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¿Es necesario calcular el factor de normalización de carriles al realizar un análisis de datos de Western Blot?

¿Es necesario calcular el factor de normalización de carriles al realizar un análisis de datos de Western Blot?


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Recientemente hice mi primera transferencia Western y estoy haciendo análisis de datos para cuantificar mi transferencia. He etiquetado mi membrana contra GSK3 inactivo y GSK3 activo, que son fosfoproteínas, por lo que estoy usando GSK3 total como control de carga interno. He leído algunas guías y manuales sobre análisis de datos de Western Blot y he visto que algunos de ellos calculan un factor de normalización de carril para tener en cuenta las variaciones en la intensidad de la señal del control de carga. Para todas las bandas de control de carga en cada carril, se dividen por la banda de control de carga con mayor intensidad para obtener el factor de normalización del carril. Luego, para cada banda de la proteína objetivo de interés, se dividen por el factor de normalización del carril para obtener la intensidad normalizada.

Me preguntaba, en general, con las transferencias Western, ¿es una buena práctica calcular el factor de normalización de carriles al realizar el análisis de datos? Se agradece cualquier información.


En términos generales, la forma correcta de cuantificar una transferencia de Western es normalizar a un control de carga como Actin o GAPDH. En este caso sería (pGSK3 / Actin) / (GSK3 / Actin) ya que el total de GSK3 no es un control de carga. Un control de carga es para la proteína que se acepta como invariable en concentración en múltiples muestras si se usa la misma cantidad de proteína, y que yo sepa, GSK3 mostraría más variabilidad biológica que los controles de carga aceptados. Esta se consideraría la mejor práctica para comparar concentraciones de proteínas entre muestras.

Dicho esto, si todo lo que le importa es la proporción de activo a total, pGSK3 / Total GSK3 probablemente sea suficiente para evaluar si su manipulación cambió las proporciones de activo / inactivo: total. Por ejemplo, en los ensayos de autofagia, puede medir el flujo autofágico midiendo LC3-I a LC3-II, y nunca los he visto normalizados a un control de carga, ya que es una lectura radiométrica contenida en una sola muestra.


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Abstracto

La inmunotransferencia es una técnica de uso común en la investigación biológica. Un problema importante con la transferencia Western no es el método en sí, sino el uso de anticuerpos de mala calidad, así como el uso de diferentes condiciones experimentales que afectan la linealidad y sensibilidad de la transferencia Western. La investigación de algunas afecciones que se usan comúnmente y que a menudo se modifican en la transferencia Western, así como algunos anticuerpos comerciales, mostró que los artículos publicados a menudo no informan los parámetros críticos necesarios para reproducir los resultados. Estos parámetros incluyen la cantidad de proteína cargada, la solución de bloqueo y las condiciones utilizadas, la cantidad de anticuerpos primarios y secundarios utilizados, las soluciones de incubación de anticuerpos, el método de detección y el método de cuantificación utilizado. En el presente estudio, la comparación de proteínas ubiquitinadas en muestras de corazón e hígado de rata mostró resultados diferentes dependiendo del anticuerpo utilizado. La validación de cinco anticuerpos de ubiquitina comerciales utilizando proteínas ubiquitinadas purificadas, cadenas de ubiquitina y ubiquitina libre mostró que estos anticuerpos difieren en su capacidad para detectar ubiquitina libre o proteínas ubiquitinadas. La investigación de proteínas modificadas con el gen 15 estimulado con interferón (ISG15) en corazones de ratas jóvenes y viejas utilizando seis anticuerpos disponibles comercialmente mostró que la mayoría de los anticuerpos dieron resultados semicuantitativos diferentes, lo que sugiere una gran variabilidad entre los anticuerpos. Se presentan pruebas que muestran la importancia del tampón de transferencia Western y la concentración de anticuerpo utilizado. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de informes completos de las condiciones experimentales para mejorar la precisión y reproducibilidad del análisis de transferencia Western. Se sugiere un estándar mínimo de notificación de Western blot (WBMRS) para mejorar la reproducibilidad del análisis de Western blot.

Citación: Gilda JE, Ghosh R, Cheah JX, West TM, Bodine SC, Gomes AV (2015) Inexactitudes de transferencia occidental con anticuerpos no verificados: necesidad de un estándar de informe mínimo de transferencia occidental (WBMRS). PLoS ONE 10 (8): e0135392. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135392

Editor: Fenfei Leng, Instituto de Ciencias Bimoleculares de la Universidad Internacional de Florida, ESTADOS UNIDOS

Recibió: 7 de mayo de 2015 Aceptado: 21 de julio de 2015 Publicado: 19 de agosto de 2015

Derechos de autor: © 2015 Gilda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del documento.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL080101 y HL096819 (AVG), fondos de UC Davis (AVG) y un VA RR & ampD Merit 1I01RX000673 (SCB). Los patrocinadores no desempeñaron un papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


En estadística, existen muchas herramientas para analizar los datos en detalle y una de las fórmulas o métodos más utilizados es el método de Normalización. La normalización y la estandarización se han utilizado indistintamente, pero por lo general tienen diferentes interpretaciones y diferentes significados en conjunto. La normalización en términos simples significa normalizar los datos. La normalización se refiere a una escala de los datos en variables numéricas en el rango de 0 a 1.

