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Tampón PBST frente a TBST en transferencia Western

Tampón PBST frente a TBST en transferencia Western



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¿Cuáles son las ventajas y desventajas de usar PBST o TBST en la transferencia Western o mientras se trabaja con proteínas en general? ¿Existen otros tampones que también se utilizan para la transferencia Western o pasos de lavado mientras se trabaja con proteínas?


Solía ​​trabajar para una empresa conocida por sus anticuerpos específicos de estado de modificación, incluidos los fosfoespecíficos, y de hecho realizaron extensas pruebas internas de PBST frente a TBST en Western Blot. Parte de la razón por la que la empresa decidió recomendar el uso de solución salina tamponada con Tris en lugar de tampones a base de solución salina tamponada con fosfato fue el hecho claramente demostrado de que algunos anticuerpos fosfoespecíficos simplemente no funcionaron tan bien en PBST como en TBST. por cualquier razón. Según recuerdo (ha pasado bastante tiempo desde que se realizó la prueba), algunos de los anticuerpos probados dieron señales más débiles, con más antecedentes, y uno en particular simplemente no funcionó en absoluto en PBST, sin señal alguna. Por esa razón, la compañía optó por estandarizar su protocolo de transferencia Western recomendado con TBST, y ha sido así desde entonces.

Dicho esto, estoy seguro de que la mayoría de los anticuerpos que existen funcionarían bien en cualquier tampón. Sin embargo, para estar seguro, si una empresa establece un búfer u otro en su protocolo, sería mejor usar el recomendado.


¿Lavados para Western, PBS o TBST? - (13 / Mar / 2006)

Hola, solo tengo curiosidad por saber si las personas realizan sus lavados de pre-detección de anticuerpos primarios de una membrana de PVDF borrada en PBS o TBST, y si uno en lugar del otro, ¿por qué?

si está observando el estado de fosforilación, TIENE que usar TBS (los fosfatos en PBS arruinarán sus resultados)

esta es la principal diferencia de la que soy consciente

Hola,
aimkins en nuestro laboratorio usamos, fosfo ERK, anticuerpos jnk n p38, todos los cuerpos usan PBS.
Me pregunto cuál es tu respuesta, si es posible, déjame claro este concepto.
Gracias

si está observando el estado de fosforilación, TIENE que usar TBS (los fosfatos en PBS arruinarán sus resultados)

esta es la principal diferencia de la que soy consciente

esos son los mismos westerns que nosotros. Me dijeron que TBS lo estropearía y le proporcionaría un alto nivel de experiencia, además de interferir potencialmente con sus resultados.

No tengo una referencia, sin embargo, lo he escuchado de varias personas. ¿Quizás sea un cuento de viejas?

Utilizo 6x TBST antes de agregar mi secundario, y 5xTBST y luego 1x PBS antes de la detección. Me dijeron que la interpolación puede dar fondos altos y que debe lavarla con PBS antes de comenzar la detección.

Lavamos 3X & # 39s en TBS-T y 1X PBS y funciona bien & # 33

esos son los mismos westerns que nosotros. Me dijeron que TBS lo estropearía y le proporcionaría un alto nivel de experiencia, además de interferir potencialmente con sus resultados.

No tengo una referencia, sin embargo, lo he escuchado de varias personas. ¿Quizás sea un cuento de viejas?

Yo uso PBS. Buscaré el estado de fosforilación pronto, así que estoy interesado en lo que dijiste. También me gustaría preguntar si alguien ha utilizado anticuerpos anti-fosfoserina para detectar proteínas fosforiladas. Si es así, ¿alguna recomendación? ¿También es posible cuantificar y comparar el estado de fosforilación usando estos anticuerpos?
Gracias

esos son los mismos westerns que nosotros. Me dijeron que TBS lo estropearía y le proporcionaría un alto nivel de experiencia, además de interferir potencialmente con sus resultados.

No tengo una referencia, sin embargo, lo he escuchado de varias personas. ¿Quizás sea un cuento de viejas?

Yo uso PBS. Buscaré el estado de fosforilación pronto, así que estoy interesado en lo que dijiste. También me gustaría preguntar si alguien ha utilizado anticuerpos anti-fosfoserina para detectar proteínas fosforiladas. Si es así, ¿alguna recomendación? ¿También es posible cuantificar y comparar el estado de fosforilación usando estos anticuerpos?
Gracias

Debe recordar que PBS es una solución salina tamponada con fosfato y TBS una solución salina tris-base. Los grupos fosfato en PBS pueden interferir con la unión del anticuerpo anti-fosfato a su proteína potencialmente fosforilada y unirán todos los grupos fosfato en la solución salina en lugar de los sitios de fosforilación de la proteína.
Además, la leche no se usa para bloquear cuando se usan anticuerpos anti-fosfo debido a las fosfoproteínas en la leche que competirán por la fosforilación con sus proteínas potencialmente fosforiladas.

esos son los mismos westerns que nosotros. Me dijeron que TBS lo estropearía y le proporcionaría un alto nivel de experiencia, además de interferir potencialmente con sus resultados.

