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8.16: ATP en sistemas vivos - Biología

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Una célula viva no puede almacenar cantidades significativas de energía libre. ¿Cómo? Funciona de manera similar a una batería recargable.

Cuando el ATP se degrada, normalmente mediante la eliminación de su grupo fosfato terminal, se libera energía. La energía es utilizada para realizar un trabajo por la célula, generalmente mediante la unión del fosfato liberado a otra molécula, activándola. Por ejemplo, en el trabajo mecánico de la contracción muscular, el ATP suministra la energía para mover las proteínas del músculo contráctil. Recuerde el trabajo de transporte activo de la bomba de sodio-potasio en las membranas celulares. El ATP altera la estructura de la proteína integral que funciona como bomba, cambiando su afinidad por el sodio y el potasio. De esta manera, la celda realiza un trabajo, bombeando iones contra sus gradientes electroquímicos.

Estructura y función de ATP

En el corazón del ATP hay una molécula de monofosfato de adenosina (AMP), que está compuesta por una molécula de adenina unida a una molécula de ribosa y a un solo grupo fosfato (Figura 1). La ribosa es un azúcar de cinco carbonos que se encuentra en el ARN y el AMP es uno de los nucleótidos del ARN. La adición de un segundo grupo fosfato a esta molécula central da como resultado la formación de difosfato de adenosina (ADP); la adición de un tercer grupo fosfato forma trifosfato de adenosina (ATP).

La adición de un grupo fosfato a una molécula requiere energía. Los grupos fosfato están cargados negativamente y, por lo tanto, se repelen entre sí cuando están dispuestos en serie, como lo están en ADP y ATP. Esta repulsión hace que las moléculas de ADP y ATP sean inherentemente inestables. La liberación de uno o dos grupos fosfato del ATP, un proceso llamado desfosforilación, libera energía.

Energía de ATP

La hidrólisis es el proceso de romper macromoléculas complejas. Durante la hidrólisis, el agua se divide o se lisa y el átomo de hidrógeno resultante (H+) y un grupo hidroxilo (OH) se agregan a la molécula más grande. La hidrólisis de ATP produce ADP, junto con un ion fosfato inorgánico (PI) y la liberación de energía libre. Para llevar a cabo los procesos de vida, el ATP se descompone continuamente en ADP y, como una batería recargable, el ADP se regenera continuamente en ATP mediante la reinserción de un tercer grupo fosfato. El agua, que se descompuso en su átomo de hidrógeno y grupo hidroxilo durante la hidrólisis del ATP, se regenera cuando se agrega un tercer fosfato a la molécula de ADP, reformando el ATP.

Obviamente, se debe infundir energía en el sistema para regenerar ATP. ¿De dónde viene esta energía? En casi todos los seres vivos de la tierra, la energía proviene del metabolismo de la glucosa. De esta manera, el ATP es un vínculo directo entre el conjunto limitado de vías exergónicas del catabolismo de la glucosa y la multitud de vías endergónicas que alimentan a las células vivas.

Fosforilación

Recuerde que, en algunas reacciones químicas, las enzimas pueden unirse a varios sustratos que reaccionan entre sí en la enzima, formando un complejo intermedio. Un complejo intermedio es una estructura temporal y permite que uno de los sustratos (como el ATP) y los reactivos reaccionen más fácilmente entre sí; en reacciones que involucran ATP, ATP es uno de los sustratos y ADP es un producto. Durante una reacción química endergónica, el ATP forma un complejo intermedio con el sustrato y la enzima en la reacción. Este complejo intermedio permite que el ATP transfiera su tercer grupo fosfato, con su energía, al sustrato, un proceso llamado fosforilación. Fosforilación se refiere a la adición del fosfato (~ P). Esto se ilustra con la siguiente reacción genérica:

A + enzima + ATP → [A - enzima - ~ P] → B + enzima + ADP + ion fosfato

Cuando el complejo intermedio se rompe, la energía se utiliza para modificar el sustrato y convertirlo en un producto de la reacción. La molécula de ADP y un ion fosfato libre se liberan en el medio y están disponibles para su reciclaje a través del metabolismo celular.

Fosforilación del sustrato

El ATP se genera a través de dos mecanismos durante la descomposición de la glucosa. Se generan algunas moléculas de ATP (es decir, se regeneran a partir de ADP) como resultado directo de las reacciones químicas que ocurren en las vías catabólicas. Se elimina un grupo fosfato de un reactivo intermedio en la vía, y la energía libre de la reacción se usa para agregar el tercer fosfato a una molécula de ADP disponible, produciendo ATP (Figura 2). Este método muy directo de fosforilación se llama fosforilación a nivel de sustrato.

Fosforilación oxidativa

La mayor parte del ATP generado durante el catabolismo de la glucosa, sin embargo, se deriva de un proceso mucho más complejo, la quimiosmosis, que tiene lugar en las mitocondrias (Figura 3) dentro de una célula eucariota o la membrana plasmática de una célula procariota.

Quimiosmosis, un proceso de producción de ATP en el metabolismo celular, se utiliza para generar el 90 por ciento del ATP producido durante el catabolismo de la glucosa y también es el método utilizado en las reacciones lumínicas de la fotosíntesis para aprovechar la energía de la luz solar. La producción de ATP mediante el proceso de quimiosmosis se llama fosforilación oxidativa debido a la participación del oxígeno en el proceso.

Intentalo

¿Qué sucede cuando las reacciones críticas de la respiración celular no se desarrollan correctamente? Las enfermedades mitocondriales son trastornos genéticos del metabolismo. Los trastornos mitocondriales pueden surgir de mutaciones en el ADN nuclear o mitocondrial y dan como resultado la producción de menos energía de lo normal en las células del cuerpo. En la diabetes tipo 2, por ejemplo, la eficiencia de oxidación del NADH se reduce, lo que afecta la fosforilación oxidativa pero no los otros pasos de la respiración. Los síntomas de las enfermedades mitocondriales pueden incluir debilidad muscular, falta de coordinación, episodios similares a un accidente cerebrovascular y pérdida de la visión y la audición. La mayoría de las personas afectadas se diagnostican en la infancia, aunque existen algunas enfermedades de inicio en la edad adulta. La identificación y el tratamiento de los trastornos mitocondriales es un campo médico especializado. La preparación educativa para esta profesión requiere una educación universitaria, seguida de una escuela de medicina con especialización en genética médica. Los genetistas médicos pueden ser certificados por la Junta Americana de Genética Médica y luego asociarse con organizaciones profesionales dedicadas al estudio de enfermedades mitocondriales, como la Sociedad de Medicina Mitocondrial y la Sociedad de Enfermedades Metabólicas Heredadas.

Objetivos de aprendizaje

El ATP funciona como moneda de energía para las células. Permite que la célula almacene energía brevemente y la transporte dentro de la célula para soportar reacciones químicas endergónicas. La estructura del ATP es la de un nucleótido de ARN con tres fosfatos unidos. Como el ATP se usa para obtener energía, se desprenden uno o dos grupos fosfato y se produce ADP o AMP. La energía derivada del catabolismo de la glucosa se utiliza para convertir ADP en ATP. Cuando se usa ATP en una reacción, el tercer fosfato se une temporalmente a un sustrato en un proceso llamado fosforilación. Los dos procesos de regeneración de ATP que se utilizan junto con el catabolismo de la glucosa son la fosforilación a nivel de sustrato y la fosforilación oxidativa a través del proceso de quimiosmosis.


Evolución de iones metálicos en sistemas biológicos.

