.


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1.4. Cultivo de células primarias

Como se discutió anteriormente, el cultivo celular primario es el primer cultivo de células, tejidos u órganos derivados directamente de un organismo, en otras palabras, es el cultivo antes del primer subcultivo, mientras que la línea celular es para el mantenimiento o propagación de un cultivo después del subcultivo. Existen determinadas técnicas disponibles para el desarrollo de cultivos de células primarias, como:

  • Desagregación mecánica.
  • Desagregación enzimática.
  • Técnicas primarias de explante.

1.4.1. Desagregación mecánica

Es necesario desagregar los tejidos blandos como los tumores blandos. El enfoque mecánico implica cortar o recolectar tejido y la posterior recolección de células derramadas. Esto se puede lograr tamizando, inyectando con jeringa y pipeteando. Este procedimiento es económico, rápido y sencillo, sin embargo, todos estos enfoques implican el riesgo de daño celular, por lo que la desagregación mecánica solo se utiliza cuando la viabilidad de las células en el rendimiento final no es muy importante.

1.4.2. Desagregación enzimática

Este enfoque implica la desagregación eficiente de células con alto rendimiento mediante el uso de enzimas como tripsina, colagenasa y otras. La desagregación basada en enzimas permite la hidrólisis del tejido conectivo fibroso y la matriz extracelular. Actualmente, el método enzimático se utiliza ampliamente ya que ofrece una alta recuperación de células sin afectar la viabilidad de las células.

1.4.2.1. Disgregación o tripsinización basada en tripsina

Esto permite la desagregación del tejido usando tripsina, generalmente tripsina cruda porque esta tripsina contiene otras proteasas.Además, las células pueden tolerar bien la tripsina cruda y el efecto final de la tripsina cruda puede neutralizarse fácilmente con suero o inhibidor de tripsina (se requiere la suplementación con inhibidor de tripsina en el caso de medios sin suero). La tripsina pura también se puede utilizar para la desagregación de células, siempre que sea menos tóxica y muy específica en su acción. En la figura 1.1 se muestra una descripción general del desarrollo del cultivo de células primarias. A continuación se describen dos enfoques comunes, a saber, la tripsinización en caliente y en frío.

Figura 1.1. Enfoques alternativos para la preparación de cultivos celulares primarios.

Tripsinización caliente

Este enfoque se utiliza ampliamente para el desglose de células. Durante el paso inicial, el tejido cortado se lava con una solución de sal basal de disección y posteriormente se transfiere a un recipiente con tripsina tibia (37 ° C). A intervalos regulares de 30 minutos, el contenido se agita correctamente. Luego, habiéndose disociado el sobrenadante, las células se separan para dispersarse en un medio adecuado. Se puede lograr una dispersión eficiente de las células colocando el recipiente sobre hielo.

Tripsinización fría

Este método también se llama tripsinización con preexposición al frío. En este proceso se reduce la posibilidad de daño celular debido a la exposición constante a la tripsina, lo que da como resultado un alto rendimiento de células viables con una tasa de supervivencia mejorada para las células (después de 24 h de incubación). Dado que este método no implica agitación o centrifugación frecuentes, puede adoptarse convenientemente en el laboratorio de investigación. Durante este proceso, después de lavar y picar, los trozos de tejido se mantienen sobre hielo en un vial y luego se someten a tratamiento con tripsina fría durante 6-24 h. Luego, después del tratamiento con tripsina fría, la tripsina se elimina y se desecha. Sin embargo, los fragmentos de tejido todavía contienen tripsina residual. Estos fragmentos se incuban a 37 ° C (durante 20 a 30 min) seguido de pipeteo repetido. Esto fomentará la dispersión de células. Las células completamente dispersas pueden contarse usando un contador de células y diluirse adecuadamente y luego utilizarse posteriormente.

Inconvenientes de la desagregación de tripsina

La tripsinización de células puede dañar algunas células, como las células epiteliales, y en ocasiones no es eficaz para determinados tejidos, como el tejido conectivo fibroso, por lo que también se recomiendan otras enzimas para la disociación de células.

1.4.2.2. Desagregación basada en colagenasa

La colagenasa es una enzima responsable de la ruptura de los enlaces peptídicos en el colágeno. El colágeno es una proteína estructural que se encuentra abundantemente en los animales superiores, principalmente en la matriz extracelular del tejido conectivo y el músculo. La colagenasa, principalmente colagenasa cruda, se puede utilizar con éxito para la disgregación de varios tejidos que pueden o no ser sensibles a la tripsina. También se ha experimentado con colagenasa purificada, pero ha mostrado malos resultados en comparación con la colagenasa cruda. Hasta ahora, la desagregación de colagenasa se ha llevado a cabo en varios tumores humanos, tejidos epiteliales, cerebro, pulmones y otros tejidos de mamíferos. La combinación de colagenasa con hialuronidasa ofrece mejores resultados en la disgregación del hígado de rata o conejo, lo que se puede lograr mediante la perfusión de todo el órgano. en el lugar. Varios investigadores también han utilizado tripsina y colagenasa en combinación para disociar las células para desarrollar suero de pollo.

Este proceso implica una transferencia inicial del tejido deseado a una solución de sal basal que contiene antibióticos. A continuación, se lava con sedimentación y luego se transfiere a un medio que contiene colagenasa. La solución se incuba durante 1 a 5 días, seguido de pipeteos repetidos para una dispersión uniforme de las células. Se fomenta la separación de estas células dispersas manteniendo la solución en una fase estacionaria para estimular aún más el asentamiento de las células, como se muestra en la figura 1.2.

Figura 1.2. Curva de crecimiento estándar de células en un cultivo.

1.4.2.3. Otras enzimas

Además de las enzimas mencionadas anteriormente, se han probado algunas otras enzimas como las proteasas bacterianas (por ejemplo, dispasa, pronasa), pero desafortunadamente no han mostrado resultados significativos. Sin embargo, las enzimas como la hialuronidasa y la neuraminidasa han recibido atención debido a sus importantes resultados y, por lo tanto, pueden utilizarse potencialmente en conjugación con las enzimas discutidas anteriormente.

1.4.3. Técnica de explante primario

En 1907 Harrison proporcionó la primera demostración de la técnica de explante primario, que posteriormente sufrió muchas modificaciones. En la figura 1.1 se representa un protocolo simple para la técnica de explante primario. Al igual que en los procedimientos anteriores, en este proceso el tejido se suspende inicialmente en una solución de sal basal y luego se corta adecuadamente y se lava por sedimentación. Los fragmentos de tejido se distribuyen uniformemente sobre la superficie de crecimiento. A esto le sigue la adición de un medio adecuado y luego la incubación durante 3-5 días. El medio viejo se reemplaza por medio nuevo a menos que no se logre el crecimiento deseado o un crecimiento considerable de las células. Una vez que se logra un crecimiento óptimo, los explantes se separan y se transfieren a nuevos recipientes de cultivo que contienen medio fresco.

Esta técnica se utiliza principalmente para desagregar pequeñas cantidades de tejido. La desagregación mecánica y enzimática no es adecuada para pequeñas cantidades de tejidos, ya que existe el riesgo de daño celular que, en última instancia, puede afectar la viabilidad celular. Un gran inconveniente de esta técnica es la escasa adhesividad de ciertos tejidos en la superficie de crecimiento (material del sustrato), lo que puede crear problemas en la selección de células para el crecimiento deseable. Sin embargo, esta técnica se ha utilizado con frecuencia para cultivar células embrionarias, en particular células gliales, fibroblastos, mioblastos y células epiteliales.


Procedencias escalonadas

1. Cultivo celular [TIEMPO & # x0007E 4 días]

1.1) Sembrar células en placas de cultivo de 100 mm a 25 & # x0201330% de confluencia y cultivarlas durante 3 días (a 37 & # x000B0C y 5% de CO2) en medio de cultivo apropiado (por ejemplo, células M3, use DMEM con 10% (vol / vol) FBS [ver Configuración de reactivo)].