No tengo una referencia, sin embargo, lo he escuchado de varias personas. ¿Quizás sea un cuento de viejas?

Yo uso PBS. Buscaré el estado de fosforilación pronto, así que estoy interesado en lo que dijiste. También me gustaría preguntar si alguien ha utilizado anticuerpos anti-fosfoserina para detectar proteínas fosforiladas. Si es así, ¿alguna recomendación? ¿También es posible cuantificar y comparar el estado de fosforilación usando estos anticuerpos?
Gracias

Debe recordar que PBS es una solución salina tamponada con fosfato y TBS una solución salina a base de tris. Los grupos fosfato en PBS pueden interferir con la unión del anticuerpo anti-fosfato a su proteína potencialmente fosforilada y unirán todos los grupos fosfato en la solución salina en lugar de los sitios de fosforilación de la proteína.
Además, la leche no se usa para bloquear cuando se usan anticuerpos anti-fosfo debido a las fosfoproteínas en la leche que competirán por la fosforilación con sus proteínas potencialmente fosforiladas.

la principal diferencia es que TTBS contiene el agente bloqueante Tween que aumenta la especificidad durante la incubación de Ab, mientras que PBS no tiene bloqueador

si realmente desea decidir qué búfer prefiere, debe probar ambos búferes para cada Ab

Una teoría para preferir el PBS para el análisis del estado fosforado es que la alta concentración de PO4 / 3 reduce la presión de hidrolización de los fosforilos de los polipéptidos.

sin embargo, hemos decidido utilizar TTBS de forma rutinaria aunque analizamos muchas fosfoproteínas


Objeto y función de los pasos de bloqueo

Los soportes de membrana utilizados en la transferencia Western tienen una alta afinidad por las proteínas. Por lo tanto, después de la transferencia de las proteínas del gel, es importante bloquear la superficie restante de la membrana para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos de detección durante los pasos posteriores. Se han utilizado una variedad de tampones de bloqueo que van desde la leche o el suero normal hasta proteínas altamente purificadas para bloquear los sitios libres en una membrana. El búfer de bloqueo debería mejorar la sensibilidad del ensayo reduciendo la interferencia de fondo y mejorando la relación señal / ruido. El tampón de bloqueo ideal se unirá a todos los sitios potenciales de interacción inespecífica, eliminando el fondo por completo sin alterar u oscurecer el epítopo para la unión del anticuerpo.

La elección adecuada del bloqueador para una transferencia determinada depende del antígeno en sí y del tipo de etiqueta de detección utilizada. Por ejemplo, en aplicaciones en las que se utilizan conjugados de AP, debe seleccionarse un tampón de bloqueo en TBS porque el PBS interfiere con la fosfatasa alcalina. Para una verdadera optimización del paso de bloqueo para un inmunoensayo particular, las pruebas empíricas son esenciales. Muchos factores, incluidas diversas interacciones proteína-proteína exclusivas de un conjunto dado de reactivos de inmunoensayo, pueden influir en la unión inespecífica. El parámetro más importante a la hora de seleccionar un bloqueador es la relación señal / ruido, medida como la señal obtenida con una muestra que contiene el analito diana, en comparación con la obtenida con una muestra sin el analito diana. El uso de cantidades inadecuadas de bloqueador dará como resultado una tinción de fondo excesiva y una relación señal / ruido reducida. El uso de concentraciones excesivas de bloqueador puede enmascarar las interacciones anticuerpo-antígeno o inhibir la enzima marcadora, provocando nuevamente una reducción de la relación señal / ruido. Al desarrollar un nuevo inmunoensayo, es importante probar varios bloqueadores diferentes para obtener la relación señal / ruido más alta en el ensayo. Ningún agente bloqueante es ideal para cada ocasión, ya que cada par de anticuerpo-antígeno tiene características únicas.

Manual técnico de detección de proteínas

Este manual de 84 páginas proporciona una descripción profunda del último paso en el flujo de trabajo de Western Blot: la detección de proteínas. Con una variedad de técnicas de detección para elegir (quimioluminiscencia, fluorescencia o cromogénica), puede seleccionar una tecnología que se adapte a sus requisitos experimentales y los instrumentos que tiene disponibles. Ya sea para visualización rápida o cuantificación precisa, detección de sonda única o multiplexación, Thermo Fisher Scientific ofrece una gama de reactivos y kits para la detección de transferencia Western y análisis posterior.