Evolución de iones metálicos en sistemas biológicos. se refiere a la incorporación de iones metálicos en organismos vivos y cómo ha cambiado con el tiempo. Los iones metálicos se han asociado con sistemas biológicos durante miles de millones de años, pero solo en el último siglo los científicos comenzaron a apreciar realmente la escala de su influencia. Los iones de metales principales (hierro, manganeso, magnesio y zinc) y menores (cobre, cobalto, níquel, molibdeno, tungsteno) se han alineado con los organismos vivos a través de la interacción de la meteorización biogeoquímica y las vías metabólicas que involucran los productos de esa meteorización. Los complejos asociados han evolucionado con el tiempo.

El desarrollo natural de sustancias químicas y elementos desafió a los organismos a adaptarse o morir. Los organismos actuales requieren reacciones redox para inducir el metabolismo y otros procesos de la vida. Los metales tienen tendencia a perder electrones y son importantes para las reacciones redox.

Los metales se han vuelto tan importantes para la función celular que la colección de proteínas de unión a metales (denominadas metalomas) representa más del 30% de todas las proteínas de la célula. Se sabe que los metales están involucrados en más del 40% de las reacciones enzimáticas, y las proteínas de unión a metales llevan a cabo al menos un paso en casi todas las vías biológicas. [1]

Los metales también son tóxicos, por lo que se debe adquirir un equilibrio para regular dónde se encuentran los metales en un organismo y en qué cantidades. Muchos organismos tienen sistemas flexibles en los que pueden intercambiar un metal por otro si uno escasea. Los metales en esta discusión son elementos naturales que tienen tendencia a sufrir oxidación. El vanadio, molibdeno, cobalto, cobre, cromo, hierro, manganeso, níquel y zinc se consideran esenciales porque sin ellos la función biológica se ve afectada.


Preguntas:

1. Los investigadores eligieron una concentración de IAA 0,3 mM como concentración de trabajo para cualquier estudio adicional en lugar de 1 mM o 2 mM. ¿Cuál es la probable razón de esto?

A) La menor concentración de IAA dio la mayor respuesta de Na +.

B) Las concentraciones más altas indujeron una citotoxicidad significativa.

C) La solubilidad de IAA no fue lo suficientemente alta.

D) Los investigadores intentaban imitar las condiciones de control lo más fielmente posible.

Respuesta

La respuesta correcta es B) Las concentraciones más altas indujeron una citotoxicidad significativa.

Razón fundamental: Esta pregunta requiere que el examinado aplique sus conocimientos sobre citotoxicidad y lisis celular al diseño de un experimento descrito en el pasaje. En particular, el examinado debe comprender que realizar un experimento en el que el nivel de IAA fuera citotóxico para las células (en comparación con las condiciones de control) no sería deseable para comprender el papel de la glucólisis en el establecimiento de gradientes de concentración de iones, ya que estas células perderían membrana. integridad y someterse a lisis. Por lo tanto, el diseño experimental no debe usar una concentración de IAA que resulte en un aumento significativo de la lisis celular.

2. La información del pasaje sugiere que la glucólisis:

A) es importante para mantener niveles normales de Na + y K + en el músculo esquelético.

B) facilita la permeabilidad de la membrana en el músculo esquelético.

C) impide la función de la ATPasa Na + y K + en el músculo esquelético.

D) está regulado por la ATPasa Na + y K + en el músculo esquelético.

Respuesta

La respuesta correcta es A) es importante para mantener niveles normales de Na + y K + en el músculo esquelético.

Razón fundamental: Esta pregunta requiere que el examinado aplique el conocimiento sobre la glucólisis a los datos experimentales de la Figura 1. En particular, la tendencia en los datos que muestra una concentración creciente de IAA da como resultado una proporción más alta de la concentración de Na + a K + que la observada en la muestra de control debe correlacionarse con el papel de IAA en la alteración de la glucólisis. Esto se ve reforzado por la caída en la producción de lactato que se muestra en la Figura 1 a concentraciones más altas de IAA, porque IAA previene la formación de NADH, que se usa cuando el piruvato se reduce a lactato. La combinación de la función propuesta de IAA y los resultados de la Figura 1 llevan al examinado a la conclusión de que la glucólisis es importante para la Na + K + ATPasa y, por lo tanto, importante para el mantenimiento de la relación de concentración de Na + a K +.

3. Si los efectos del tratamiento con IAA en las células nerviosas son los mismos que los observados en los miocitos, ¿qué característica de un potencial de acción se vería más afectada por el tratamiento con IAA?

A) Inicio de la despolarización

B) Fase ascendente de despolarización

C) Fase de caída a subimpulso

D) Retorno al potencial de reposo

Respuesta

La respuesta correcta es D) Regreso al potencial de reposo

Razón fundamental: Esta pregunta requiere que el examinado recuerde información sobre el papel de la Na + K + ATPasa en la recuperación del potencial de reposo de las células nerviosas después de un potencial de acción. Además, el examinado debe razonar sobre el efecto del tratamiento con IAA basándose en la información presentada en el pasaje y cómo la inhibición de la glucólisis por IAA afectaría la concentración celular de ATP. Con base en estas dos líneas de razonamiento, el examinado puede proponer una hipótesis sobre qué parte de un potencial de acción se vería afectada por el tratamiento con IAA.


Métodos para la detección y obtención de imágenes de ATP

Varios métodos bien establecidos y desarrollados recientemente pueden medir el ATP, aunque hay muchos menos métodos que pueden obtener imágenes de ATP en muestras vivas. Los métodos químicos y físicos que van desde la cromatografía líquida hasta la espectrometría de masas (Khlyntseva et al., 2009) puede ofrecer una especificidad excelente. Por ejemplo, el ATP extracelular se ha medido utilizando microelectrodos de platino recubiertos de enzima (Kueng et al., 2004 Llaudet et al., 2005) o fibras ópticas (Wang et al., 2013). Sin embargo, estos métodos generalmente carecen de resolución espacio-temporal o compatibilidad con especímenes vivos. Los métodos químicos y físicos que implican la desproteinización para medir las concentraciones intracelulares también liberan formas unidas de nucleótidos de adenina (Harris et al., 1973). Este tipo de preparación de muestras da como resultado mediciones de ATP total en lugar de libre, y concentraciones de ADP que pueden sesgar las estimaciones del estado de equilibrio y energía (Veech et al., 1979 Mörikofer-Zwez y Walter, 1989 Tantama et al., 2013). Como alternativa al análisis instrumental, las sondas moleculares específicas para ATP libre ofrecen la oportunidad de realizar análisis en tiempo real, con mayor resolución o compatibilidad con muestras vivas o ambas. Por lo tanto, presentamos ejemplos de métodos de imagen y sin imágenes para detectar ATP con el fin de contrastar sus ventajas.