1.2) Retire el medio de la placa de cultivo mediante aspiración suave, lave las células dos veces con 1X PBS estéril, agregue tripsina-EDTA lo suficiente para cubrir completamente las células y colóquelas a 37 ° C durante 2 min. Después de la incubación, agregue un volumen igual de medio completo para detener la reacción de tripsina-EDTA y recolecte todo el líquido en un tubo estéril. Centrifugue la suspensión celular durante 5 min a 300 ga TA, luego retire la solución de tripsina-EDTA por aspiración y mezcle las células con medio fresco que contenga suero. Determine la concentración celular con un hemocitómetro.

? Solución de problemas

1.3) (Paso opcional, dependiendo del tipo de célula utilizado) Recubrimiento de placas con sustratos de matriz extracelular (ECM) (por ejemplo, gelatina, colágeno o fibronectina) para adherir las células e incubarlas a 4 & # x000B0C durante la noche.

? Solución de problemas

2. Ensayo de cicatrización de heridas con inserto de silicona frente a ensayo de rayado con punta de pipeta

2.1) Siembre la suspensión celular en cada pocillo con el inserto de cultivo de silicona en el inserto de cultivo de 35 mm & # x003BC-placa para realizar el ensayo de cicatrización de heridas (opción A), o alternativamente sembrar células en toda la superficie del cultivo de 35 mm & # x003BC-placa para Realice el ensayo de raspado (opción B) (consulte el esquema de la Figura 1A). Incubar los platos durante 6 ho durante la noche a 37 & # x000B0C y 5% CO2, permitiendo que las células se adhieran y se extiendan sobre el sustrato. La cantidad de células para crear una monocapa confluente depende de su tipo de célula y del tamaño de los platos. Debe ajustar las características en función de estos parámetros [por ejemplo, utilizando células M3, semilla 3 & # x000B710 4 células / pocillo cuando se utiliza el inserto de cultivo de silicona (área para cada pocillo = 0,22 cm 2) y semilla 4,5 & # x000B710 5 células / plato (área para plato = 3,5 cm 2)].

PASO CRITICO. Para asegurar la reproducibilidad de los resultados, es muy importante crear una monocapa de células confluentes (90 & # x0201395% de confluencia) y mantener un número de siembra constante específico para cada línea celular.

2.2) Seguir opción A para realizar el ensayo de cicatrización de heridas con inserto de cultivo y la opción B para realizar el ensayo de raspado con la punta de la pipeta (Figura 1A).

(A) In vitro ensayo de cicatrización de heridas (con inserto) y análisis de datos [TIEMPO & # x0007E 2 días]

(I) Compruebe las células bajo el microscopio para asegurarse de que se crea una monocapa de células confluentes (95 & # x02013100%).

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(ii) Retire el inserto de cultivo con unas pinzas estériles.

PASO CRITICO. Use unas pinzas estériles para agarrar el inserto lenta y suavemente del plato. Evite torcer el inserto.

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(iii) Retire los desechos y las células no adheridas lavando la capa celular dos veces con 1 ml de 1X PBS estéril y luego reemplácelo con 2 ml de medio apropiado para el ensayo, si es necesario agregue un tratamiento al medio (por ejemplo, inhibidor de metástasis Wang et al., 2015, antibióticos Zhu et al., 2016, según el objetivo del experimento).

PASO CRITICO. Precaliente el 1X PBS y el medio a 37 & # x000B0C. Evite desprender las células en el lavado.

(iv) Coloque el plato bajo un microscopio confocal de barrido de contraste de fase con un2 incubadora de jaula de microscopio, la adquisición de imágenes se realiza a 37 & # x000B0C y 5% de CO2. Defina posiciones exactas y planos focales, evitando campos superpuestos. Inicie la adquisición de imágenes tomando imágenes varias veces a lo largo de 20 & # x0201324 h (por ejemplo, se realizaron mediciones de lapso de tiempo para células de melanoma M3 cultivadas durante 20 h con un intervalo de tiempo de 1 hy objetivo de 10X). Seleccione 3 o 4 campos de cada herida y al menos tres heridas por muestra.

PASO CRITICO. Antes de la configuración de la microscopía de lapso de tiempo, encienda el CO2 y temperatura para equilibrar el sistema al menos 30 minutos antes de comenzar la adquisición. Asegúrese de que los parámetros estén configurados al 5% de CO2 y 37 & # x000B0C.

ESTRATEGIA OPCIONAL. En este ensayo se pueden utilizar células marcadas con fluorescencia, aunque deben modificarse los pasos de segmentación previos a la cuantificación del área de la herida, ya que ahora están optimizados para la transmisión de imágenes de luz. También debe tener cuidado con la intensidad de la luz durante la adquisición de lapso de tiempo, ya que puede causar fototoxicidad.

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(v) Después de adquirir las imágenes de lapso de tiempo, revise los fotogramas en un formato de secuencia (& # x0002A .tif, & # x0002A .oif, & # x0002A .zvi o equivalente).

PUNTO DE PAUSA. El procesamiento de datos se puede realizar según la conveniencia del usuario.

(vi) El análisis de datos cuantitativos se puede realizar con software de código abierto (ImageJ / Fiji). En ImageJ / Fiji, las secuencias de lapso de tiempo se pueden abrir haciendo clic en Expediente & # x02192 Abierto.

(vii) Calibre la secuencia de imágenes usando Analizar & # x02192 Establecer escala e introduzca la escala correcta (píxeles / & # x003BCm) según el objetivo y el microscopio utilizados (Figura complementaria 1A), si el software del microscopio & # x00027s no almacena automáticamente esta información en el archivo de datos.

PASO CRITICO. Es importante establecer la escala correcta para el análisis de migración celular.

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(viii) Seleccione los parámetros de medición Analizar & # x02192 Establecer medidas & # x02192 Zona (Figura complementaria 1A).

(ix) Haga clic en duplicar la secuencia de imágenes Imagen & # x02192 Duplicar.

(X) Detecta el cambio de intensidad en el borde de la secuencia duplicada Proceso & # x02192 Encontrar bordes (Figura complementaria 1B).

(xi) Aplicar un filtro de borde borroso Proceso & # x02192 Filtros & # x02192 Desenfoque gaussiano (por ejemplo, Sigma (Radio) = 5) (Figura complementaria 1C).

(xii) Ajuste el umbral de intensidad para detectar el área de la herida. Imagen & # x02192 Ajustar & # x02192 Umbral (Figura complementaria 1D).

PASO CRITICO. Defina correctamente el parámetro de umbral para determinar exactamente el área de la herida vacía. De forma predeterminada, la macro ejecuta un AutoThreshold utilizando el método Mínimo (Datos suplementarios 1), que opera aceptablemente en la mayoría de los datos de lapso de tiempo.

(xiii) Cree una selección alrededor del área del umbral Editar & # x02192 Selección & # x02192 Crear selección.

(xiv) La selección del área primero se reduce y luego se agranda (por ejemplo, 10 píxeles) para eliminar pequeñas áreas de umbral no relacionadas con la herida, y luego se devuelve al tamaño original en la herida. Editar & # x02192 Selección & # x02192 Ampliar (p.ej., primer enchufe & # x0221220, luego 20).

(xv) Agregue todos los puntos de tiempo en el administrador de ROI Analizar & # x02192 Herramienta & # x02192 Gerente de ROI.

Los pasos xiii y # x02013 xv deben repetirse para cada punto de tiempo si se hace manualmente (sin usar la macro).

(xvi) Obtenga el valor del área en los diferentes puntos de tiempo Analizar & # x02192 La medida (Figura complementaria 1E).

(xvii) Hemos escrito los pasos entre (ix) y (xvi) en una macro para ImageJ / Fiji para analizar automáticamente el área de cicatrización de la herida en cada secuencia de imágenes. El código & # x0201CWound_healing.ijm & # x0201D se proporciona en Datos suplementarios 1. Ejecute este código en ImageJ / Fiji y sus imágenes de lapso de tiempo se cuantificarán automáticamente.

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(xviii) Además, haga clic en & # x0201CDerecho& # x0201D (barra de herramientas) y mida la longitud (& # x003BCm) entre un lado del scratch y el otro en las imágenes adquiridas en el tiempo inicial (0 h) y final para determinar la velocidad frontal de la celda. La medición de la longitud del rayado debe realizarse en tres regiones de cada imagen entre los puntos más cercanos en ambos lados de la herida.