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La fórmula para la normalización es

  • X: Es un conjunto de valores observados presentes en X.
  • Xmin: Son los valores mínimos en X
  • X max: Son los valores máximos en X

Ejemplos de fórmula de normalización (con plantilla de Excel)

Tomemos un ejemplo para comprender mejor el cálculo de la normalización.

Fórmula de normalización & # 8211 Ejemplo # 1

Calcule la normalización para el siguiente conjunto de datos.

El valor máximo en el conjunto de datos se calcula como

Entonces 75 es el valor máximo en el conjunto de datos dado.

El valor mínimo en el conjunto de datos se calcula como

20 es el valor mínimo en el conjunto de datos dado.

La normalización se calcula utilizando la fórmula que se proporciona a continuación.

De manera similar, calculamos la normalización para todos los valores de los datos.

Fórmula de normalización & # 8211 Ejemplo # 2

Calcule la normalización para el siguiente conjunto de datos.

El valor máximo en el conjunto de datos se calcula como

Entonces 164 es el valor máximo en el conjunto de datos dado.

El valor mínimo en el conjunto de datos se calcula como

101 es el valor mínimo en el conjunto de datos dado.

La normalización se calcula utilizando la fórmula que se proporciona a continuación.

De manera similar, calculamos la normalización para todos los valores de los datos.

Fórmula de normalización & # 8211 Ejemplo # 3

Calcule la normalización para el siguiente conjunto de datos.

El valor máximo en el conjunto de datos se calcula como

Entonces 197 es el valor máximo en el conjunto de datos dado.

El valor mínimo en el conjunto de datos se calcula como

121 es el valor mínimo en el conjunto de datos dado.

La normalización se calcula utilizando la fórmula que se proporciona a continuación.

De manera similar, calculamos la normalización para todos los valores de los datos.

Explicación

La fórmula de normalización se puede explicar en los siguientes pasos a continuación: & # 8211

Paso 1: A partir de los datos, el usuario necesita encontrar el valor máximo y mínimo para determinar los esquemas del conjunto de datos.

Paso 2: Luego, el usuario debe encontrar la diferencia entre el valor máximo y mínimo en el conjunto de datos.

Paso 3: Valor: el valor mínimo debe determinarse en función de todos y cada uno de los puntos de datos del conjunto.

Paso 4: Después de determinar todos los valores en el conjunto de datos, el valor debe colocarse en la fórmula, es decir, X nuevo = (X - X min) / (X max - X min)

Relevancia y usos de la fórmula de normalización

  • La normalización se usa ampliamente en técnicas de minería de datos y técnicas de procesamiento de datos. Por lo general, se conoce como escala destacada en la que se intenta traer datos en una forma normalizada o estandarizada para hacer análisis sobre ellos y dibujar varias interpretaciones.
  • Esta fórmula también se utiliza en el modelado de predicciones y la previsión, lo que hace que el modelo sea más relevante y fácil de usar.
  • Esta fórmula y técnica también se utiliza en el esquema de calificación de varios exámenes de ingreso donde, para asegurar que el candidato no se vea beneficiado ni privado por el nivel de dificultad en el examen, como resultado, el candidato que ha intentado preguntas simples o más fáciles puede obtener más calificaciones en la prueba en comparación con los candidatos que intentan preguntas difíciles con la idea de obtener más calificaciones.
  • La normalización también tiene sus propias limitaciones en el sentido de que si el conjunto de datos tiene más valores atípicos, la normalización del conjunto de datos se vuelve tediosa y una tarea difícil de realizar con los datos.

Calculadora de fórmulas de normalización

Puede utilizar la siguiente calculadora de normalización

Artículos recomendados

Esta ha sido una guía para la fórmula de normalización. Aquí discutimos cómo calcular la normalización junto con ejemplos prácticos. También proporcionamos una calculadora de normalización con una plantilla de Excel descargable. También puede consultar los siguientes artículos para obtener más información:


Genes de limpieza como controles de normalización

Para realizar la normalización usando un gen de mantenimiento, la mancha se prueba con anticuerpos para detectar la proteína de interés, mientras que otro conjunto de anticuerpos se usa para detectar una proteína separada que se usa como control de normalización. Para estudios cuantitativos, la relación entre la abundancia de la proteína de interés y el control de normalización se usa para cuantificar la cantidad de proteína de interés en cada muestra. Para estudios cualitativos, el control de carga a menudo se presenta en una imagen para comparación visual.

Los genes de mantenimiento, como la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GADPH), la beta-actina o la tubulina, se utilizan comúnmente para los controles de carga. Estas proteínas se expresan habitualmente de forma constitutiva a niveles elevados debido a su papel en la viabilidad celular. Sin embargo, varios factores limitan su utilidad como controles de normalización.