Se han desarrollado varios enfoques no basados ​​en imágenes para la medición de ATP. Por ejemplo, en un enfoque electrofisiológico, la sensibilidad al ligando de los receptores P2X puede aprovecharse porque, como se ha comentado, son canales catiónicos activados por ATP y, por tanto, producen corrientes dependientes de ATP. Cuando los receptores P2X se expresan en la membrana plasmática de las células PC12 (Praetorius y Leipziger, 2009) o en las células HEK-293 (Hayashi et al., 2004), la electrofisiología de pinza de parche en modo de afuera hacia afuera o de celda completa puede usarse para detectar ATP en las proximidades de la membrana o celda inmovilizada con electrodo. Esta técnica se ha utilizado para estudiar la liberación de ATP de una variedad de células, por ejemplo, Hazama et al. (1998) midieron las concentraciones de ATP liberadas del páncreas β-células en tiempo real midiendo amplitudes de corriente P2X vía abrazadera de parche de células enteras. También utilizando un enfoque electrofisiológico, las mediciones calibradas con nucleótidos de potasio sensible a ATP (KATP) se han empleado corrientes de canal para calcular las concentraciones submembrana de ATP y para probar los gradientes locales en células de riñón de mono COSm6 y en Xenopus ovocitos (Gribble et al., 2000). En un enfoque espectroscópico contrastante, sin imágenes, Vancraenenbroeck y Webb publicaron recientemente un sensor basado en malonil-coenzima A sintetasa, una enzima que sufre un cambio conformacional al unirse al ATP. Dos moléculas de tetrametilrodamina se conjugan con la sintetasa de tal manera que la unión de ATP provoca un aumento sustancial de la intensidad de fluorescencia, con alta selectividad por ATP y sensibilidad micromolar (Vancraenenbroeck y Webb, 2015). Estos y otros métodos que no son de obtención de imágenes proporcionan un medio importante para cuantificar el ATP y, en muchos casos, son ideales para analizar células o extractos con alta sensibilidad y alto rendimiento. Sin embargo, los métodos que no son de imágenes no pueden proporcionar el mismo alto nivel de contenido de información espacial y resuelto en el tiempo que se logra con los métodos de imágenes.

En las últimas décadas se han desarrollado varios métodos de obtención de imágenes de ATP (figura 2) (tabla 1). Si bien el enfoque ideal, en muestras vivas, sería cuantitativo y compatible con la visualización de ATP no invasiva y sin sonda, con alta resolución espacial y temporal, aún no existe un método único que satisfaga estos criterios. Las técnicas de espectroscopia de resonancia magnética que aprovechan la transferencia de magnetización de fósforo pueden cuantificar ATP de forma no invasiva. en vivo, pero consideraciones prácticas, como los largos tiempos de adquisición por vóxel y la disponibilidad limitada de la instrumentación, han restringido su aplicabilidad a la formación de imágenes (Du et al., 2008 Chaumeil et al., 2009 Befroy et al., 2012). En cambio, los métodos de visualización de ATP se basan principalmente en microscopía óptica emparejada con sondas moleculares, que proporcionan lecturas de señales específicas de ATP. Estas sondas moleculares se han desarrollado utilizando una variedad de formatos físicos, desde pequeños indicadores orgánicos hasta nanopartículas, y utilizan mecanismos de detección de ATP tanto directos como indirectos. Figura 2.

Herramientas para la visualización de ATP. (A) La quinacrina es un tinte fluorescente que puede teñir el ATP vesicular. (B) Mant-ATP es un análogo fluorescente. (C) Nanoflare utilizando un aptámero de ATP unido a una nanopartícula de oro. En ausencia de ATP, una hebra competidora que está conjugada con un tinte fluorescente se une al aptámero, pero la fluorescencia se apaga por la proximidad al oro. Cuando el ATP se une, se libera la hebra competidora y se desactiva la fluorescencia. (D) La quimioluminiscencia de luciferasa requiere un sustrato de luciferina y ATP. (E) Los sensores ATeam (Imamura et al., 2009) utilice la F1F0-ATP sintasa ε subunidad como un dominio de unión de ATP unido a un par FRET de proteínas fluorescentes. (F) Los sensores de Perceval utilizan la proteína de la familia PII, GlnK, como un dominio de unión de ATP unido a una proteína fluorescente permutada circularmente. Para (A – D), el sensor o un sustrato debe suministrarse de forma exógena y cargarse en células o tejidos. Para (E) y (F), los sensores están completamente codificados genéticamente.

Ejemplos de herramientas para la visualización de trifosfato de adenosina (ATP)

*. Los sensores intensiométricos muestran un cambio de intensidad sin un cambio drástico en el espectro: para la luminiscencia, se monitorea una única longitud de onda de emisión, y para la fluorescencia, una sola longitud de onda de excitación (λex) y longitud de onda de emisión (λem) par son monitoreados. Las señales intensiométricas no solo dependen del ATP, sino que también pueden verse afectadas por la concentración de colorante, el nivel de expresión y el fotoblanqueo. Las señales radiométricas obtienen dos lecturas que se dividen para proporcionar una respuesta normalizada. Las señales radiométricas son ventajosas porque normalizan la concentración de colorante y el nivel de expresión, y reducen la deriva de la señal del fotoblanqueo.

Fluorescencia de banda A, excitación del cromóforo protonado de la proteína fluorescente Fluorescencia de banda B, excitación de la forma cromóforo desprotonado de la proteína CFP fluorescente, proteína Cy5 fluorescente cian, colorante de cianina YFP, proteína fluorescente amarilla.

El verde de magnesio, por ejemplo, es un fluoróforo orgánico pequeño, sensible al magnesio que se puede usar para detectar indirectamente la hidrólisis de ATP (Leyssens et al., 1996). La mayor parte del ATP intracelular forma complejos con iones de magnesio divalentes; sin embargo, el ADP tiene una afinidad menor por los iones de magnesio que el ATP. Por tanto, la hidrólisis de MgATP provoca un aumento en la concentración de iones de magnesio libre y el consiguiente aumento de la fluorescencia verde de magnesio. Al invocar el equilibrio de unión, el verde de magnesio se ha utilizado en estudios sin imágenes para determinar la tasa de intercambio ATP-ADP a través del transportador de nucleótidos de adenina mitocondrial en mitocondrias aisladas (Chinopoulos et al., 2009) y células permeabilizadas (Kawamata et al., 2010). En un estudio de imágenes utilizando microscopía confocal de fluorescencia y células ciliadas aisladas cargadas con verde de magnesio, Shin et al. (2007) visualizaron indirectamente una mayor contribución de la actividad de la creatina quinasa a la generación de ATP en los mechones de cabello que en su soma. Aunque es sensible a la hidrólisis de ATP, el verde de magnesio tiene la desventaja de una especificidad imperfecta porque tiene una afinidad moderada por el calcio. Por otro lado, el verde de magnesio es más útil que otros indicadores de magnesio porque su fluorescencia se puede excitar con iluminación en rango visible, reduciendo la fototoxicidad en comparación con indicadores como Mag-Fura-2 y Mag-Indo-1, que requieren luz ultravioleta (UV ) excitación. Sin embargo, el verde de magnesio muestra un simple aumento en la intensidad de la fluorescencia al unirse a los iones de magnesio sin un cambio radiométrico en los picos de excitación o emisión. Por lo tanto, a diferencia de las sondas radiométricas, la señal de verde de magnesio también depende de la concentración de tinte, lo que dificulta su uso en estudios cuantitativos. La eficiencia de carga y el fotoblanqueo pueden causar variaciones en la señal que no están relacionadas con cambios en la hidrólisis de ATP (Leyssens et al., 1996).

Para visualizar directamente los grupos de ATP, los análogos fluorescentes se pueden usar como trazadores una vez que se cargan en el tejido, la célula o el orgánulo de interés. Los análogos se pueden sintetizar conjugando grupos fluorescentes tales como un metilantraniloilo (mant) o una cumarina (deac) a los grupos nucleobase, ribosa o fosfato de ATP. Los análogos, mant-ATP y deac-ATP, se han utilizado ampliamente para estudiar las actividades de la quinasa y la adenosina trifosfatasa (ATPasa) en solución (Fili y Toseland, 2014). Por ejemplo, mant-ATP se ha utilizado para controlar la liberación de ATP vesicular de las neuronas dopaminérgicas (Ho et al., 2015), y el deac-ATP fue fundamental en un estudio de la cinética del movimiento de la miosina Va en la actina, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) (Sakamoto et al., 2008). También están disponibles análogos de ATP modificado con tintes fluorescentes Cy3 o BODIPY, que cambian las bandas de excitación al rango visible para reducir la fototoxicidad.