(xix) Importe los datos al software de hoja de cálculo y determine el cierre relativo del área de la herida, la velocidad y otros parámetros (consulte RESULTADOS ESPERADOS y Figura 2). La significación estadística de las diferencias entre las muestras se estimó mediante Student & # x00027s de dos colas no apareado t-prueba, que se puede realizar directamente en la hoja de cálculo. Si su configuración experimental incluye más de dos condiciones para comparar, puede usar un software más específico como SPSS, donde podría realizar análisis más complejos mediante ANOVA unidireccional seguido de Tukey-Kramer post-hoc prueba.

(B) In vitro ensayo de raspado (con punta de pipeta) y análisis de datos [TIEMPO & # x0007E 2 días]

(I) Continuando desde el paso 2.2 (opción B), haga una herida rascando la monocapa celular en línea recta con una punta de pipeta P-200 estéril.

PASO CRITICO. El rascado debe hacerse suavemente con una punta de pipeta P-200 en línea recta en el centro del plato para separar solo las células centrales. Intenta mover la punta de forma continua y siempre con un tamaño similar en cada pocillo para evitar variaciones entre condiciones.

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(ii) Lavar dos veces con 1 ml de 1X PBS estéril para eliminar las células flotantes y los residuos y agregar 2 ml de medio apropiado para el ensayo (si es necesario agregar un tratamiento en el medio).

PASO CRITICO. Precaliente el 1X PBS y el medio a 37 & # x000B0C. Evite desprender las células en el lavado.

(iii) Repita los pasos 2.2 (A) (iv-v) para la configuración de exploración de contraste de fase y los parámetros de adquisición.

(iv) Análisis de datos cuantitativos. Repita los pasos 2.2 (A) (vi) & # x02013 (xvii). En ImageJ / Fiji, abra las imágenes individuales y realice el mismo procedimiento.

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(v) Además, haga clic en & # x0201CDerecho& # x0201D (barra de herramientas) y mida la longitud (& # x003BCm) entre un lado del scratch y el otro en las imágenes adquiridas en el tiempo inicial (0 h) y final para determinar la velocidad frontal de la celda. La medición de la longitud del rayado debe realizarse en tres regiones de cada imagen entre los puntos más cercanos en ambos lados de la herida.

(vi) Importe datos al software de hoja de cálculo y proceda como se explica en el paso 2.2 (A) (xix).

3. Ensayo de seguimiento celular individual y análisis de datos [TIEMPO & # x0007E 2 días]

3.1) Continuando desde el paso 1.2 (u opcionalmente el paso 1.3), sembrar 1.2 & # x000B710 4 células en 500 & # x003BCl de medio completo adecuado en cada pocillo en placas de 24 pocillos y cultivarlas durante la noche (a 37 & # x000B0C y 5% de CO2) (por ejemplo, para células de melanoma M3, use DMEM con 10% (vol / vol) FBS (ver Configuración de reactivo) y realizar al menos tres réplicas biológicas para cada condición experimental diferente).

PASO CRITICO. Para analizar el seguimiento de células individuales, las células se siembran a baja densidad. El número de células sembradas depende de las características del tipo de célula y del tamaño de las placas.

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3.2) Retire con cuidado los residuos y las células muertas lavando los pocillos una vez con 500 & # x003BCl de 1X PBS estéril y luego reemplácelo con 500 & # x003BCl del medio adecuado para el ensayo. Agregue un tratamiento específico en el medio, si es necesario.

3.3) Coloque inmediatamente la placa de 24 pocillos bajo el microscopio de contraste de fase o de fluorescencia con un2 incubadora de jaula para microscopio (a 37 & # x000B0C y 5% CO2). Realice imágenes de lapso de tiempo (por ejemplo, tomar una imagen cada 20 minutos durante 20 h con un objetivo de 20X). Debe adquirir aproximadamente 10 & # x0201315 campos para cada una de las tres réplicas biológicas a fin de obtener datos de al menos 300 células.

PASO CRITICO. Defina la configuración de adquisición de imágenes en función del conocimiento previo sobre su línea celular (por ejemplo, una resolución temporal más alta si se sabe que su línea celular tiene alta motilidad). Evite la superposición de campos.

PASO CRITICO. Antes de configurar la microscopía de lapso de tiempo, encienda el CO2 y temperatura para equilibrar el sistema al menos 30 minutos antes de comenzar la adquisición. Asegúrese de que los parámetros estén configurados al 5% de CO2 y 37 & # x000B0C.

ESTRATEGIA OPCIONAL. En este ensayo se pueden utilizar células marcadas con fluorescencia. También debe tener cuidado con la intensidad de la luz durante la adquisición de lapso de tiempo, ya que puede causar fototoxicidad.

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3.4) Análisis de datos cuantitativos. Repita los pasos 2.2 (A) (v) - (vii).

3.5) Abierto Complementos & # x02192 Seguimiento & # x02192 Seguimiento manual.

3.6) Configure los parámetros & # x0201CIntervalo de tiempo, & # x0201D & # x0201Ccalibración x / y, & # x0201D y & # x0201Ccalibración z& # x0201D en el Seguimiento manual (Figura complementaria 2A).

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3.7) Inicie el análisis de seguimiento de celda individual, haga clic en & # x0201CAgregar pista& # x0201D y luego seleccione una celda en el primer punto de tiempo y sígala a través de todos los puntos de tiempo, finalmente haga clic en & # x0201CPista final. & # x0201D Repítalo para todas las celdas del marco a lo largo de todos los puntos de tiempo. Una nueva ventana con los resultados (pista, corte, distancia y velocidad) aparece (Figura complementaria 2B).

3.8) Guarde los valores en formato (.txt) y haga clic en & # x0201CSuperposición de puntos y líneas& # x0201D para guardar la secuencia con la pista.

3.9) Descargue el complemento Chemotaxis y ábralo en ImageJ / Fiji Complementos & # x02192 Herramienta de quimiotaxis. Alternativamente, el & # x0201CHerramienta de quimiotaxis y migraciónEl software & # x0201D se puede descargar y utilizar con la misma función (consulte EQUIPO).

3.10) Establecer parámetros. Haga clic en & # x0201CAjustes& # x0201D y aplique la configuración correcta para & # x0201CIntervalo de tiempo& # x0201D y & # x0201Ccalibración x / y& # x0201D (Figura complementaria 2C).

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3.11) Importar conjunto de datos. Haga clic en & # x0201CDatos de importacion& # x0201D y seleccione el archivo (.txt) con los valores obtenidos en el complemento Manual Tracking. Seleccione el archivo, establezca el número de cortes a analizar y haga clic en & # x0201CAgregar conjunto de datos. & # x0201D Seleccione hasta cuatro conjuntos de datos y trabaje simultáneamente en este complemento (Figura complementaria 2D). Opcionalmente, agregue algunas restricciones en los parámetros. Haga clic en & # x0201CRestricciones abiertas& # x0201D y & # x0201Cset conjunto de datos dividido, & # x0201D & # x0201Cdistancia umbral, & # x0201D y & # x0201Cvelocidad umbral. & # x0201D

3.12) Haga clic en & # x0201CAplicar configuraciones. & # x0201D

3.13) Haga clic en & # x0201CCaracterística de la trama& # x0201D no seleccione ninguna marca (o las marcas apropiadas), ajuste la escala del eje y haga clic en & # x0201CTrazar gráfico& # x0201D para obtener el gráfico de trayectoria. Opcionalmente, se puede obtener una trama de trayectoria animada.

3.14) (Paso opcional, según análisis). Haga clic en & # x0201CCaracterística de diagrama& # x0201D y seleccione & # x0201CTrazar histograma, & # x0201D & # x0201CDiagrama de la rosa del diagrama, & # x0201D o & # x0201CParcela circular& # x0201D para obtener varios gráficos que muestren una orientación / distribución de todas las direcciones de migración celular.

3.15) Haga clic en & # x0201CCaracterística de estadísticas& # x0201D y seleccione & # x0201Cvelocidad, & # x0201D & # x0201Cdistancia & # x0201D (euclidiana y acumulada), & # x0201CFMI & # x0201D (Índice de migración hacia adelante) y & # x0201Cdireccionalidad. & # x0201D Guarde o exporte estos datos a un software de hoja de cálculo.