TBST [10X] (2 citas)

Una solución concentrada 10X de solución salina tamponada con Tris con Tween & reg 20 con una concentración de Tris.HCl 100 mM, NaCl 150 mM, Tween & reg 20 al 0,5% a pH 7,5. La concentración 1X es Tris.HCl 10 mM, NaCl 15 mM, Tween al 0,05% y reg 20 a pH 7,5. También está disponible un formato de paquete de tampón seco para producir 1L de 1X TBST.

TBST se usa comúnmente como una solución de lavado para membranas de transferencia Western y pocillos de placas de microvaloración en ensayos ELISA. La solución salina tamponada con Tris con Tween & reg 20 es una formulación óptima de estabilizadores de pH, sales y detergentes diseñados para eliminar eficazmente el exceso de material de las membranas y los pocillos de las placas de microvaloración sin interrumpir la reacción de unión del antígeno / anticuerpo. Al mantener el entorno de tampón adecuado, los componentes no unidos se pueden lavar sin suprimir las interacciones de unión antígeno-anticuerpo, reduciendo así el fondo inespecífico y aumentando la señal específica.


Pelado suave

15 g de glicina
1 g de SDS
10 ml de Tween 20
Disolver en 800 mL de agua destilada.
Ajustar el pH a 2,2
Lleve el volumen hasta 1 L con agua destilada.

  1. Con un volumen que cubra la membrana, incube a temperatura ambiente durante 5 a 10 min.
  2. Descartar búfer
  3. Repita la incubación durante 5 a 10 minutos con tampón de extracción nuevo.
  4. Descartar búfer
  5. Lavar durante 10 min en PBS
  6. Lavar durante 10 min en PBS
  7. Lavar durante 5 min en TBST
  8. Lavar durante 5 min en TBST
  9. Listo para bloquear


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Formulaciones de tampón de transferencia Western Blot

El tampón de transferencia estándar para las transferencias Western, llamado tampón Towbin, es Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3 y mdash normalmente con metanol al 20% (vol / vol). A veces, se agrega SDS a este búfer, generalmente en el rango de 0.1 a 0.25%. Este tampón de transferencia tiene una fuerza iónica baja y una conductividad baja, lo que es óptimo para el secado en tanque (húmedo) y para algunos aparatos semisecos.

El tampón de transferencia Western Tris / glicina puede no ser adecuado en algunos tipos de aparatos para la transferencia de proteínas de muy alto peso molecular, que requieren tiempos de transferencia prolongados. A medida que avanza la transferencia durante un período prolongado de tiempo, la producción de calor disminuye la resistencia del tampón de transferencia de transferencia Western estándar, lo que hace que el tampón de transferencia pierda capacidad de almacenamiento, lo que reduce la eficiencia de la transferencia. Además, el aumento de calor puede hacer que los geles se adhieran a la membrana, creando un problema de manipulación para los geles blandos de acrilamida de bajo porcentaje que se usan generalmente para proteínas de muy alto peso molecular. A menudo, estos geles deben rasparse cuidadosa y laboriosamente de la membrana.

Para proteínas particulares, la elección del tampón de transferencia puede afectar la eficacia de la transferencia. Generalmente, las proteínas ácidas se transfieren de manera más eficiente en un tampón de transferencia Western con un pH más bajo, y las proteínas básicas se transfieren de manera más eficiente en un tampón de transferencia con un pH más alto. Hay muchos tampones que se utilizan para la transferencia Western, como el tampón de carbonato de Dunn (NaHCO 10 mM3, Na2CO 3 mM3, pH 9,9) CAPS 10 mM, pH 11 y CHES 10 mM, pH 9,6.

Para la transferencia Western semiseco, además de los tampones de transferencia Tris / glicina estándar, se puede sustituir la glicina por CAPS. Una formulación típica tiene Tris 60 mM y CAPS 40 mM. Una ventaja de la transferencia semiseca es que, a diferencia de la transferencia en tanque, los tampones de ánodo y cátodo están separados. Esto proporciona la capacidad de aumentar la eficiencia de la transferencia al tener diferentes tampones en el ánodo y el cátodo. Por ejemplo, generalmente se agrega metanol al 15% al ​​tampón del ánodo, y a menudo se agrega SDS al 0.1% al tampón del cátodo.