Se han desarrollado análogos de ATP sintéticos adicionales para detectar la hidrólisis de ATP. Estos análogos explotan la transferencia de energía de resonancia tipo Förstertype (FRET) entre un fluoróforo donante unido covalentemente a un γ-grupo fosfato y un fluoróforo aceptor unido a la base o ribosa (Hardt et al., 2013). La escisión del enlace fosfodiéster permite que el donante y el aceptor se difundan entre sí, lo que provoca una pérdida drástica de FRET y un aumento de la fluorescencia del donante. Hacker et al. (2013) han utilizado un análogo de este tipo para controlar el consumo de ATP en tiempo real durante la activación de ubiquitina por UBA1, una enzima E1 humana. De manera similar, un análogo de ATP basado en FRET con el colorante fluoróforo orgánico Sulfo-Cy3 ligado al γ-Fosfato y un extintor ligado a la posición de ribosa C2 fue utilizado por Gutiérrez Acosta et al. (2014) para estudiar la degradación de acetona en extracto celular de Desulfococcus biacutus. Si bien estos análogos de ATP basados ​​en FRET aún no se han utilizado para la formación de imágenes, en principio podrían utilizarse de forma similar a mant-ATP. Es importante reconocer, con estos análogos de ATP, que el grupo de colorante fluorescente puede tener una masa equivalente o mayor que el propio ATP. Por tanto, la modificación covalente podría cambiar el comportamiento del análogo de forma impredecible. Los ensayos funcionales son fundamentales para validar el uso de tales análogos.

También se han informado sensores de moléculas pequeñas para ATP como analito. Por ejemplo, la quinacrina es un derivado de acridina fluorescente que tiñe el ATP unido a péptidos que se encuentra en altas concentraciones en los gránulos intracelulares (Irvin e Irvin, 1954 Bodin y Burnstock, 2001). De esta manera, la quinacrina se ha utilizado para obtener imágenes de la liberación de ATP vesicular en células endoteliales y epiteliales (Bodin y Burnstock, 2001 Feranchak et al., 2010 Akopova et al., 2012). Alternativamente, Pak et al. (2015) desarrollaron un sensor radiométrico basado en imidazolio para ATP con una pinza de excímero de pireno. Cuando el ATP se une a este sensor, forma un sándwich de pireno-adenina-pireno al π-π apilado. La formación del complejo da como resultado un aumento de la emisión de pireno a 375 nm y una disminución de la emisión a 487 nm. Este sensor a base de pireno se utilizó en células HeLa para controlar la disminución de los niveles de ATP tras la adición del inhibidor de la ATP sintasa, oligomicina, y tras la hidrólisis de ATP a ADP por apirasa (Pak et al., 2015).

Los aptámeros son oligonucleótidos de ADN o ARN monocatenarios que pueden modificarse fácilmente para lograr una alta afinidad y especificidad por sus objetivos. Los aptámeros se utilizan ampliamente para estudiar metabolitos de moléculas pequeñas (Paige et al., 2012 Feng et al., 2014), y se analizan mediante una variedad de métodos, como la espectroscopia de fluorescencia (Sun et al., 2010 Parque et al., 2015b Wang et al., 2015 Canción et al., 2016), electroquímica (Mukherjee et al., 2015 Zhao et al., 2015), resonancia de plasmón superficial (Park et al., 2015a) y colorimetría (Huo et al., 2016). Los aptámeros pueden diseñarse para detectar ATP en los rangos nanomolar a milimolar; sin embargo, los problemas de degradación y permeabilidad celular limitan su uso en la obtención de imágenes de células vivas (Wang et al., 2014). Para superar este problema, se han utilizado nanopartículas para liberar y proteger aptámeros de la degradación por DNasas y RNasas en las células mientras se modifican sus propiedades fluorescentes. Por ejemplo, Qiang et al. (2015) informaron sobre un híbrido de aptámero unido a nanoesferas de polidopamina que protege al aptámero y apaga su fluorescencia. La adición de ATP libera el aptámero, lo que produce un aumento de la fluorescencia. El aptámero es muy selectivo y sensible y detecta ATP en el rango de 0,01 a 2 mmol l -1. Los cambios en la concentración de ATP podrían medirse en células HeLa tras el tratamiento con oligomicina o Ca 2+. Del mismo modo, se han utilizado nanopartículas para construir nanoflares (Zheng et al., 2009) para obtener imágenes de ATP. Los aptámeros unidos a las nanopartículas de oro se hibridan con cadenas de ADN fluorescentes que se apagan por la proximidad a la nanopartícula. La unión de ATP a los aptámeros libera las hebras fluorescentes y el aumento de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar ATP en células vivas (Zheng et al., 2009 Torabi y Lu, 2014). Un inconveniente de estos biosensores es que los aptámeros se han diseñado para la selectividad de la adenina, lo que puede dificultar la distinción entre derivados de adenina (Özalp et al., 2010). Para superar esta desventaja, Sassanfar y Szostak (1993) sintetizaron aptámeros de ARN específicos de ATP, y Özalp et al. (2010) desarrollaron aptámeros de ADN selectivos para ATP (K aparenteD: 3,2 mmol l −1) y (ADP aparente KD: 4,4 mmol l -1).

Si bien tanto los indicadores orgánicos pequeños como los biosensores basados ​​en aptámeros han encontrado utilidad en los estudios de imágenes, representan un desafío para la preparación de muestras porque requieren la penetración celular o la carga celular del reactivo exógeno. En sistemas de modelos simples, como los cultivos celulares de monocapa, la introducción de estos reactivos de formación de imágenes de ATP se puede lograr típicamente mediante incubaciones sostenidas, electroporación o microinyección. Sin embargo, estos requisitos preparatorios limitan su aplicación en muchos tipos de células y tejidos complejos o gruesos. A diferencia de estas tecnologías, los indicadores codificados genéticamente son reactivos basados ​​en proteínas que están codificados en parte o en su totalidad por una secuencia genética apropiada. Por tanto, los reactivos de formación de imágenes codificados genéticamente ofrecen compatibilidad con una amplia variedad de muestras cuando está disponible el método de expresión o transferencia génica apropiado, como reactivos de transfección, transducción viral y expresión específica de tejido en ratones transgénicos. Ejemplos recientes de reactivos de formación de imágenes de ATP codificados genéticamente han utilizado luciferasas y proteínas fluorescentes.