3.16) En el software de hoja de cálculo, determine la desviación estándar y media (SD) de la velocidad (& # x003BCm / h), la distancia acumulada (& # x003BCm), la distancia euclidiana (& # x003BCm) y otros parámetros (consulte RESULTADOS ESPERADOS y Figura 3). La significación estadística de las diferencias entre las muestras se estimó mediante Student & # x00027s de dos colas no apareado t-prueba, que se puede realizar directamente en la hoja de cálculo. Si su configuración experimental incluye más de dos condiciones para comparar, puede usar un software más específico como SPSS, donde podría realizar análisis más complejos mediante ANOVA unidireccional seguido de Tukey-Kramer post-hoc prueba.

4. Ensayo de migración / invasión de células Transwell y análisis de datos [TIEMPO & # x0007E 2 días]

4.1) Este ensayo se puede utilizar para analizar la migración y / o invasión celular. Para analizar la invasión celular, la membrana del inserto transwell se recubre con Matrigel, mientras que en los ensayos de migración celular no lo está. Este procedimiento es idéntico para ambas posibilidades, la única diferencia es la presencia o no de Matrigel. (Si desea realizar un ensayo de migración, omita los pasos de Matrigel).

4.2) Paso de Matrigel: descongelar la solución de Matrigel a 4 & # x000B0C durante la noche. Recubra la superficie del lado inferior de la membrana transwell con 25 & # x003BCl de solución de Matrigel (consulte la preparación en Configuración de reactivo, Figura 4A).

PASO CRITICO. La solución de Matrigel es líquida a 4 ° C, pero gelifica muy rápidamente a TA. Recuerde trabajar en condiciones de frío y enfriar previamente a & # x0221220 & # x000B0C todo el material (pipetas, puntas y pinzas).

4.3) Incube el transwell con Matrigel a 37 & # x000B0C durante 30 min para gelificar.

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4.4) (Paso opcional) Lave el Matrigel del lado inferior de la membrana dos veces con medio de cultivo sin suero precalentado (por ejemplo, para el cultivo de células de melanoma M3, use medio DMEM sin FBS).

PASO CRITICO. Lavados suaves. Evite desprender Matrigel en los lavados.

4.5) Añadir 500 & # x003BCl de medio de cultivo (con o sin quimioatrayente) en cada pocillo en una placa de 24 pocillos (p. Ej., Para el ensayo de transpocillos de células de melanoma, se usó FBS al 10% como quimioatrayente. Véase el esquema de la Figura 4B).

4.6) (Paso opcional) Agregue un tratamiento en el medio de cultivo si es necesario.

4.7) Utilice unas pinzas estériles para transferir el inserto transpocillo a cada pocillo de la placa de 24 pocillos ya llena con medio de cultivo (con o sin quimioatrayente).

4.8) Continúe desde el paso 1.2, agregue 400 & # x003BCl de suspensión celular (en la confluencia final 50 & # x0201360%) en la cámara superior transwell (consulte el esquema de la Figura 4A).

PASO CRITICO. Dependiendo del tamaño de su tipo de célula, el tamaño de poro requerido del inserto de membrana transwell puede cambiar (por ejemplo, en este protocolo se utilizan membranas de diámetro de poro de 8 & # x003BCm).

4.9) Incubar a 37 & # x000B0C y 5% CO2 durante 20 & # x0201324 h.

4.10) Fijar las células mediante la adición de paraformaldehído (PFA) a una concentración final del 4% en medio de cultivo en ambos lados de cada inserto transwell durante 15 min a TA. PRECAUCIÓN. Realice la fijación de la celda en una campana extractora de productos químicos de seguridad y use el equipo de protección personal adecuado.

4.11) Retirar el medio de cultivo con PFA al 4% mediante aspiración suave.

4.12) Lave el inserto Transwell dos veces a ambos lados de la membrana con 1X PBS estéril para eliminar los residuos, las células no adheridas y el exceso de solución de fijación.

PASO CRITICO. Sea amable con todos los lavados para evitar que se desprendan las células.

PUNTO DE PAUSA. Las muestras se pueden almacenar en 1X PBS a 4 & # x000B0C hasta por 1 mes.

4.13) Teñir las células incubando el inserto transwell (con o sin Matrigel) con Hoechst (concentración final 10 & # x003BCg ml & # x022121 en 400 & # x003BCl de 1X PBS) durante 15 min a TA protegido de la luz. (También se pueden utilizar cristal violeta o hematoxilina).

PASO CRITICO. Desde este paso hasta el paso 4.18, trabaje en condiciones de oscuridad.

4.14) Lave el inserto Transwell dos veces con 1X PBS estéril para eliminar el exceso de solución Hoechst.

4.15) Mantenga los insertos en la placa de 24 pocillos con 1X PBS estéril para evitar que se seque la membrana.

4.16) Capture varias imágenes para cubrir toda la superficie de la membrana de inserción transwell, ya sea con revestimiento de Matrigel o no, utilizando objetivos de 10X o 4X en un microscopio de fluorescencia. Para evitar la superposición de campos, se puede utilizar una función de mosaico automático al adquirir imágenes (si está disponible en su equipo). El número de células contadas usando estas imágenes será el número total de células en el ensayo de invasión (si se usó Matrigel) o el número total de células en el ensayo de migración (si no se usó Matrigel).

4.17) Retire inmediatamente las células no invadidas / migradas de la superficie superior de la membrana transwell raspando suavemente con un hisopo de algodón. Si se usa cristal violeta o hematoxilina, la membrana se vuelve azul. Deseche la superficie de la membrana hasta que el último hisopo utilizado permanezca blanco (o limpio).

PASO CRITICO. Tenga cuidado con el desguace. El desguace debe ser suave con poca presión para eliminar todas las células de la superficie superior de la membrana, pero sin afectar las células migradas / invadidas de la parte inferior. Si es necesario, repita el desguace con un segundo hisopo de algodón.

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4.18) Repita el paso 4.16, pero en este caso las imágenes adquiridas representan las células invadidas o migradas (con o sin Matrigel, respectivamente).

4.19) El análisis de datos cuantitativos se puede realizar con software de código abierto (ImageJ / Fiji). En ImageJ / Fiji, las imágenes adquiridas se pueden abrir haciendo clic en Expediente & # x02192 Abierto.

4.20) Seleccione Proceso & # x02192 Encuentra Maxima para medir automáticamente el número total de celdas en cada imagen.

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4.21) Ajuste el parámetro & # x0201CTolerancia al ruido& # x0201D para evitar el ruido de fondo, detectar y contar todas las células (núcleos teñidos por Hoechst) (Figura complementaria 3A).

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4.22) (Alternativamente al paso 4.20 & # x020134.21), se puede obtener un conteo manual abriendo Complementos & # x02192 Analizar & # x02192 Contador de celdas.

4.23) Seleccione & # x0201CInicializar & # x0201D y & # x0201CTipo I & # x0201D y haga clic en las células (núcleos teñidos por Hoechst) manualmente para obtener el número total de células (Figura complementaria 3B).

4.24) Importe datos al software de hoja de cálculo y determine el porcentaje de células migradas y / o invadidas (consulte RESULTADOS ESPERADOS y Figura 4). La significación estadística de las diferencias entre las muestras se estimó mediante Student & # x00027s de dos colas no apareado t-prueba, que se puede realizar directamente en la hoja de cálculo. Si su configuración experimental incluye más de dos condiciones para comparar, puede usar un software más específico como SPSS, donde podría realizar análisis más complejos mediante ANOVA unidireccional seguido de Tukey-Kramer post-hoc prueba.

5. Ensayo de propagación y análisis de datos [TIEMPO & # x0007E 2 días]

5.1) Continuar desde el paso 1.2, sembrar 5 & # x000B710 4 células en 500 & # x003BCl de medio adecuado para la línea celular utilizada en cada pocillo en placas de 24 pocillos y cultivarlas durante la noche o al menos 6 h (a 37 & # x000B0C y 5% CO2), permitiendo que las células se adhieran (por ejemplo, para células M3, use DMEM con 10% (vol / vol) FBS (ver Configuración de reactivo). Realice al menos tres réplicas biológicas para cada condición experimental diferente).