Materiales y métodos

Preparación de la muestra

Se cultivaron treinta y cuatro líneas celulares de neuroblastoma hasta la subconfluencia de acuerdo con las condiciones de cultivo estándar. El ARN se aisló usando el kit RNeasy Midi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron nueve muestras de ARN de tejidos humanos normales combinados (corazón, cerebro, cerebro fetal, pulmón, tráquea, riñón, glándula mamaria, intestino delgado y útero) de Clontech. Se obtuvieron biopsias de sangre y fibroblastos de diferentes individuos sanos normales. Se aislaron trece muestras de leucocitos de 5 ml de sangre fresca usando tampón de lisis de eritrocitos de Qiagen. Se cultivaron células de fibroblastos de 20 biopsias de piel de la parte superior del brazo durante un tiempo corto (3-4 pases) y se recolectaron en subconfluencia como se describe [22]. Se obtuvieron muestras de médula ósea de nueve pacientes sin malignidad hematológica. El ARN total de muestras de leucocitos, fibroblastos y médula ósea se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RT-PCR en tiempo real

El tratamiento con ADNasa, la síntesis de ADNc, el diseño de cebadores y SYBR Green I RT-PCR se llevaron a cabo como se describe [23]. En resumen, se trataron 2 μg de cada muestra de ARN total con la ADNasa libre de ARNasa RQ1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Las muestras de ARN tratadas se desalaron (para evitar el arrastre de magnesio) antes de la síntesis de ADNc utilizando columnas de centrifugación Microcon-100 (Millipore). El ADNc de primera hebra se sintetizó usando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa SuperscriptII de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen), y posteriormente se diluyó con agua libre de nucleasas (Sigma) hasta 12,5 ng / μl de ADNc. Las mezclas de amplificación de RT-PCR (25 μl) contenían 25 ng de ADNc molde, 2 x tampón de mezcla maestra SYBR Green I (12,5 μl) (Applied Biosystems) y cebador directo e inverso 300 nM. Las reacciones se realizaron en un detector de secuencias ABI PRISM 5700 (Applied Biosystems). Las condiciones de los ciclos comprendieron 10 minutos de activación de la polimerasa a 95 ° C y 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 60 segundos. Cada ensayo incluyó (por duplicado): una curva estándar de cuatro puntos de dilución en serie de ADNc de SK-N-SH o IMR-32 (que varían de 50 ng a 50 pg), un control sin molde y 25 ng de cada ADNc de prueba. . Todas las eficiencias de la PCR estuvieron por encima del 95%. Los resultados del software de detección de secuencias (versión 1.3) (Applied Biosystems) se exportaron como archivos de texto delimitados por tabuladores y se importaron a Microsoft Excel para su posterior análisis. El coeficiente de variación mediano (basado en cantidades calculadas) de muestras duplicadas fue del 6%.

Error de normalización de control único mi

Para cualquier dado metro muestras de tejido, niveles de expresión génica de RT-PCR en tiempo real a ij de norte se miden los genes de control interno. Para cada combinación de dos muestras de tejido pag y q, y cada combinación de dos genes de control interno j y k, el error de normalización de control único mi se calculó (Ecuación 1). Esta es la diferencia de expresión entre muestras. pag y q cuando se normaliza al gen de limpieza j o k.

j, k [1,norte], p, q [1,metro], jk y pagq):

Medida de estabilidad genética de control interno METRO

Por cada combinación de dos genes de control interno j y k, una matriz A jk de metro se calculan elementos que consisten en log2-relaciones de expresión transformadas a ij/a ik (Ecuación 2). Definimos la variación por pares V jk para los genes de control j y k como la desviación estándar de la A jk elementos (Ecuación 3). La medida de estabilidad genética METRO j para el gen de control j es la media aritmética de todas las variaciones por pares V jk (Ecuación 4).

j, k [1,norte] y jk):

V jk = st.dev (A jk) (3)

Normalización de datos de matriz

Los datos de microarrays sin procesar disponibles públicamente [14] se descargaron como archivos delimitados por tabuladores. Se seleccionaron aleatoriamente ocho conjuntos de datos de hibridación y se importaron al software Microsoft Excel para su posterior manipulación (MCF7, DU-145, 786-0, BC2, K562, A549, U251 y SK-OV-3). Para cada matriz de hibridación, se descartaron todos los puntos con intensidades de fluorescencia Cy3 o Cy5 por debajo del nivel de fondo general promedio más una desviación estándar. Posteriormente, se aplicó una corrección de fondo local para cada punto. Se calcularon dos factores de escala para cada portaobjetos sobre la base de la normalización de la proporción media (proporción media establecida en 1) y la normalización de la intensidad total (suma igualada de intensidades de fluorescencia para ambos canales). Se identificaron nueve genes de mantenimiento por similitud BLAST o búsqueda de palabras clave en la base de datos de clones de ADNc presentes en la matriz (ver clones IMAGE enumerados en la Tabla 1).