Las luciferasas se utilizan para producir bioluminiscencia con el fin de visualizar las actividades celulares y rastrear las poblaciones celulares. en vivo. La luciferasa de luciérnaga y su sustrato suministrado de forma exógena, la luciferina, se pueden usar para medir el ATP porque la reacción quimioluminiscente es dependiente de ATP. La adenilación de luciferina por luciferasa activa el sustrato para la conversión en oxiluciferina y, por lo tanto, la luminiscencia resultante es proporcional a la concentración de ATP (Manfredi et al., 2002 Lundin, 2014). Los esfuerzos comerciales y académicos actuales han producido una variedad de luciferasas que se han diseñado y optimizado con codones de diferentes especies para obtener imágenes de bioluminiscencia en muestras vivas (Thorne et al., 2010 Salón et al., 2012). Pero las luciferasas de luciérnagas y escarabajos dependientes de ATP se utilizan con mayor frecuencia para medir el ATP (Manfredi et al., 2002 Lundin, 2014). Branchini et al. (2015) han desarrollado una luciferasa con mayor actividad y rendimiento cuántico fusionando el dominio N-terminal de la Photinus pyralis luciferasa unida al dominio C-terminal de la Luciola italica luciferasa. La luciferasa quimérica se optimizó aún más para mostrar una sensibilidad tres veces mayor en células vivas que la variante comercial Luc2 (Branchini et al., 2015). La mutagénesis también ha producido variantes de luciferasa con luminiscencia desplazada al rojo (Branchini et al., 2010). Si bien estas variantes de emisión exhiben típicamente rendimientos de luminiscencia más bajos, ofrecen la ventaja de una menor absorbancia tisular de luminiscencia roja, lo que las convierte en buenos reporteros para en vivo imagen (Liang et al., 2012). Hay advertencias importantes para la cuantificación de ATP por luciferasa. Por ejemplo, la optimización es fundamental debido a la dependencia inherente de la concentración de oxígeno y la complicación a menudo subestimada de la inhibición del producto, así como la inhibición por factores celulares o agentes farmacológicos (Leitão y Esteves da Silva, 2010 Lundin, 2014).

A pesar de sus dificultades con la cuantificación absoluta, la luciferasa se ha utilizado para controlar los cambios de ATP en una variedad de células, como las células HEK-293, los cardiomiocitos y las neuronas (Brovko, 2010). campana et al. (2007) usaron luciferasa de tipo salvaje dentro de la célula para monitorear las diferencias en las respuestas de ATP intracelular en las mitocondrias y el citosol de los cardiomiocitos después de la estimulación. La luciferasa libre citosólica y unida a membrana también se ha utilizado para estudiar la posibilidad de compartimentación del ATP submembrana y el control de KATP actividad del canal en páncreas β-células y neuronas hipotalámicas (Kennedy et al., 1999 Ainscow et al., 2002). En la detección de ATP intracelular, la luciferasa se introduce en células de mamíferos mediante transfección de genes, microinyección o vectores virales, sin embargo, Lee et al. (2012) desarrollaron luciferasa fusionada a un dominio de transducción de proteínas para facilitar el transporte directo de la proteína luciferasa al interior de la célula. Incluso con codificación genética, el sustrato de luciferina exógeno debe suministrarse y debe penetrar en los tejidos y las células. Si bien se ha demostrado que esto se puede lograr en células vivas y animales, todavía existe la posibilidad de acceso variable al sustrato y toxicidad específica del tipo de célula que deben tenerse en cuenta (Rangaraju et al., 2014). En la detección de ATP extracelular, la luciferasa también se ha utilizado para estudiar la liberación de ATP uniendo la enzima a la cara extracelular de la membrana plasmática. vía conjugación con anticuerpos primarios de inmunoglobulina G (IgG) que pueden unirse a antígenos de superficie vía etiquetas de estreptavidina-biotina y vía Anclajes lipídicos de glucofosfatidilinositol (GPI) (pmeLuc) (Praetorius y Leipziger, 2009). Por ejemplo, las células HEK-293 que se transfectaron de manera estable con pmeLuc detectaron niveles micromolares de ATP en el microambiente tumoral, mientras que el ATP extracelular era indetectable en tejidos sanos (Pellegatti et al., 2008). El sistema luciferasa-luciferina puede ofrecer un método de bajo fondo y baja toxicidad para monitorear el ATP; sin embargo, la baja luminiscencia limita su aplicabilidad en la obtención de imágenes de ATP en tiempo real. Las imágenes de bioluminiscencia generalmente requieren largos tiempos de exposición, lo que limita la resolución espacio-temporal en algunas aplicaciones, puede requerir equipo especializado (Bell et al., 2007 Brovko, 2010). Por ejemplo, Furuya et al. (2014) mejoraron la resolución temporal a 100 ms mediante el uso de una cámara con dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) refrigerada junto con un intensificador de imagen para compensar las bajas tasas de emisión de fotones. Lo usaron junto con objetivos de alta apertura numérica de bajo aumento para monitorear la liberación de ATP de una sola celda con una sensibilidad de detección de 10 nmol l -1. Además, la interferencia de la matriz de la muestra puede ocurrir debido a los niveles inhibidores de varios aniones y sales, inhibidores de los canales iónicos y antagonistas del receptor P2 (Praetorius y Leipziger, 2009).

Una alternativa a la detección basada en luciferasa es el uso de sensores de ATP basados ​​en proteínas fluorescentes. Los sensores fluorescentes basados ​​en proteínas no requieren la adición de un sustrato de luciferina exógeno y ofrecen facilidad de manipulación a nivel de ADN y la consiguiente facilidad de expresión en células y en vivo. Por ejemplo, como alternativa al enfoque electrofisiológico (Gribble et al., 2000), los cambios en el nivel de ATP en las células HEK-293 se han visualizado mediante imágenes del cambio conformacional dependiente de ATP de KATP canales fusionados a un par FRET de proteína fluorescente amarillo y cian ECFP-EYFP (Tsuboi et al., 2004). Imamura et al. (2009) desarrollaron una familia de sensores denominados "ATeams", que también se basan en la transferencia de energía de resonancia de tipo Förster (FRET) entre una proteína fluorescente donante y una proteína fluorescente aceptora. En los ATeams originales, el ε subunidad de la F0F1-ATP sintasa está ligada al par CFP e YFP FRET. los ε La subunidad es una subunidad de proteína de 14 kDa que se compone de un barril beta N-terminal y dos hélices C-terminales. Sufre un gran cambio conformacional al unirse al ATP, que es el mecanismo por el cual el ε regula F0F1 Actividad de ATPasa basada en niveles de ATP intracelular. Los sensores ATeam exhiben constantes de disociación aparente, que van desde 7,4 µmol l -1 a 3,3 mmol l -1, con al menos 10 a 100 veces mayor selectividad para ATP sobre ADP, y cinética de respuesta en la escala de tiempo de segundos.

Los sensores ATeam se han utilizado para estudiar los cambios de ATP en células bacterianas, neuronas y varios tipos de células diferentes en diferentes especies (Imamura et al., 2009 Toloe et al., 2014). En organismos unicelulares, Maglica et al. (2015) utilizaron sensores ATeam para monitorear la muerte celular inducida por antibióticos mediante el seguimiento de una sola célula de los niveles de ATP en Mycobacterium smegmatis, demostrando su potencial como una tecnología importante en el descubrimiento de fármacos para la detección de antibióticos y los ensayos de imágenes del mecanismo de acción. En organismos multicelulares, Ozawa et al. (2015) encontraron que la producción de ATP dependiente de la glucólisis era necesaria para la formación de lamelipodios en los podocitos. Por el contrario, la región subcelular cortical de los podocitos produce ATP tanto por glucólisis como por fosforilación oxidativa en las mitocondrias. Estos estudios metabólicos demuestran cómo los sensores ATeam pueden proporcionar información importante sobre la biología de las células de podocitos, lo que podría hacer avanzar nuestra comprensión del papel de la disfunción metabólica en las enfermedades renales crónicas (Ozawa et al., 2015).