PASO CRITICO. Las células se siembran al 60% de confluencia. El número de células sembradas depende del tipo de célula y del tamaño de los platos.

5.2) Retire el medio de cada pocillo mediante aspiración suave, lave las células una vez con 1X PBS estéril y agregue 500 & # x003BCl de medio (con o sin tratamiento).

5.3) Incubar a 37 & # x000B0C y 5% CO2 durante 24 h.

PASO CRITICO. El período de incubación depende del tratamiento y el experimento.

5.4) Recubra los pocillos de una placa nueva de 24 pocillos con 250 & # x003BCl de fibronectina (10 & # x003BCg ml & # x022121) e incube durante 1 ha 37 & # x000B0C o durante la noche a 4 & # x000B0C (consulte la preparación en Configuración de reactivo). Se pueden usar otros sustratos de matriz extracelular (ECM), por ejemplo, gelatina o colágeno, dependiendo de su línea celular.

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5.5) Eliminar la fibronectina no unida mediante aspiración suave y lavar dos veces con 1X PBS estéril.

5.6) (Paso opcional para bloquear las proteínas quimioatrayentes presentes en el recubrimiento de la matriz extracelular). Añadir 200 & # x003BCl de solución de BSA desnaturalizada por calor (10 mg ml & # x022121) en cada pocillo, incubar durante 30 min a TA o durante la noche a 4 & # x000B0C y lavar dos veces con 1X PBS estéril (ver la preparación en Configuración de reactivo).

5.7) Después del paso 5.3, retire el medio (con o sin tratamiento) de cada pocillo mediante aspiración suave, lave las células una vez con 1X PBS estéril y agregue tripsina-EDTA para cubrir completamente las células. Colóquelos a 37 & # x000B0C durante 2 min. Agregue un volumen igual de medio completo para detener la reacción de tripsina-EDTA. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 ga TA y luego retirar la tripsina-EDTA y la solución de medio completo por aspiración. Mezcle las células con 500 & # x003BCl de medio fresco que contenga suero.

5.8) Sembrar 2 & # x000B710 4 células en 500 & # x003BCl de medio adecuado (de acuerdo con la línea celular utilizada) en la placa de 24 pocillos recubierta con fibronectina (paso 5.5).

? Solución de problemas

5.9) Incubar a 37 & # x000B0C y 5% CO2 durante 1 h.

PASO CRITICO. El período de incubación depende del tipo de célula y del tratamiento utilizado. Este tiempo de unión específico del tipo de célula debe ser determinado previamente por los investigadores.

? Solución de problemas

5.10) Arreglar celdas. Agregue PFA en el medio (concentración final 2%) de cada pocillo durante 15 minutos a temperatura ambiente.

PRECAUCIÓN. Realice la fijación de la celda en una campana de extracción química de seguridad y use el equipo de protección personal adecuado.

5.11) Retirar el medio de cultivo que contiene PFA al 2% mediante aspiración suave.

5.12) Lave los pocillos dos veces con 1X PBS estéril para eliminar los residuos, las células no adheridas y el exceso de solución de fijación.

PASO CRITICO. Sea amable con todos los lavados para evitar que se desprendan las células.

PUNTO DE PAUSA. Las muestras se pueden almacenar en 1X PBS a 4 & # x000B0C hasta por 1 mes.

5.13) Adquirir varias imágenes de células fijas en un microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo de 10X y evitar campos superpuestos.

5.14) El análisis de datos cuantitativos se puede realizar con software de código abierto (ImageJ / Fiji). En ImageJ / Fiji, las imágenes adquiridas se pueden abrir haciendo clic en Expediente & # x02192 Abierto.

PASO CRITICO. Para ser analizadas, las imágenes deben ser de 8 bits. Si tienen una profundidad de bits diferente, modifíquelos haciendo clic en Imagen & # x02192 Escribe & # x02192 8 bits.

5.15) El fondo de la imagen se resta utilizando una bola rodante de 10 píxeles de radio haciendo clic en Proceso & # x02192 Restar fondo. Posteriormente, la imagen se duplicó haciendo clic en Imagen & # x02192 Duplicar. Una imagen se utilizará para cuantificar las células no esparcidas, mientras que en la otra cuantificaremos todas las células.

5.16) Para cuantificar las celdas no esparcidas (Figura complementaria 4A), la imagen se estableció como umbral mediante el método del Yen, dejando simplemente las secciones más brillantes de la imagen (correspondientes a las celdas no esparcidas) haciendo clic en Imagen & # x02192 Ajustar & # x02192 Umbral y seleccionando el método Yen. Esto crea una imagen binaria. Posteriormente, la imagen se invirtió haciendo clic en Editar & # x02192 Invertir.

5.17) Algunas operaciones binarias, como & # x0201CErode, & # x0201D & # x0201CDilate, & # x0201D y & # x0201CFill Holes & # x0201D, se realizaron para pulir los umbrales en los que se pueden encontrar Proceso & # x02192 Binario & # x02192 & # x02026 Más tarde, el algoritmo de cuenca se utilizó para segmentar las celdas que se tocaban entre sí, haciendo clic en Proceso & # x02192 Binario & # x02192 Cuenca.

5.18) El número de partículas se contó automáticamente haciendo clic en Analizar & # x02192 Analizar partículas, estableciendo un tamaño mínimo de 100px 2 (ya que las partículas más pequeñas eran solo pequeños restos de otras características provenientes del umbral, no celdas reales no esparcidas).

5.19) Para cuantificar todas las celdas (Figura complementaria 4B), se utilizó la imagen duplicada creada en el paso 5.15. Primero, para detectar mejor las celdas extendidas, resaltamos todos los bordes de las celdas haciendo clic en Proceso & # x02192 Encontrar bordes. Posteriormente, la imagen se invirtió haciendo clic en Editar & # x02192 Invertir.

5.20) La imagen se estableció como umbral utilizando el método Trinagle, menos restrictivo que el método Yen pero aún seleccionando dónde están las celdas, haciendo clic en Imagen & # x02192 Ajustar & # x02192 Umbral y seleccionando el método Triangle, creando una imagen binaria.

5.21) Algunas operaciones binarias, como & # x0201CErode, & # x0201D & # x0201CDilate, & # x0201D y & # x0201CFill Holes & # x0201D, se realizaron para pulir el umbral, puede encontrarlas en Proceso & # x02192 Binario & # x02192 & # x02026 Más tarde, el algoritmo de cuenca se utilizó para segmentar las celdas que se tocaban entre sí, haciendo clic en Proceso & # x02192 Binario & # x02192 Cuenca.

5.22) El número de partículas se contó automáticamente haciendo clic en Analizar & # x02192 Analizar partículas, estableciendo un tamaño mínimo de 100px 2 (ya que las partículas más pequeñas eran solo pequeños restos de otras características provenientes del umbral, no celdas reales).

5.23) Hemos escrito los pasos entre 5.15 y 5.22 en una macro para que ImageJ / Fiji analice y determine automáticamente el número de celdas totales y no extendidas en la imagen. El código & # x0201CUnspread & # x00026All_.ijm & # x0201D se proporciona en Datos suplementarios 3. Ejecute este código en ImageJ / Fiji y sus imágenes se cuantificarán automáticamente.

PASO CRITICO. La macro puede tener problemas para identificar el número total de células si las células se siembran demasiado confluentes, es mejor sembrar a una densidad más baja y tomar imágenes de algunos campos más para asegurar una cuantificación confiable. De lo contrario, el análisis puede realizarse manualmente (Complementos & # x02192 Analizar & # x02192 Contador de celdas), pero esto ralentizará mucho la cuantificación y aún es difícil identificar el límite entre las células si el cultivo es demasiado confluente.

PASO CRITICO. Las células redondas y refringentes se consideraron no diseminadas, mientras que las células oscuras con citoplasma que rodeaba toda la circunferencia del núcleo se consideraron células diseminadas. La suma de las células diseminadas y no diseminadas es el número total de células. Podemos inferir el número de células diseminadas a partir de la diferencia entre el número total de células y las células no diseminadas.