El diseño de un experimento de Western Blot cuantitativo

El Western Blot es una técnica que ha estado en práctica durante más de tres décadas que comenzó como un medio para detectar una proteína diana en una muestra compleja. Aunque ha habido avances significativos tanto en las tecnologías de imagen como de reactivos para mejorar la sensibilidad, el rango dinámico de detección y la aplicabilidad de la detección de objetivos multiplexados, la técnica básica se ha mantenido esencialmente sin cambios. En el pasado, el western blot se usaba simplemente para detectar una proteína diana específica en una mezcla compleja, pero ahora los editores de revistas y revisores están solicitando la interpretación cuantitativa de los datos del western blot en términos de cambios en la expresión de proteínas entre muestras. Los cálculos se basan en la densitometría diferencial de las señales quimioluminiscentes y / o fluorescentes asociadas de las transferencias y esto ahora requiere un cambio fundamental en la metodología experimental, adquisición e interpretación de los datos. Recientemente, hemos publicado un enfoque actualizado para producir datos densitométricos cuantitativos a partir de transferencias Western (Taylor et al., 2013) y aquí resumimos el flujo de trabajo completo de transferencias Western con un enfoque en la preparación de muestras y el análisis de datos para transferencias Western cuantitativas.

1. Introducción

Las tecnologías proteómicas como la electroforesis bidimensional y la espectrometría de masas son herramientas valiosas en los estudios de perfiles de proteínas semicuantitativos para identificar patrones de expresión amplios que permitan una mejor comprensión de los eventos moleculares, las vías de señalización y los mecanismos [1]. Los datos resultantes se confirman típicamente mediante un segundo método independiente, como el Western Blot. La transferencia Western fue introducida por Towbin et al. [2] en 1979 y desde entonces se ha convertido en una técnica común utilizada en laboratorios de investigación a nivel mundial para la inmunodetección y cuantificación de proteínas específicas en homogeneizados de células complejas. Durante las últimas tres décadas, la sensibilidad, solidez y flexibilidad de los correspondientes sistemas de indicadores han aumentado significativamente [3, 4]. Además, el desarrollo continuo de medios de detección y reactivos ha proporcionado a la comunidad científica sistemas de imágenes ultrasensibles que brindan un amplio rango dinámico de detección que permite la cuantificación precisa y exacta de señales de proteínas de baja y alta expresión de la misma transferencia. Aunque los laboratorios se han apresurado a adquirir las últimas tecnologías de detección y reactivos para Western Blot, las técnicas asociadas que se utilizan para producir los datos densitométricos no han evolucionado y han dado lugar a datos publicados que sean difíciles o imposibles de interpretar o reproducir [5-7].

Para obtener datos cuantitativos de las transferencias de Western, se debe utilizar una metodología rigurosa como se describió anteriormente [8]. En resumen, la validación de los anticuerpos (Ab) es fundamental tanto para asegurar que la interacción Ab / antígeno sea específica y correcta como para determinar el factor de dilución de las muestras que se requiere para la carga de proteínas en el rango dinámico lineal cuantitativo para cada anticuerpo. Además, se debe considerar la selección apropiada del método de normalización (basado en señales de referencia obtenidas por las proteínas de mantenimiento (HKP) después de la tinción inmunoquímica o la intensidad de la proteína total (TP) en las membranas de transferencia después de la tinción de la proteína total) para asegurar que los cambios de veces reportados de la proteína diana no es un artefacto de la señal de referencia. Por lo tanto, la normalización de datos es crucial para identificar y corregir errores experimentales donde la inestabilidad de referencia se vuelve cada vez más importante con la medición de diferencias más pequeñas en la expresión de la proteína diana entre muestras [9]. El efecto directo de una mala normalización es evidente cuando la muestra se carga por encima de 10 μSe requieren g de lisado de proteína total por carril porque los HKP de carga tradicionales como GAPDH, actina y tubulina están sobrecargados y, por lo tanto, no sirven para la normalización de datos [8, 9]. Además, estos HKP pueden verse afectados por las condiciones de tratamiento del experimento dando resultados sesgados para la expresión de la proteína diana que no reflejan la biología de las muestras analizadas [10-15]. Alternativamente, se ha demostrado recientemente que la normalización por proteína total transferida por transferencia proporciona datos excelentes para los lisados ​​de proteínas totales típicos [16].

A continuación, describimos algunas técnicas generales para producir muestras de proteínas de buena calidad con una degradación mínima para mejorar la reproducibilidad entre experimentos. También se resumen los pasos básicos de la transferencia Western cuantitativa y un enfoque estandarizado para calcular los datos densitométricos asociados a partir de múltiples transferencias.

2. El diseño experimental cuidadoso produce datos confiables y reproducibles

A diferencia de los ensayos basados ​​en ADN que miden un tipo predecible de molécula que típicamente es estable en una variedad de condiciones, las proteínas pueden variar significativamente en su expresión, estabilidad, conformación y actividad bajo diferentes condiciones de tampón y experimentales. Además, la presencia de proteínas contaminantes en un homogeneizado puede afectar en gran medida la integridad y la actividad de las proteínas diana [17]. Por lo tanto, se debe tener cuidado en el diseño de cualquier ensayo basado en proteínas para asegurar que las diferencias aparentes entre las muestras de casos y controles no sean un artefacto de las condiciones experimentales o el manejo de la muestra. Los factores que pueden tener una gran influencia en el proteoma incluyen el tiempo y la temperatura de incubación, así como los parámetros para procesar las muestras, como la cantidad de tiempo entre la recolección de tejido y la posterior congelación o incluso las condiciones y el momento para descongelar el tejido o los sedimentos celulares (Tabla 1).