Cuando se obtienen imágenes de sensores de ATP fluorescentes que se excitan y emiten en el rango espectral de 400 a 500 nm, es importante considerar los cambios dependientes del metabolismo en el fondo de autofluorescencia. Por ejemplo, la autofluorescencia de flavinas, como el dinucleótido de flavina y adenina (FAD), se ha utilizado durante mucho tiempo para visualizar cambios metabólicos en muestras vivas y se sigue utilizando como una opción de "imagen sin etiquetas" (Quinn et al., 2013 Jahn et al., 2015). Este fondo podría complicar las señales fluorescentes cuando los sensores se utilizan a niveles de expresión bajos, pero a una expresión moderada del sensor esto es menos probable debido al coeficiente de extinción más bajo (∼10,000 mol l -1 cm -1) y el rendimiento cuántico de fluorescencia (& lt 0.01 a 0,06) de FAD (Valle et al., 2012). Para mitigar los problemas de superposición espectral con autofluorescencia FAD y generar diversidad espectral para imágenes multisensor, Nakano et al. (2011) reemplazó el CFP y el YFP en los sensores ATeam originales con un par FRET diferente. Utilizaron verde (GFP cp173-mEGFP) y naranja (OFP mKOκ) proteínas fluorescentes para generar un ATeam desplazado al rojo denominado GO-ATeam. Esto les permitió obtener imágenes de cambios en el nivel de Ca 2+, utilizando sensores de Ca 2+ que se excitan con iluminación UV, simultáneamente con los niveles de ATP en las células HeLa. GO-ATeam también es más estable a la acidificación, una ventaja importante porque el estrés metabólico puede causar una disminución del pH intracelular (Nakano et al., 2011). Posteriormente, Rueda et al. (2015) utilizaron GO-ATeam para obtener imágenes del agotamiento de ATP en presencia y ausencia de Ca 2+ tras la exposición a NMDA en neuronas.

Zadran et al. (2013) desarrollaron un sensor de ATP, utilizando un tipo particular de par de proteínas fluorescentes FRET que pueden exhibir una mayor fluorescencia del aceptor. En su enfoque, una variante mutada del ε subunidad de Bacillus subtilis F0F1-La ATP sintasa está acoplada a GFP e YFP. Tanto GFP como YFP se excitan en la misma longitud de onda, y la unión de ATP da como resultado una señal de fluorescencia mejorada del aceptor de YFP como resultado del aumento de FRET. Se demostró que el sensor de Zadran detecta tan solo 10 nmol l-1 ATP con alta especificidad (Zadran et al., 2013). Posteriormente, este sensor se utilizó para monitorear el flujo de ATP en tumores y durante la transición al comportamiento metastásico (Zadran et al., 2014).

Yaginuma et al. (2014) desarrollaron recientemente la familia de sensores QUEEN (evaluador cuantitativo de energía celular), que están relacionados con los sensores ATeam pero con una arquitectura diferente, que utiliza una proteína fluorescente permutada circularmente (cpFP). En la arquitectura QUEEN, se inserta un cpFP entre dos α hélices de la F0F1-ATP sintasa ε subunidad con enlazadores. Se diseñaron dos variantes con afinidades aparentes de 7 µmol l −1 y 2 mmol l −1, llamado REINA-7µ y QUEEN-2m, respectivamente (Yaginuma et al., 2014). Usando estos sensores, cuantificaron la distribución de ATP en individuos E. coli células.

Usando una estrategia de permutación circular, Tantama et al. (2013) informaron de un sensor de relación ATP-ADP, PercevalHR, que es una versión mejorada del Perceval original (Berg et al., 2009). La proteína de la familia PII, GlnK1, que puede unirse a MgATP y ADP con alta afinidad, se modificó con una inserción de cpFP dentro de un bucle en el sitio de unión de nucleótidos. La unión de MgATP provoca un cambio conformacional que altera el entorno cromóforo de la cpFP. Como resultado de la ingeniería de proteínas, el sensor tiene dos picos en sus espectros de excitación, a aproximadamente 420 nm y 500 nm. La unión de MgATP aumenta la intensidad de la fluorescencia con una excitación de 500 nm, mientras que la unión de ADP aumenta la intensidad de la fluorescencia con una excitación de 420 nm. Estas características espectrales dependientes de nucleótidos permiten obtener imágenes radiométricas de excitación, lo que ofrece la ventaja significativa de la independencia de la concentración que normaliza la señal para la expresión de proteínas y reduce los artefactos del fotoblanqueo. Las rápidas tasas de asociación y disociación, así como el alto rango dinámico del sensor en rangos de proporción de ATP a ADP fisiológicamente relevantes, hacen que PercevalHR sea útil para estudiar el metabolismo energético en las células (Tantama et al., 2013). Aunque los sensores de Perceval exhiben cierta sensibilidad al pH, la respuesta de ATP se puede desconvolucionar de los cambios en el pH de la muestra, utilizando un sensor de pH y una calibración experimental (Tantama et al., 2011 Tantama y Yellen, 2014). Usando Perceval para medir las proporciones de ATP a ADP en neuronas, Zala et al. (2013) mostraron que el tráfico mitocondrial depende del ATP mitocondrial pero no de la glucólisis. Con PercevalHR, Rueda et al. (2015) estudiaron las disminuciones dependientes de la estimulación de NMDA en la proporción de ATP a ADP en neuronas deficientes en el intercambiador de fosfato MgATP mitocondrial dependiente de calcio SCaMC-3.

Finally, luciferase and fluorescent protein technologies have been combined in ATP sensors that exploit bioluminescence resonance energy transfer (BRET). These BRET sensors have been developed to improve brightness and red-shifted, luciferase-based imaging (Chu et al., 2016). Saito et al. (2012) developed an ATP sensor, Nano-lantern (ATP1), in which a split Renilla luciferase (Rluc8) was modified with the ε subunit of the F0F1-ATP synthase and Venus. ATP binding results in complementation and reconstitution of the active Rluc8, which can efficiently transfer energy to Venus. It has an apparent ATP affinity of 0.3 mmol l −1 and is useful for imaging in tissues with high autofluorescence. Conveniently, Rluc8 does not consume any ATP in its chemiluminescent reaction, simplifying the detection mechanism and interpretation. Using this sensor, Saito et al. (2012) visualized ATP increases in the mesophyll of leaf cells after light irradiation. Borghei and Hall (2014) used firefly luciferase to develop a red-shifted ATP sensor. They generated a fusion protein with firefly luciferase (X5) and the fluorescent protein, mCherry. Although the low quantum yield of mCherry (0.22) results in a weak signal, they detected an ATP-dependent increase in emission at 600 nm by mCherry (Borghei and Hall, 2014). Presumably, replacement of mCherry with a brighter red fluorescent protein would improve signal strength. Importantly, Rangaraju et al. (2014) used a synaptically targeted, engineered luciferase-mCherry sensor (Syn-ATP) to achieve ratiometric measurements of activity-dependent ATP consumption and production, although the Syn-ATP ratiometric signal was not obtained through BRET.

A wide variety of ATP detection and imaging reagents that can be used to visualize both intracellular energy metabolism and extracellular purinergic signaling are available. The choice of technologies depends on the biological process under study, the specimen format, and any limitation of the imaging instrumentation. While we have presented several examples, it is beyond the scope of this review to evaluate all detection and imaging technologies here, and other examples have been reviewed elsewhere (Khlynsteva et al., 2009 and Praetorius and Leipziger, 2009).