5.24) Importe datos al software de hoja de cálculo y determine el porcentaje de celdas dispersas respecto al total de celdas (consulte RESULTADOS ESPERADOS y Figura 5). La significación estadística de las diferencias entre las muestras se estimó mediante Student & # x00027s de dos colas no apareado t-prueba, que se puede realizar directamente en la hoja de cálculo. Si su configuración experimental incluye más de dos condiciones para comparar, puede usar un software más específico como SPSS, donde podría realizar análisis más complejos mediante ANOVA unidireccional seguido de Tukey-Kramer post-hoc prueba.

Figura 1. Descripción general de los protocolos de preparación del ensayo de cicatrización de heridas. (A) Esquema paso a paso que muestra las diferencias entre el protocolo de cicatrización de heridas utilizando un inserto de cultivo (opción A) y usando punta de pipeta (opción B). La microscopía de contraste de fase muestra la apariencia de la brecha y ambos frentes de células justo antes de comenzar el experimento de lapso de tiempo. (B) Medidas del ancho de la herida (& # x003BCm) en el inserto de cultivo (norte = 50) o punta de pipeta (norte = 50). Se muestran los valores medios (líneas horizontales gruesas), límites de confianza (& # x003B1 = 0.05, líneas horizontales finas) y coeficientes de variación (etiqueta).

Figura 2. Análisis de la migración de células de melanoma M3 por in vitro ensayo de cicatrización de heridas. (A) Imágenes de microscopía de lapso de tiempo del cierre de la herida de células de melanoma sin tratar (paneles izquierdos) y tratadas con cloroquina (CQ 25 & # x003BCM, paneles derechos) a las 0, 10 y 20 h después de la extracción del inserto de cultivo. Las líneas punteadas definen el área que carece de celdas. Barras de escala, 100 & # x003BCm. (B) Cuantificación del área herida invadida durante 20 h por células de melanoma sin tratar (verde) y tratadas con CQ 25 & # x003BCM (rojo) presentadas en unidades relativas (r.u.). Los resultados representan la media de cuatro mediciones de cada área herida, obtenidas en 3 experimentos independientes (norte = 12). Se representan los valores medios del cierre relativo de la herida y los límites de confianza correspondientes (& # x003B1 = 0,05, líneas sombreadas). La línea de puntos marca el momento en el que comienzan las diferencias significativas. (C) Análisis de la velocidad del frente celular en células de melanoma no tratadas y tratadas con CQ 25 & # x003BCM. Media & # x000B1 SD de 3 experimentos independientes (norte = 12). (D) Cuantificación del área de velocidad de curación (& # x003BCm 2 / h) durante 20 h en células tratadas y no tratadas (norte = 12). Las líneas de puntos marcan el promedio del área de velocidad de curación en cada tratamiento. (MI) Gráfico que muestra el área de velocidad de curación promedio (& # x003BCm 2 / h) análisis cuantitativo de células de melanoma no tratadas y tratadas (CQ 25 & # x003BCM) media & # x000B1 SD, (norte = 12), de 3 experimentos independientes. El correspondiente pag-valores obtenidos por Student de dos colas no apareado & # x00027s t-prueba se muestran en (C, E) parcelas.

figura 3. Análisis de la migración de células de melanoma individuales. (A) Imágenes representativas de contraste de fase de células de melanoma sin tratar y tratadas con Mibefradil (5 & # x003BCM) (capturadas por microscopía de lapso de tiempo a intervalos de 20 minutos) en el tiempo inicial (0 h) y final (20 h). El complemento de seguimiento manual de ImageJ / Fiji se utilizó para rastrear manualmente 14 pistas de trayectoria celular representativas, marcadas en colores. Barras de escala, 100 & # x003BCm. (B) Gráficos de trayectoria que muestran la trayectoria de las células del melanoma durante 20 h en células no tratadas (verde) y tratadas (rojas). Todas las pistas se establecieron en un origen común (intersección de X y y ejes) utilizando el complemento Chemotaxis de ImageJ / Fiji. (C) Análisis cuantitativo de la distancia media acumulada (& # x003BCm) y (D) velocidad (& # x003BCm / h) de células de melanoma sin tratar y tratadas con Mibefradil (5 & # x003BCM). Los valores son medias & # x000B1 SD (norte = 5 experimentos independientes Se analizaron 300 células para cada grupo). El correspondiente valores p obtenido por estudiante de dos colas no emparejado & # x00027s t-prueba se muestran en (CD) parcelas.

Figura 4. Análisis cuantitativo y cualitativo de la migración de células de melanoma evaluado por in vitro ensayo transwell. (A) Ilustración esquemática de las diferentes partes del sistema Transwell. (B) Esquema de diseño experimental del ensayo de migración transwell. Las células se sembraron en la parte superior de la membrana transwell. En el compartimento superior y / o inferior, se añadió FBS al 10% como quimioatrayente (color rojo). Cuando se indica, se añadió mibefradil (5 & # x003BCM) en el compartimento inferior. (C) Se capturaron imágenes fluorescentes representativas de tinción de Hoechst nuclear (10 & # x003BCg ml & # x022121) a las 20 h después de que el tratamiento indicó células totales (panel izquierdo) y células migradas (panel derecho). Barras de escala, 100 & # x003BCm. (D) Porcentaje de células migradas después de 20 h, con o sin tratamiento y (& # x02013) o (& # x0002B) quimioatrayente (10% FBS). Las células se contaron a partir de 10 campos microscópicos aleatorios para cada muestra en 3 experimentos independientes. Los valores son medias & # x000B1 SD. El correspondiente valores p (& # x0002A & # x0002A & # x0002A = pag & # x0003C 0,0001) se obtuvieron mediante ANOVA unidireccional seguido de Tukey-Kramer post-hoc prueba.

Figura 5. Ensayo de propagación celular en células de melanoma M3. (A) Esquema de diseño experimental de ensayo de difusión. Las células se trataron durante 24 h, se tripsinizaron y se sembraron en una placa revestida con fibronectina (10 & # x003BCg ml & # x022121). Después de 1 h, las células se fijaron con PFA al 2% y (B) Se capturaron imágenes de contraste de fase. Barras de escala, 50 & # x003BCm. (C) Gráfico que muestra el porcentaje de células en expansión. Las células redondas brillantes se consideraron no esparcidas. Los valores son porcentaje de células de propagación & # x000B1 SD (norte = 3 experimentos independientes se contaron al menos 600 células para cada experimento). El correspondiente pag-valor obtenido por Student de dos colas no apareado & # x00027s t-se muestra la prueba.


Referencias

  1. Drury RAB, Wallington EA. Técnica histológica de Carleton. 5ª ed. Nueva York: Churchill Livingstone, 1980.
  2. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introducción a la teoría y práctica de la fijación de tejidos. J Histotechnol 200124173 -190.
  3. Procesamiento de tejidos Winsor L. En Woods A y Ellis R eds. Histopatología de laboratorio. Nueva York: Churchill Livingstone, 19944.2-1 - 4.2-39.
  4. Williams JH, Mepham BL, Wright DH. Preparación de tejidos para inmunocitoquímica. J Clin Pathol 199750422-428.
  5. Leong AS-Y. Fijación y fijadores. En Woods AE y Ellis RC eds. Histopatología de laboratorio. Nueva York: Churchill Livingstone, 19944.1-1 - 4.1-26.
  6. Hopwood D. Fijación y fijadores. En Bancroft J y Stevens A eds. Teoría y práctica de técnicas histológicas. Nueva York: Churchill Livingstone, 1996.
  7. Carson FL. Histotecnología. 2ª ed. Chicago: Prensa de ASCP, 1997.
  8. Pearse EDAD. Histoquímica, teórica y aplicada. Londres: Churchill Livingstone, 1980

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2. Colorantes de amina.

Los tintes de amina son uno de los mayores inventos de la citometría de flujo desde la compensación automática. En primer lugar, son reparables, por lo que tanto si tradicionalmente se tiñen las células como si las fija y permeabiliza, la fluorescencia se mantiene. Como resultado, puede realizar lotes de una gran cantidad de muestras mientras mantiene intactas las mejores prácticas de citometría de flujo.