Procedimiento de experimentoGrupos de controlRéplicasCondiciones del experimentoManipulación de muestras
Grupos de tratamiento o enfermedadEstudio del curso de tiempo (es decir,

3. Preparación de la muestra

Existen varios errores asociados con la preparación de la muestra que pueden afectar directamente la densidad de las bandas en una transferencia de Western incluyendo: (1) manejo inadecuado de muestras de tejido o células que resulta en una degradación variable y / o expresión de proteínas entre muestras, (2) detergentes inadecuados , sales e inhibidores de proteasa en el tampón de lisis, (3) mala técnica de homogeneización.

Dado que los lisados ​​de proteínas son altamente complejos con contaminantes como restos celulares o tisulares, grasas, agregados de proteínas hidrófobas, ácidos nucleicos y proteasas que pueden afectar directa y negativamente los resultados de las transferencias de Western, es importante utilizar tampones de lisis celular y técnicas de homogeneización que eliminar sus efectos [17]. En general, los tampones de homogeneización que contienen detergentes no iónicos como NP-40 y Triton X-100 son menos agresivos que los detergentes iónicos, como SDS y desoxicolato de sodio. Las sales como NaCl o KCl se agregan típicamente a una concentración de 100 a 150 mM para prevenir la agregación de proteínas. Tampón RIPA (NP-40 al 1% o Triton X-100, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM) y tabletas completas de cóctel de mini inhibidores de proteasa (Roche Applied Science) en combinación con instrumentos de homogeneización mecánicos o manuales se han utilizado para producir homogeneizados que dan datos sólidos para los ensayos de transferencia Western.

La elección adecuada de la técnica de homogeneización de tejido es un requisito previo para un ensayo de Western blot exitoso y el método empleado depende completamente del tipo de muestra (es decir, cerebro versus músculo versus tejido hepático versus células en placa o suspendidas) [18, 19]. Un buen ejemplo de un protocolo de lisis de tejido es el siguiente: (1) Congele el tejido en nitrógeno líquido y luego corte el tejido en trozos de 1 mm con un bisturí en un mortero sobre hielo seco. Asegúrese de que el bisturí o la trituradora también estén congelados en hielo seco para mantener el tejido cortado o molido cerca de la temperatura del hielo seco durante todo el procedimiento. (2) Agregue el tejido cortado en cubitos / molido al tampón RIPA helado. (3) Transfiera la preparación de tejido a un homogeneizador de tejido Dounce helado (Wheaton) y Dounce 25x en hielo. (4) Sonicar (Tekmar Sonic Disrupter) el tejido homogeneizado Dounce en hielo durante

segundos al 50% de potencia y aclarar los extractos mediante centrifugación a 34.000 xga 4 ° C durante 30 minutos. (5) Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y realice el ensayo de proteínas (ver más abajo). (6) Almacene los sobrenadantes a -80 ° C o en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Para la lisis celular, agregue las células sedimentadas (en el caso de suspensiones celulares) al tampón RIPA enfriado con hielo o para las células en placa, agregue el tampón RIPA enfriado con hielo directamente a la placa después de lavar las células, y raspe y pipetee las células hacia arriba y abajo. Continúe con el paso (3) anterior.

La concentración de proteína total del homogeneizado de lisados ​​de células o tejidos debe medirse utilizando un ensayo de proteínas compatible con detergentes, como el ensayo de proteínas RC DC de Bio-Rad. Idealmente, los homogeneizados se diluirían a una concentración de al menos 2 mg / mL que permitiría cargar entre 10 μgy 80 μg por carril de un mini gel SDS de poliacrilamida de 1 mm de espesor.

4. Determine el rango dinámico lineal de carga de proteínas

La mayoría de los laboratorios cargan una cantidad aleatoria de proteína en cada línea de un gel para la transferencia Western que suele estar entre 10 μgy 100 μg de lisado total y normalmente no existe una base científica para elegir esta cantidad. Esto a menudo da como resultado la sobrecarga de proteínas diana altamente expresadas y, en particular, los controles de carga que se utilizan para normalizar los datos. Por lo general, esto proporciona densidades de banda uniformes entre los carriles para las proteínas de mantenimiento, lo que no se debe a una carga constante de proteínas, sino a la sobrecarga de la membrana con la proteína objetivo (Figura 1). Para aliviar el efecto de la saturación de la membrana, se debe producir una curva estándar de carga de proteína frente a densidad de banda para cada proteína diana. Esto se puede lograr haciendo una serie de dilución 1/2 de una muestra combinada de todos los lisados ​​en el grupo de estudio a partir de 100 μg de proteína en al menos 12 diluciones en un gel SDS sin tinción TGX (Bio-Rad). La detección sin manchas en el sistema de cámara ChemiDoc MP (Bio-Rad) se puede utilizar para verificar la carga, la calidad y la separación del homogeneizado seguido de la transferencia a una membrana de PVDF de baja fluorescencia utilizando la proteína Trans Blot Turbo (Bio-Rad) sistema de transferencia [8].