8.16: ATP in Living Systems - Biology

Energy Flow in Living Systems

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Metabolism is a term applied to the total of all chemical reactions found in living systems. It has two parts: (1) catabolism which are the reactions that break molecules down in to smaller molecules and (2) anabolism by which larger molecules are constructed.

Catabolism usually yields chemical energy and anabolism usually requires chemical energy. In almost all living things, chemical energy is stored in the form of a molecule called ATP (Adenosine Tri-Phosphate). ATP can be converted in to ADP (adenosine di-phosphate) with the loss of a phosphate group and the release of stored chemical energy. When a cell has an excess of energy, the ADP can be converted back in to ATP storing this energy.

In most cells, ATP is generated in the following way:

Glucose + oxygen <--> carbon dioxide + water + energy in the form of ATP

Moving from left to right, this process is known as cellular respiration, and moving from right to left, it is known as photosynthesis. The energy to make ATP needed in photosynthesis ultimately comes from light energy.

Cellular respiration takes place in numerous individual steps but overall occurs in two discrete sets of reactions: (1) glycolysis and (2) the citric acid cycle (or also called the Kreb's cycle).

In glycolysis, glucose is converted into an intermediary molecule called pyruvic acid. No oxygen is needed in this conversion. Glycolysis is a primitive set of reactions used in both pro- and eukaryotes. In most cells, only a net of 2 ATP molecules are created per glucose molecule. The reactions involved in glycolysis are found in the cytoplasm.

The citric acid cycle follows glycolysis and takes the pyruvic acid and completes the conversion to carbon dioxide and water. This set of reactions does require the presence of oxygen and takes place within the mitochondria. In most cells, 24 additional ATP molecules are created.

When eukaryotic cells are deprived of oxygen, the citric acid cycle shuts down and there is a buildup of pyruvic acid. One good example is during wine making when grape juice, sugar and yeast are placed in a bottle closed with a cork. No oxygen can get in, and therefore, pyruvic acid begins to build up. But pyruvic acid is toxic in high concentrations and the yeast will convert it in to ethanol (drinking alcohol) in a process known as fermentation.

Another example is when humans exercise vigorously and get muscle cramps. Here, the blood is unable to provide enough oxygen to the exercising muscles and pyruvic acid starts to build up. In an attempt to avoid a toxic build up, the muscles convert the pyruvic acid in to lactic acid which causes the cramping. When the person rests, the oxygen deficit is eliminated and the lactic acid is back converted in to pyruvic acid which then enters the citric acid cycle as normal.

Each step in metabolism is controlled by a special class of functional proteins called enzymes.

Enzyme modified reactions follow the following general reaction:

E + S <--> [E-S] <--> EP + E where E=enzyme S=substrate and EP=end product

This reaction tells us that the enzyme binds with the substrate (starting product) to form an enzyme-substrate complex. After that, the substrate is converted to end product and the enzyme is returned intact. The enzyme participates in the reaction but is not used up in the reaction.

Therefore, the first step in any enzyme modified reaction is an energetically meaningful collision between the enzyme molecule and the substrate molecule. By energetically meaningful, we mean that the collision must be strong enough (but not too strong) to allow temporary attachment. If the temperature of the reaction is too cold or too hot, the substrate will not attach.

There is usually a specific enzyme for each step in metabolism. This is because there is a special binding site on the 3D structure of each enzyme called the active site. It is here that the substrate temporarily attaches. The size, shape and chemical nature of the substrate molecule must allow a good fit to the active site for attachment to occur. Because of this specificity requirement, the binding of the substrate molecule to the active site is thought to be analogous to the specificity of a key to a lock and gives rise to the "lock and key" model of enzyme action. Some enzymes can act as "master keys" such as lipase which can break down a large number of different fat molecules but only fats.

Once the enzyme binds to the substrate forming the E-S complex (or sometimes called the activation complex), there is conversion of the substrate in to end product. The E-S complex then is that hypothetical point in time when the conversion begins to take place. Since the substrate no longer exists, the enzyme is freed to go back and collide with some other substrate molecule in the reaction mix.

Enzymes are able to moderate the conditions of chemical reactions so that they can occur in living systems without disputing the cells. For instance, glucose (table sugar) can be converted to carbon dioxide and water simply by heating it in a pot till it catches on fire. But clearly, such a large release of energy and the conditions of reaction would kill any living cell.

When the enzyme binds to the substrate, it many times will change the shape of the substrate molecule putting stress on internal chemical bonds. In doing so, it allows the reaction of, for instance, breaking a chemical bond, to take place under lower energy requirements. Another way of saying this is that the enzyme lowers the required activation energy. This is the basis for the "induced fit" model of enzyme action.

Finally, "The Golden Rule" of enzyme activity says that anything that changes an enzyme's shape will influence its ability to catalyze a reaction. Such factors would include heat, pH, salt, etc.


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Modulation of cell motility by spatial repositioning of enzymatic ATP/ADP exchange capacity

ATP is the "principal energy currency" in metabolism and the most versatile small molecular regulator of cellular activities. Although already much is known about the role of ATP in fundamental processes of living systems, data about its compartmentalization are rather scarce, and we still have only very limited understanding of whether patterns in the distribution of intracellular ATP concentration ("ATP inhomogeneity") do exist and have a regulatory role. Here we report on the analysis of coupling of local ATP supply to regulation of actomyosin behavior, a widespread and dynamic process with conspicuous high ATP dependence, which is central to cell shape changes and cell motility. As an experimental model, we use embryonic fibroblasts from knock-out mice without major ATP-ADP exchange enzymes, in which we (re)introduce the ATP/ADP exchange enzyme adenylate kinase-1 (AK1) and deliberately manipulate its spatial positioning by coupling to different artificial location tags. By transfection-complementation of AK1 variants and comparison with yellow fluorescent protein controls, we found that motility and spreading were enhanced in cells with AK1 with a focal contact guidance tag. Intermediary enhancement was observed in cells with membrane-targeted or cytosolic AK1. Use of a heterodimer-inducing approach for transient translocation of AK1 to focal contacts under conditions of constant global AK1 activity in the cell corroborated these results. Based on our findings with these model systems, we propose that local ATP supply in the cell periphery and "on site" fuelling of the actomyosin machinery, when maintained via enzymes involved in phosphoryl transfer, are codetermining factors in the control of cell motility.


39 Regulation of Cellular Respiration

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Describe how feedback inhibition would affect the production of an intermediate or product in a pathway
  • Identify the mechanism that controls the rate of the transport of electrons through the electron transport chain

Respiración celular must be regulated in order to provide balanced amounts of energy in the form of ATP. The cell also must generate a number of intermediate compounds that are used in the anabolism and catabolism of macromolecules. Without controls, metabolic reactions would quickly come to a standstill as the forward and backward reactions reached a state of equilibrium. Resources would be used inappropriately. A cell does not need the maximum amount of ATP that it can make all the time: At times, the cell needs to shunt some of the intermediates to pathways for amino acid, protein, glycogen, lipid, and nucleic acid production. In short, the cell needs to control its metabolism.

Regulatory Mechanisms

A variety of mechanisms is used to control cellular respiration. Some type of control exists at each stage of glucose metabolism. Access of glucose to the cell can be regulated using the GLUT (glucose transporter) proteins that transport glucose ((Figure)). Different forms of the GLUT protein control passage of glucose into the cells of specific tissues.


Some reactions are controlled by having two different enzymes—one each for the two directions of a reversible reaction. Reactions that are catalyzed by only one enzyme can go to equilibrium, stalling the reaction. In contrast, if two different enzymes (each specific for a given direction) are necessary for a reversible reaction, the opportunity to control the rate of the reaction increases, and equilibrium is not reached.