En segundo lugar, los tintes de amina están disponibles en una amplia gama de perfiles de excitación y emisión, lo que los hace extremadamente fáciles de trabajar en los ensayos cada vez más multiparamétricos y multicolores de la actualidad. Los tintes de amina también son impermeables a la membrana, pero en lugar de unirse al ADN, actúan uniendo los grupos amina de las proteínas celulares. Las células vivas con membranas intactas permitirán que el tinte acceda solo a las pocas aminas en la superficie celular, mientras que las células muertas permitirán que el tinte acceda a muchas más aminas en las proteínas dentro de la célula, lo que dará como resultado una mayor fluorescencia.

Pros: Existe una amplia selección de tintes de amina de varios fabricantes para que pueda colocarlos en cualquier panel de anticuerpos por citometría de flujo con facilidad. Los tintes de amina también se pueden fijar, por lo que se pueden integrar fácilmente en los protocolos de procesamiento por lotes. Finalmente, las perlas reactivas con amina ahora están disponibles para su uso como control de compensación del marcador de células muertas.

Contras: Si bien los tintes de amina son ideales para sus experimentos de fijación y permeabilización, su uso agregará tiempo a su protocolo de fijación. Además, los tintes de amina son más caros que los otros reactivos enumerados aquí. La titulación de sus tintes de amina puede reducir los costos, pero la titulación debe realizarse con cuidado para minimizar el número de ciclos de congelación-descongelación a los que somete los reactivos. Lo más importante es que recuerde etiquetar sus células con tintes reactivos con amina. solamente en ausencia de proteína libre, de lo contrario, manchará la proteína en su solución, no las células de interés.


2 Colágeno tipo I

2.1 Introducción general sobre el colágeno

El colágeno es una proteína ubicua en los animales. Solo entre los vertebrados, ya se pueden encontrar 28 tipos diferentes de colágeno. [7] Todas las estructuras supramoleculares que contienen colágeno en un organismo están formadas por diferentes tipos de colágeno y también por componentes no colágenos. La combinación de tipos de colágeno, [8] modificaciones post-síntesis, [9] y la interacción con componentes no colágenos es específica para cada tejido y su función. [10]

El colágeno tipo I es la proteína fibrilar más abundante de la matriz extracelular (MEC), estando presente en hueso, piel, tendones y ligamentos. [11] Es una molécula heterotrimérica compuesta por dos cadenas α1 y uno cadena α2. Estas cadenas para zurdos adoptan una triple hélice para diestros como estructura terciaria. Cada cadena α tiene una unidad de repetición característica [Gly-Xaa-Yaa], siendo Xaa y Yaa principalmente prolina (Pro) y 4-hidroxiprolina (4-Hyp), respectivamente. La secuencia Gly-Pro-Hyp representa el 12% de los aminoácidos. [12] Los residuos de glicina demostraron ser esenciales para la formación de la triple hélice y las mutaciones en su posición están relacionadas con enfermedades, como la osteogénesis imperfecta (también conocida como enfermedad de los huesos frágiles). [13]

2.2 Estructura de las microfibrillas y fibrillas de colágeno

Las moléculas de colágeno (Figura 1a) tienen una longitud de ~ 300 nm y una anchura de ~ 1,5 nm. Se ensamblan espontáneamente en fibrillas y fibras que pueden tener hasta 1 cm de longitud y 1 µm de diámetro, dependiendo del tejido.

Las fibrillas se componen de bloques de construcción más pequeños en forma de cuerda llamados microfibrillas. Estos están formados por cinco moléculas de tropocolágeno dispuestas con un desplazamiento de 67 nm entre moléculas vecinas (Figura 1b). Su organización en una celda unitaria cuasihexagonal con una longitud axial de 67 nm [14] fue confirmada por mapeo de alta resolución combinado con información cristalográfica y modelado. [15] Orgel y col. fueron capaces de ajustar la secuencia de aminoácidos del colágeno al mapa de densidad electrónica experimental de moléculas de colágeno obtenido in situ. [15] La estructura cuasihexagonal se mantiene en toda la microfibrilla y cada celda unitaria contiene los segmentos moleculares de cuatro moléculas de tropocolágeno y una región gap. Poder visualizar el camino completo que recorre una sola molécula a través de sucesivas celdas unitarias permitió determinar que las microfibras vecinas están interdigitadas por reticulaciones, lo que explica por qué no es posible aislar microfibrillas. [7] La ​​interpretación del mapa de densidad electrónica también proporciona información sobre las regiones de colágeno que interactúan con otras biomoléculas. [16] Además, las fibrillas de colágeno pueden agruparse en fibras. La orientación en la que se alinean las fibrillas dentro de las fibras contribuye en gran medida a las propiedades mecánicas de diferentes tejidos.

La disposición escalonada de las moléculas de colágeno dentro de las microfibrillas en regiones de separación y superposición conduce a un patrón de bandas característico que se puede observar fácilmente mediante microscopía electrónica como zonas de bajo y alto contraste, como se muestra en la Figura 1d. Este patrón de bandas se denomina D-periodicidad, D-espaciado, o D-patrón de banda, con D-periodicidad el término más utilizado.

Con la tinción química, se pueden identificar varias subbandas. La tinción positiva con fosfotungstato (PTA) revela la posición de los residuos de aminoácidos cargados positivamente en la secuencia de colágeno. [17] Los PTA son aniones grandes que reaccionan con las cadenas laterales cargadas positivamente de Lys, Hyl y Arg. Estos aminoácidos no se distribuyen uniformemente en grupos a lo largo de la dirección axial de la microfibrilla. Cuando las fibrillas de colágeno se tiñen positivamente con PTA y se obtienen imágenes con microscopía electrónica de transmisión (TEM), se observan hasta 12 picos de diferentes intensidades. Estos picos, que se muestran esquemáticamente en la Figura 1c, se pueden asignar a los grupos cargados positivamente en el espacio (a3, a2, a1, e2, e1, d, c3), superposición (c2, c1, b2, b1) y ambas regiones (a4 ). [17]

La ubicación y orientación precisas de los aminoácidos cargados a lo largo de la molécula de colágeno puede dar una idea de los sitios potenciales para la infiltración intrafibrilar de minerales, así como los sitios de interacción para las proteínas no colágenas (NCP). [18] Recientemente, Xu et al. [18, 19] realizaron simulaciones de dinámica molecular en una microfibrilla de colágeno para comprender cómo cambia la posición relativa de las moléculas de colágeno a lo largo del C-eje que conduce a la formación de posibles vías de infiltración dentro de las fibrillas (Figura 1e). Se las arreglaron para describir con detalle a nivel atómico la forma y tamaño del espacio vacío entre moléculas en una microfibrilla y confirmar la presencia de canales a través de microfibrillas adyacentes. Sus hallazgos indican que la mineralización temprana se vería favorecida en los canales formados en las bandas a y e, lo que concuerda con los resultados experimentales. [20] Las dimensiones calculadas para la banda a son de 1,5 nm de altura (a-eje) × 5,8 nm de ancho (C-eje) y para la banda "e" son 1,5 × 5,6 nm 2. [19] La longitud de los canales (B-eje) correspondería al diámetro de una fibrilla, es decir, entre 100 y 200 nm 2. Si bien también se forman huecos en la banda d, estos canales parecen tortuosos para la infiltración. Además, Xu et al. mostró que la densidad del agua dentro de la región de la brecha es de 0,7 g cm −3, menos que a granel (1 g cm −3). Esta reducción en la densidad del agua promueve la mineralización al reducir la penalización entálpica por desolvatación de los precursores de la mineralización.

2.3 Fuentes, métodos de extracción y formulaciones

El colágeno tipo I utilizado para aplicaciones biomédicas, comerciales y de investigación básica se extrae principalmente de tejidos animales, principalmente de piel y tendones de origen porcino, bovino y ovino. [21] Menos comunes son los colágenos de pescado [22] y esponjas. [23] Debido al método de extracción relativamente fácil y suave, también es común utilizar colágeno extraído del tendón de la cola de rata con fines de investigación.