Solo se pueden generar datos confiables de transferencia de Western cuando se usa la cantidad de muestra adecuada de proteína. Cargar demasiada proteína conduce a la saturación de la señal en las transferencias Western, pero muy poca produce señales débiles. Una vez que se hayan establecido la configuración y las condiciones experimentales para el ensayo, no cambie la carga de la muestra, el método de transferencia, el tiempo de transferencia, la dilución del anticuerpo, el tiempo de incubación del anticuerpo o la temperatura en experimentos posteriores, ya que estos factores pueden cambiar significativamente las señales de detección.

A continuación, se muestra una metodología típica para la determinación de la carga adecuada para las muestras de proteínas: (1) Transfiera y transfiera en consecuencia incubando el anticuerpo primario de la proteína diana y el secundario asociado a cada transferencia con al menos cuatro pasos de lavado de 3 minutos entre cada incubación. (2) Agregue un sustrato de quimioluminiscencia compatible con el generador de imágenes como Clarity (Bio-Rad) para desarrollar la señal inmunoquímica y capturar la señal utilizando un generador de imágenes basado en una cámara CCD como el ChemiDoc MP (Bio-Rad). (3) Obtenga imágenes de las transferencias utilizando un software que proporcione herramientas densitométricas precisas con sustracción de fondo, como Image Lab (Bio-Rad), y genere un gráfico de densidad relativa frente a la dilución de veces para cada anticuerpo primario. (4) Valide los anticuerpos determinando su rango dinámico lineal (es decir, el rango en el que se obtiene una disminución constante de 1/2 en la densidad). (5) Seleccione la carga de proteína para cada anticuerpo que corresponda a la mitad del rango dinámico lineal.

La dilución de las muestras individuales en el grupo de estudio hasta el punto medio en el rango dinámico lineal de la muestra combinada para cada anticuerpo puede significar que las muestras de proteínas individuales requieren diluciones muy diferentes para cada anticuerpo. Esto asegurará que los datos densitométricos para cada proteína objetivo estarán dentro del rango dinámico lineal (cuantitativo) para dar resultados precisos y reproducibles que reflejen la verdadera biología entre las muestras en el conjunto de estudio (Figura 2). La carga inadecuada de muestras puede resultar en una diferencia no cuantificable entre las muestras para un objetivo dado simplemente debido a la sobrecarga de la membrana.


(De [9] con permiso de los autores y Bio-Rad.) Comparación de linealidad de la medición de proteínas totales sin tinción y la inmunodetección de tres proteínas domésticas en 10–50 μg de lisado de células HeLa. A la izquierda hay imágenes representativas de (a), la mancha sin manchas y las manchas químicas para (b), β-actina (c), β-tubulina y (d), GAPDH. Las etiquetas de los carriles corresponden a la carga total de proteínas (μgramo). Aunque las señales de actina y tubulina parecen lineales, la relación densitométrica estuvo muy por debajo de la "respuesta cuantitativa" predicha de la carga real, mientras que la señal sin manchas se correlacionó con el resultado esperado (e).

5. Determine la señal de referencia adecuada para la normalización de datos

Una buena señal de referencia o "control de carga" es aquella que se coexpresa con la proteína diana dentro de la misma muestra y se expresa de manera consistente entre muestras. HKP como tubulina, β-actin y GAPDH han servido tradicionalmente como controles de carga, pero existen tres posibles inconvenientes en el uso de dichos controles. (1) Es posible que los HKP no se expresen de manera uniforme entre las condiciones experimentales, lo que dará resultados erróneos [10-15]. El mismo problema se ha encontrado con genes de referencia utilizados para qPCR donde la selección de objetivos inestables ha llevado a resultados opuestos cuando se compara con objetivos estables [20, 21]. (2) Los HKP son muy abundantes en los lisados ​​y normalmente han saturado la membrana para las muestras cargadas en exceso de aproximadamente 4 μg por carril (ver sección anterior) (Figura 2). Esto daría a estas proteínas la "apariencia" de buenos controles de normalización porque las densidades de las bandas asociadas serían todas similares entre carriles como un "artefacto" de saturación de la membrana. (3) La normalización de datos con HKP se basa solo en un punto de datos y proporciona un reflejo deficiente de las posibles inconsistencias del proceso.

Dados los problemas que surgen con los controles de HKP, la comunidad científica ha buscado métodos alternativos de normalización y proponemos que un excelente control de carga (LC) debe cumplir los siguientes criterios. (1) Tiene una buena capacidad de respuesta (1: 1) a los cambios en la cantidad total de proteína de las muestras individuales. (2) Es insensible a la influencia de diversas condiciones fisiológicas y tratamientos y, por lo tanto, debe cuantificarse a partir de la propia membrana para tener en cuenta el efecto de la eficiencia de transferencia [22, 23]. (3) Idealmente, la adquisición de LC sería posible en todas las fases del proceso de transferencia de Western (es decir, visualización de la proteína en las líneas de gel de pretransferencia, transferencia de transferencia posterior y líneas de gel de transferencia posterior), lo que permite un control constante del proceso. (4) La adquisición de LC debe ser rápida, fácil y altamente reproducible. (5) No debe requerirse un proceso prolongado para la optimización y el establecimiento de LC. (6) El método de detección por CL debe ser compatible con la tinción inmunoquímica.