A number of enzymes involved in each of the pathways—in particular, the enzyme catalyzing the first committed reaction of the pathway—are controlled by attachment of a molecule to an allosteric site on the protein. The molecules most commonly used in this capacity are the nucleotides ATP, ADP, AMP, NAD + , and NADH. These regulators—allosteric effectors—may increase or decrease enzyme activity, depending on the prevailing conditions. The allosteric effector alters the steric structure of the enzyme, usually affecting the configuration of the active site. This alteration of the protein’s (the enzyme’s) structure either increases or decreases its affinity for its substrate, with the effect of increasing or decreasing the rate of the reaction. The attachment signals to the enzyme. This binding can increase or decrease the enzyme’s activity, providing a feedback mechanism. This feedback type of control is effective as long as the chemical affecting it is attached to the enzyme. Once the overall concentration of the chemical decreases, it will diffuse away from the protein, and the control is relaxed.

Control of Catabolic Pathways

Enzymes, proteins, electron carriers, and pumps that play roles in glycolysis, the citric acid cycle, and the electron transport chain tend to catalyze nonreversible reactions. In other words, if the initial reaction takes place, the pathway is committed to proceeding with the remaining reactions. Whether a particular enzyme activity is released depends upon the energy needs of the cell (as reflected by the levels of ATP, ADP, and AMP).

Glucólisis

The control of glycolysis begins with the first enzyme in the pathway, hexokinase ((Figure)). This enzyme catalyzes the phosphorylation of glucose, which helps to prepare the compound for cleavage in a later step. The presence of the negatively charged phosphate in the molecule also prevents the sugar from leaving the cell. When hexokinase is inhibited, glucose diffuses out of the cell and does not become a substrate for the respiration pathways in that tissue. The product of the hexokinase reaction is glucose-6-phosphate, which accumulates when a later enzyme, phosphofructokinase, is inhibited.


Phosphofructokinase is the main enzyme controlled in glycolysis. High levels of ATP or citrate or a lower, more acidic pH decreases the enzyme’s activity. An increase in citrate concentration can occur because of a blockage in the citric acid cycle. Fermentation, with its production of organic acids such as lactic acid, frequently accounts for the increased acidity in a cell however, the products of fermentation do not typically accumulate in cells.

The last step in glycolysis is catalyzed by pyruvate kinase. The pyruvate produced can proceed to be catabolized or converted into the amino acid alanine. If no more energy is needed and alanine is in adequate supply, the enzyme is inhibited. The enzyme’s activity is increased when fructose-1,6-bisphosphate levels increase. (Recall that fructose-1,6-bisphosphate is an intermediate in the first half of glycolysis.) The regulation of pyruvate kinase involves phosphorylation by a kinase (pyruvate kinase), resulting in a less-active enzyme. Dephosphorylation by a phosphatase reactivates it. Pyruvate kinase is also regulated by ATP (a negative allosteric effect).

If more energy is needed, more pyruvate will be converted into acetyl CoA through the action of pyruvate dehydrogenase. If either acetyl groups or NADH accumulates, there is less need for the reaction, and the rate decreases. Pyruvate dehydrogenase is also regulated by phosphorylation: a kinase phosphorylates it to form an inactive enzyme, and a phosphatase reactivates it. The kinase and the phosphatase are also regulated.

Ciclo del ácido cítrico

The citric acid cycle is controlled through the enzymes that catalyze the reactions that make the first two molecules of NADH ((Figure)). These enzymes are isocitrate dehydrogenase and α-ketoglutarate dehydrogenase. When adequate ATP and NADH levels are available, the rates of these reactions decrease. When more ATP is needed, as reflected in rising ADP levels, the rate increases. Alpha-ketoglutarate dehydrogenase will also be affected by the levels of succinyl CoA—a subsequent intermediate in the cycle—causing a decrease in activity. A decrease in the rate of operation of the pathway at this point is not necessarily negative, as the increased levels of the α-ketoglutarate not used by the citric acid cycle can be used by the cell for amino acid (glutamate) synthesis.

Cadena de transporte de electrones

Specific enzymes of the electron transport chain are unaffected by feedback inhibition, but the rate of electron transport through the pathway is affected by the levels of ADP and ATP. Greater ATP consumption by a cell is indicated by a buildup of ADP. As ATP usage decreases, the concentration of ADP decreases, and now, ATP begins to build up in the cell. This change in the relative concentration of ADP to ATP triggers the cell to slow down the electron transport chain.

Visit this site to see an animation of the electron transport chain and ATP synthesis.

For a summary of feedback controls in cellular respiration, see (Figure).

Summary of Feedback Controls in Cellular Respiration
Ruta Enzyme affected Elevated levels of effector Effect on pathway activity
glucólisis hexokinase glucose-6-phosphate disminución
phosphofructokinase low-energy charge (ATP, AMP), fructose-6-phosphate via fructose-2,6-bisphosphate incrementar
high-energy charge (ATP, AMP), citrate, acidic pH disminución
pyruvate kinase fructose-1,6-bisphosphate incrementar
high-energy charge (ATP, AMP), alanine disminución
pyruvate to acetyl CoA conversion piruvato deshidrogenasa ADP, pyruvate incrementar
acetyl CoA, ATP, NADH disminución
ciclo del ácido cítrico isocitrate dehydrogenase ADP incrementar
ATP, NADH disminución
α-ketoglutarate dehydrogenase calcium ions, ADP incrementar
ATP, NADH, succinyl CoA disminución
cadena de transporte de electrones ADP incrementar
ATP disminución

Resumen de la sección

Cellular respiration is controlled by a variety of means. The entry of glucose into a cell is controlled by the transport proteins that aid glucose passage through the cell membrane. Most of the control of the respiration processes is accomplished through the control of specific enzymes in the pathways. This is a type of negative feedback mechanism, turning the enzymes off. The enzymes respond most often to the levels of the available nucleosides ATP, ADP, AMP, NAD + , and FAD. Other intermediates of the pathway also affect certain enzymes in the systems.

Preguntas de revisión

The effect of high levels of ADP is to ________ in cellular respiration.

  1. increase the activity of specific enzymes
  2. decrease the activity of specific enzymes
  3. have no effect on the activity of specific enzymes
  4. slow down the pathway

The control of which enzyme exerts the most control on glycolysis?

Preguntas de pensamiento crítico

How does citrate from the citric acid cycle affect glycolysis?

Citrate can inhibit phosphofructokinase by feedback regulation.

Why might negative feedback mechanisms be more common than positive feedback mechanisms in living cells?

Negative feedback mechanisms actually control a process it can turn it off, whereas positive feedback accelerates the process, allowing the cell no control over it. Negative feedback naturally maintains homeostasis, whereas positive feedback drives the system away from equilibrium.

Glossary



Comentarios:

  1. Cetewind

    Encuentro que no tienes razón. Puedo probarlo. Escribe en PM, nos comunicaremos.

  2. Tedrick

    ¡Feliz año nuevo a todos los visitantes de vokzal.biz.ua! :)

  3. Forrest

    Gracias. Información muy útil

  4. Kill

    Pido disculpas, pero ¿podrías dar más información?

  5. Rhys

    Creo que estás equivocado. Puedo defender la posición. Escríbeme en PM, discutiremos.

  6. Meztikree

    Apoyo limpiamente, pero no hay nada más que decir.

  7. Kaidan

    Esto no más que condicionalidad

  8. Earle

    How do you order to understand?



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