Use una concentración final de 0.1 - 0.2% Tween & reg 20

No use SDS con membranas de nitrocelulosa

Use una concentración final de 0.1 - 0.2% Tween & reg 20

No agregue SDS a la dilución de anticuerpos primarios

Use una concentración final de 0.1 - 0.2% Tween & reg 20

No use SDS con membranas de nitrocelulosa

Use una concentración final de 0.1 - 0.2% Tween & reg 20

Agregue la dilución final de anticuerpo SDS al 0.01-0.02%

Agregue 0.1% Tween & reg 20 a la solución de lavado

No use SDS con membranas de nitrocelulosa

Agregue 0.1% Tween & reg 20 a la solución de lavado

No agregue SDS a las soluciones de lavado

Para obtener más consejos sobre las mejores prácticas de transferencia occidental NIR, descargue Good Westerns Gone Bad.

Ningún búfer de bloqueo funciona para todos los experimentos de Western blot.

La optimización de las condiciones del búfer de bloqueo garantizará que obtenga los mejores datos de transferencia Western. No asuma que el bloqueador que utilizó la última vez es el adecuado para su experimento actual.


Optimización de un Western Blot

Así que un poco de experiencia, soy un asistente de investigación contratado recientemente, y todavía estoy aprendiendo a través del mundo de la ciencia. Recientemente hubo una charla en mi laboratorio para obtener el iBlot o la configuración de Western blot de transferencia rápida, para que pudiéramos hacer nuestros Westerns súper rápido.

Pero dado que esas conversaciones fracasaron, me preguntaba si alguien tenía algún consejo sobre cómo optimizar un Western Blot para obtener la máxima eficiencia. Los parámetros clave con los que I & # x27m estoy buscando trabajar aquí son:

Reducir el ruido de fondo

Hasta ahora, he experimentado con el bloqueo en leche al 5% y también con la incubación de Ab en leche. En general, eso pareció funcionar mucho mejor que BSA. También tengo curiosidad por saber cuál es el voltaje más alto en el que han ejecutado una transferencia (para una caja de transferencia normal).

También he escuchado rumores sobre secar la membrana de transferencia antes de la incubación y no bloquearla en absoluto. Parecía un poco extraño, pero estoy dispuesto a probarlo.

Todos y cada uno de los consejos serán muy apreciados. ¡Gracias!

No hay nadie que responda a los Western Blots perfectos. Cada combinación de antígeno, anticuerpo y muestras tiene un estado óptimo ligeramente diferente. Dependiendo de su objetivo (cualitativo frente a semicuantitativo, orden de magnitud de las diferencias entre las muestras, etc.), estas diferencias pueden ser relevantes o no. La mayoría de los antígenos peptídicos se pueden detectar decentemente con leche en polvo baja en grasa como solución bloqueante. La mayoría. Hay exenciones. Y, obviamente, la detección de modificaciones (fosforilación, etc.) no se puede realizar con leche en polvo. Francamente, esa es la razón por la que una de cada tres publicaciones en este subreddit se quejan y se quejan de WB: son las pequeñas divas caprichosas de la biología molecular.

Como casi todas las técnicas, realizar una buena inmunotransferencia es un compromiso entre tiempo y calidad. Para mis propósitos, siempre encontré que los geles vertidos a mano funcionan a aproximadamente 180 V para

60 minutos me dieron la mejor resolución frente al tiempo. Estaba buscando cambios de movilidad causados ​​por la fosforilación y la resolución generalmente era bastante acertada. Como ya mencionó r / OpthalmicObsessions, cada combinación de objetivo / anticuerpo / muestras probablemente sea única, por lo que tendrá que pensar un poco sobre el tamaño de su proteína y lo que está buscando.

En cuanto al bloqueo, siempre bloqueamos a temperatura ambiente en leche en polvo desnatada al 5% disuelta en TBS con TWEEN 20 al 0,1%, por lo que nada revolucionario. El bloqueo de 20 minutos pareció funcionar igual de bien. En algún momento seco la membrana y luego la bloqueo hasta un par de semanas después, pero siempre la bloqueo.

La incubación con Ab primario fue siempre durante la noche en BSA al 5% en TBST, a 4 ° C. En general, la forma en que lo veo es que para una buena mancha consistente, puede permitirse pasar unas horas haciendo correr un gel y transfiriéndolo, seguido de un tiempo de bloqueo decente e incubación durante la noche. En última instancia, muchos de los procesos involucrados están limitados por la física, por lo que es casi imposible acelerarlos sin sacrificar al menos algo de calidad. Todas las personas que vi que tomaron atajos o tenían trucos especiales para acelerar el borrado solían producir borrones bastante pobres y tendrían que volver atrás y repetir para la presentación / publicación.

Todo esto es una forma vaga de decir que a veces hacer algo relativamente lento puede ser la forma más eficiente, si eso significa no tener que repetir todo el proceso.


Ver el vídeo: How to use the Anatomic Axis tool in vPOP pro! (Agosto 2022).