Para abordar estos problemas, la comunidad científica está adoptando ahora el uso de la densidad total de carriles de la proteína transferida por transferencia como un medio de normalización de datos [24-26]. Hay una serie de tinciones que se pueden utilizar para visualizar, obtener imágenes y cuantificar la proteína transferida en la mancha, incluidas Ponceau S, Coomassie R-350, Amido Black, MemCode y Deep Purple. Sin embargo, cada una de estas tinciones tiene problemas individuales de ser poco reproducible en el día a día, rango dinámico limitado y compatibilidad restringida con membranas de transferencia y tinción inmunoquímica [25]. Más recientemente, se introdujo la tecnología Stain-Free (Bio-Rad) [24-26] y cumple con los seis criterios mencionados anteriormente para una buena LC con un rango dinámico lineal entre aproximadamente 10 y 80 μg de carga proteica total de un lisado celular o tisular típico [8, 9]. Esto permite el uso de la densidad total de carriles de la transferencia sin manchas para la normalización entre carriles para la mayoría de los estudios de transferencia Western.

La técnica para la normalización total del carril utilizando la tecnología de ensayo sin manchas se ha descrito bien, pero brevemente es la siguiente: (a) La calidad de la separación electroforética se puede verificar en un par de minutos. Después de la activación UV, las bandas de proteínas son visibles en el gel y se pueden grabar con un sistema de cámara. La señal fluorescente generada permanece estable durante un par de horas. (b) Se obtienen imágenes de la mancha inmediatamente después de la transferencia para verificar la transferencia de proteína de cada carril. (c) The image data from the total density of all the blot-transferred protein bands per lane is then recorded using Image Lab software by selecting a single band in each lane and stretching the band width to cover all the volume peaks in the lane profile. (d) The background rolling disc is adjusted to a low value (between 1 and 5) for all the lanes to assure that only the total background subtracted density from the sum of all the bands per lane is acquired for normalization.

In addition, Stain-Free technology is compatible with both nitrocellulose and PVDF membranes and data normalization with SF blot images is based on many data points which is superior to HKPs.

6. Data Analysis: The Background Subtraction Problem

Background subtraction is a common reason to obtain variable or incorrect data from western blots [27]. Using traditional densitometric analysis methods such as volume analysis from boxed bands and background, variations in background-subtracted data can arise since the background is not subtracted from the same box in which the band resides. Furthermore, the box in which a band is selected always contains density from both the band and the associated background which becomes more prevalent with low density bands [8]. The combination of these factors can result in highly variable data when testing samples with a differentially expressed target protein using a nonspecific antibody with high background. A good alternative to volume analysis using boxes is a rolling disc background subtraction algorithm coupled with a lane profile tool (Figure 3). Image Lab software is designed with both of these tools that can be used simultaneously to ensure that the appropriate band width and lane background is selected for each lane (Figure 3).


(From [8] with permission from the authors and Bio-Rad.) Image acquisition and densitometric analysis. Image Lab software version 5.0 (Bio-Rad) was used for image acquisition and densitometric analysis of the gels, blots, and film in this study. The software interprets the raw data in three dimensions with the length and width of the band defined by the “Lanes and Bands” tool in concert with the “Lane Profile” tool such that the chemiluminescent signal emitted from the blot is registered in the third dimension as a peak rising out of the blot surface. The density of a given band was measured as the total volume under the three-dimensional peak, which could be viewed in two dimensions using the “Lane Profile” tool to adjust the precise width of the band to account for the area under the shaded peak of interest. Background subtraction was set by using the rolling disc setting in the “Lanes” tool. The rolling disc values were set such that the background was subtracted under the band (i.e., peak) of interest in a uniform manner between the lanes of a given blot. In this case, the rolling disc for the two lanes analyzed was set to 18 and 25, respectively, such that the peaks of interest were cut at a consistent level between the markers shown with an “X”.

7. Computational Analysis of Densitometric Data

There are numerous calculations from densitometric data using formulas buried in EXCEL spreadsheets spanning multiple worksheets and files to obtain quantitative data from western blots. It is often difficult to follow the basis of the calculations and we have found that when lab members are faced with the direct question of how to work up the raw data obtained from western blots to publishable results, there is often confusion. The analysis of western blot data can be accomplished using a very similar methodology to qPCR by calculating relative, normalized protein expression as described in the following steps (Tables 2 and 3). (1) For each blot, multiply the background subtracted density (volume in Image Lab software) of the target protein (TP) in each lane by the ratio of density of the loading control (LC) (either housekeeping protein or total lane density) from a control sample loaded into lane 1 of all the study blots to the other lanes in the gel. This will give the normalized density to the loading control (NDL) (Table 2). The control sample is typically a pooled homogenate from all of the samples in a given study aliquoted into multiple tubes to permit the loading of a fresh control sample in lane 1 of each study blot. (2) Calculate the fold difference (FD) for each biological/technical replicate by dividing NDL from each lane by the NDL from the control sample in lane 1 (Table 2). (3) Determine the average FD and associated

values for the biological replicates by importing the FD from step (2) above into a statistical analysis software package such a PRISM or Analyze IT (Table 3).