Los métodos utilizados para extraer colágeno de diferentes fuentes dependen de la fuente (animal y tejido) del colágeno. Los tejidos donde las fibrillas de colágeno presentan un bajo grado de reticulación, como los tendones, requieren métodos suaves como soluciones ácidas, mientras que los tejidos con un alto grado de reticulación requieren métodos más duros, que generalmente incluyen la digestión proteolítica. La fuente y el método de extracción afectarán la pureza e integridad del colágeno: las regiones de enlaces cruzados y telopéptidos podrían perderse durante el proceso. [24] Esto puede afectar la cinética de polimerización y las propiedades finales del material de colágeno. Además, es importante señalar que la falta de estandarización entre las fuentes de colágeno dificulta la comparación entre los estudios (ver también la Sección 5).

El uso de colágeno de origen animal para aplicaciones biomédicas tiene la desventaja de ser potencialmente inmunogénico (es decir, provocar una respuesta inmune en el huésped) y de ser susceptible a variabilidades de lote a lote. El uso de colágeno recombinante, producido por organismos genéticamente modificados, podría superar ambos problemas, pero tiene bajos rendimientos y el colágeno resultante carece de algunas modificaciones postraduccionales. [25] Se han utilizado pequeños péptidos sintéticos con secuencias similares al colágeno para comprender mejor la estructura molecular, la bioquímica, la estabilidad y el autoensamblaje del colágeno. [26] Si bien su uso para aplicaciones biomédicas es todavía muy limitado, se han utilizado para estudios de mineralización. [27]

La investigación sobre la mineralización del colágeno, que se discutirá en la Sección 4, se ha realizado en colágeno reconstituido en diferentes formulaciones, como hidrogeles blandos, fibrillas ensambladas, esponjas liofilizadas y tejidos desmineralizados. La elección de la formulación de colágeno depende del objetivo de la investigación y la aplicación deseada.

2.3.1 Hidrogeles de colágeno

Los hidrogeles de colágeno son redes de colágeno hinchadas por el agua que se forman típicamente por neutralización de una solución de colágeno ácida e incubación a 37 ° C. La cinética del autoensamblaje, las características morfológicas y estructurales dependen de varios parámetros, como la fuente y el método de extracción del colágeno, la concentración de colágeno, el pH, la fuerza iónica y la temperatura. [28] Para una aplicación dada, puede ser necesario inducir reticulaciones químicas, físicas o biológicas [12] para fortalecer los hidrogeles reconstituidos y evitar su desintegración durante su manipulación y uso.

2.3.2 Fibrillas ensambladas

Las fibrillas de colágeno se pueden ensamblar en sustratos 2D, como portaobjetos de vidrio [29] o rejillas TEM, [30] siguiendo métodos de neutralización similares a la preparación de hidrogeles de colágeno 3D. Esto facilita el uso de técnicas de caracterización que requieren muestras delgadas. La mineralización de colágeno se ha estudiado en rejillas autoensambladas en rejillas TEM, [20] permitiendo la obtención de imágenes TEM y mediciones de tomografía electrónica sin tratamientos adicionales para la muestra.

2.3.3 Esponjas liofilizadas

Normalmente, las suspensiones de colágeno se sumergen y se congelan en un baño criogénico a temperaturas entre -20 y -45 ° C. La composición de la suspensión y los parámetros de congelación se pueden ajustar para regular el tamaño de los poros de la esponja. [31]

2.3.4 Tejidos desmineralizados

Los minerales presentes en los tejidos mineralizados, como los huesos de bovinos o las escamas de pescado, pueden eliminarse mediante tratamientos químicos que conducen a una estructura de colágeno. [32] Después de este proceso, los niveles jerárquicos de los tejidos se conservan y, por lo tanto, las plantillas pueden ser más resistentes y resistentes que otras formas de colágeno reconstituido.


Enfoques óseos humanizados para el modelado de enfermedades

Si bien las técnicas de TE se pueden aplicar in vitro para estudiar la interacción entre las células óseas y las células cancerosas, solo en vivo Los modelos son capaces de recapitular la diseminación metastásica a través de la vasculatura del huésped y su posterior regreso al hueso (Dadwal et al., 2016 Hutmacher et al., 2010 Sitarski et al., 2018). Por lo tanto, para comprender la importancia de la interacción entre el hueso humano y las células cancerosas humanas en el modelado de la patofisiología de la enfermedad, varios grupos establecieron métodos rudimentarios. en vivo modelos de un entorno óseo humanizado. En estos en vivo sistemas murinos, ex vivo Se implantaron ectópicamente fragmentos de hueso humano en ratones inmunodeprimidos para estudiar la fisiología ósea humana en estados normales y patológicos. El hueso fetal injertado por vía subcutánea en ratones SCID mantuvo la hematopoyesis humana durante hasta 20 semanas después de la implantación (Kyoizumi et al., 1992), retuvo la médula ósea y las células estromales residentes y se sometió a procesos de remodelación ósea (Nemeth et al., 1999). Por el contrario, Wagner et al. informaron que el mantenimiento del compartimento medular en el hueso esponjoso adulto implantado subcutáneamente dependía de la suplementación con rhBMP-7 en el momento de la implantación, ya que el compartimento medular se reemplazó con tejido fibroso sin rhBMP-7 (Wagner et al., 2016). Quizás esto indique que el hueso fetal se injerta en modelos murinos y mantiene el compartimento medular y la hematopoyesis mejor que el hueso adulto, pero la disponibilidad de hueso fetal para la investigación es limitada y tiene importantes consideraciones éticas. Los ratones portadores de injerto óseo humano también se han utilizado para estudiar neoplasias óseas primarias, como el osteosarcoma, y ​​las lesiones metastásicas del cáncer de próstata y mama, que discutimos en detalle a continuación.

La implantación subcutánea de fragmentos de hueso humano para estudiar la fisiología ósea humana normal y el papel del hueso humano en los procesos patológicos tiene ventajas e inconvenientes. Estos fragmentos óseos están sujetos a una mayor variabilidad de paciente a paciente, causada por idiosincrasias intrínsecas a pacientes individuales, y porque el procedimiento en sí emplea pasos mínimos de preprocesamiento del ex vivo tejido humano.Sin embargo, esto también puede ser ventajoso, ya que el tejido se manipula mínimamente y, por lo tanto, es representativo del órgano óseo nativo del paciente. Esto es importante, ya que el nicho del estroma óseo y la médula es crucial para la hematopoyesis humana normal y juega un papel central en las enfermedades hematopoyéticas (Kaplan et al., 2005). También existen implicaciones logísticas en el uso de fragmentos óseos de desechos quirúrgicos, ya que la cantidad de material óseo disponible para la implantación a menudo no se conoce hasta después de que se realiza la cirugía y se recolecta el tejido. Además, la implantación exitosa en el ratón se limita a una breve ventana de tiempo después de la recolección de tejido óseo. Por lo tanto, el uso de fragmentos de huesos humanos de desechos quirúrgicos no permite una planificación previa experimental exhaustiva. Además, los investigadores han informado de inconsistencias con respecto al mantenimiento de la médula ósea endógena y hematopoyesis, necrosis e infiltración de tejido fibroso murino en el fragmento de hueso humano injertado (Holzapfel et al., 2013).

Técnicas de ingeniería de tejidos para generar el hueso del órgano.

Con el fin de superar las limitaciones de los fragmentos de hueso humano nativo para estudiar el hueso humano en procesos fisiológicos y patológicos normales, se han empleado técnicas de TE para formar de novo hueso en en vivo modelos (Fig. 3, Tabla 5). La principal ventaja del hueso TE es la capacidad de personalizar completamente las propiedades físicas del andamio osteoconductor y la inclusión de factores de crecimiento osteoinductores y fuentes celulares. Los modelos de hueso TE también se pueden utilizar para obtener conocimientos mecánicos sobre la formación de hueso. Por ejemplo, Eyckmans et al. utilizó un modelo de hueso TE ectópico para estudiar la formación de hueso. Delinearon las funciones de la señalización de las proteínas BMP y WNT (Cuadro 1) durante la osteoinducción al derribar o sobreexpresar los reguladores de estas vías de señalización en las células periósticas humanas y analizar los efectos sobre la formación ósea (Eyckmans et al., 2010).


Ver el vídeo: De qué depende que falle un tratamiento (Agosto 2022).