Why do we need western blotting?

Besides being an essential analytical tool to identify a protein of interest in a complex mixture, western blot data can also be used as a semi-quantitative method to determine and compare the expression of specific proteins in various cells and tissues [5]. Although the western blotting technique can also be used for absolute quantification [6], this requires a linear standard curve of purified target protein. The target protein in the homogenate must be within the range of the standard curve hence western blotting is very rarely used for absolute quantification. However, semi-quantification of protein levels using western blots is common in most life science laboratories.

The advantages of western blots include the ability to detect picogram levels of protein in a sample [7], allowing the technique to be used for many purposes including as an effective early diagnostic tool [8,9]. The sensitivity and specificity of western blots is due to two main factors: 1) the separation of proteins which are different in size, charge and conformation by gel electrophoresis. For sodium-dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel-electrophoresis (PAGE) the proteins are denatured and given a negative charged by binding to SDS, then separated based on size. The molecular mass of the protein identified by western blot can be determined by using standards of known molecular weights. 2) The specificity of the antibody-antigen interaction. The selective nature of the specific antibody allows the detection of a target protein in complex mixtures containing > 100,000 different proteins. When two-dimensional (2D) electrophoresis is used instead of one dimensional (1D) electrophoresis (2DE westerns), isoforms and post-translationally modified target proteins with similar molecular masses can be identified [10].


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Western blot protocol

Reviewed December 14 2020

Western blotting is a technique that uses specific antibodies to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and the application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest and visualized using secondary antibodies and detection reagents.

Contenido

View our western blot protocol video below.

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​Solutions and reagents: lysis buffers

These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.

NP-40 buffer

  • 150 mM NaCl
  • 1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Protease inhibitors

RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Protease inhibitors

Tris-HCl

​ Solutions and reagents: running, transfer, and blocking buffers

​Laemmli 2X buffer/loading buffer

  • 4% SDS
  • 10% 2-mercaptoethanol
  • 20% glycerol
  • 0.004% bromophenol blue
  • 0.125 M Tris-HCl

Check the pH and adjust to 6.8

Running buffer (Tris-Glycine/SDS)

Check the pH and adjust to 8.3

Transfer buffer (wet)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 20% methanol
  • Check the pH and adjust to 8.3

For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.

Transfer buffer (semi-dry)

  • 48 mM Tris
  • 39 mM glycine
  • 20% methanol
  • 0.04% SDS

Blocking buffer

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)

Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.

​Sample lysis

​Preparation of lysate from cell culture

  1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice-cold PBS.
  2. Aspirate the PBS, then add ice-cold lysis buffer (1 mL per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask 0.5 mL per 5x10 6 cells/60 mm dish/75 cm 2 flask).
  3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper, then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microcentrifuge tube. Alternatively, cells can be trypsinized and washed with PBS prior to resuspension in lysis buffer in a microcentrifuge tube.
  4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.
  5. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C. You may have to vary the centrifugation force and time depending on the cell type a guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined for your experiment (leukocytes need very light centrifugation).
  6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

​Preparation of lysate from tissues

  1. Dissect the tissue of interest with clean tools, on ice preferably, and as quickly as possible to prevent degradation by proteases.
  2. Place the tissue in round-bottom microcentrifuge tubes or Eppendorf tubes and immerse in liquid nitrogen to snap freeze. Store samples at -80°C for later use or keep on ice for immediate homogenization. Para

Sample preparation

  1. Remove a small volume of lysate to perform a protein quantification assay. Determine the protein concentration for each cell lysate.
  2. Determine how much protein to load and add an equal volume 2X Laemmli sample buffer.​

​Loading and running the gel

  1. Load equal amounts of protein into the wells of the SDS-PAGE gel, along with a molecular weight marker. Load 20–30 μg of total protein from cell lysate or tissue homogenate, or 10–100 ng of purified protein.
  2. Run the gel for 1–2 h at 100 V.

The time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.

The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:

Protein size

Gel percentage

Gradient gels can also be used.

​Transferring the protein from the gel to the membrane

The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.

Prepare the stack as follows:

Figure 1. Example of prepared stack.

Tinción de anticuerpos

  1. Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.
  2. Incubate the membrane with appropriate dilutions of primary antibody in blocking buffer. We recommend overnight incubation at 4°C other conditions can be optimized.
  3. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  4. Incubate the membrane with the recommended dilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.
  5. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  6. For signal development, follow the kit manufacturer’s recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.
  7. Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.

Useful links

All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate

Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products your results from using protocols outside of these conditions may vary.

Webinar transcript​

The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta-mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.

Place a gel into the electrophoresis tank and add in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.

The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer's instructions for guidance.

Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with [inaudible 00:04:40] solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.

After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.

Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.

There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.


Ver el vídeo: Normalización (Junio 2022).