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Proteasas en la sangre

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Estoy leyendo sobre hormonas y el libro habla sobre cómo las hormonas peptídicas o amínicas se descomponen fácilmente por las proteasas presentes en el plasma sanguíneo. Esto me ha llevado a cuestionar las interacciones entre estas proteasas y las proteínas sanguíneas de la sangre (como las albúminas y globulinas). ¿Tener proteasas en la sangre significa que las proteínas de la sangre se descomponen constantemente? Entonces, ¿cómo se hacen las proteínas de la sangre? ¿Y de qué sirven las proteínas de unión para proteger las hormonas durante el tránsito vascular cuando las proteínas de unión también son susceptibles a las proteasas de la sangre?

Editar: Me han pedido que proporcione algunas citas y referencias.

Debido a que las hormonas solubles en agua pueden disolverse en la sangre, muchas circulan como hormonas libres, lo que significa que la mayoría de ellas se disuelven directamente en la sangre y se entregan al tejido diana sin unirse a una proteína de unión.

El libro continúa diciendo

Las hormonas solubles en agua, como proteínas, péptidos y derivados de aminoácidos, tienen semividas relativamente cortas porque son degradadas rápidamente por enzimas, llamadas proteasas, dentro del torrente sanguíneo. Luego, los riñones eliminan los productos de degradación de hormonas de la sangre.

Estas citas eran de Anatomía y fisiología de Seeley, Décima edición.


Plaquetas y proteasas

Las plaquetas circulantes son esenciales para la formación de coágulos sanguíneos. Los estudios en ratones revelan más sobre las proteínas involucradas en la activación de las plaquetas, con implicaciones para comprender los accidentes cerebrovasculares y los ataques cardíacos.

¿Cómo dejan de sangrar los animales después de una lesión? Cuando los humanos evolucionaron, una solución común consistía en generar rápidamente un coágulo complejo formado por proteínas derivadas de la sangre (fibrina) y células (plaquetas). Trabajando juntos, la fibrina y las plaquetas crean un tapón que evita el sangrado el tiempo suficiente para que se produzca la curación. La desventaja es que también se pueden formar coágulos en los vasos sanguíneos marcados por placas cargadas de colesterol (aterosclerosis), interrumpiendo el flujo sanguíneo y provocando accidentes cerebrovasculares y ataques cardíacos.

Escribiendo en la página 74 de este número, Sambrano y sus colegas 1 investigan una de las preguntas clave sin respuesta sobre la coagulación: ¿cuál es el papel en los ratones de una proteína llamada receptor 4 activado por proteasa (PAR4)? Sus resultados confirman la necesidad de esta proteína en la coagulación, pero las implicaciones van más allá, tocando el ajuste fino de la activación plaquetaria y las intrigantes diferencias entre ratones y humanos. También puede haber implicaciones para el desarrollo de fármacos para prevenir problemas cardiovasculares.

Uno de los primeros pasos en la formación de un coágulo de sangre es la generación localizada de la enzima activa trombina a partir de su precursor inactivo circulante, la protrombina. La trombina escinde el fibrinógeno en el plasma sanguíneo, creando monómeros de fibrina que luego se polimerizan en una malla a través de una herida en la pared de un vaso sanguíneo. La trombina también activa las plaquetas 2. Un estudio publicado hace una década 3 estableció que las plaquetas humanas expresan en su superficie el receptor 1 activado por proteasa (PAR1), una proteína de señalización que es un sustrato de la trombina. Al escindir PAR1, la trombina inicia la señalización dentro de las plaquetas, lo que hace que se peguen entre sí. La estructura básica de PAR1 lo ubica dentro de una gran familia de receptores de superficie celular que funcionan a través de interruptores intracelulares llamados proteínas G.

Con PAR1 identificado, el misterio de cómo una proteasa plasmática podría activar las plaquetas parecía haberse resuelto. Pero en poco tiempo, las preguntas comenzaron a acumularse. Si PAR1 es de hecho el receptor de trombina universal, ¿por qué la eliminación de su gen en ratones no tuvo ningún efecto sobre la activación plaquetaria por la trombina? ¿Cómo puede la escisión de un solo tipo de receptor activar más de una vía de señalización dentro de las plaquetas, y cómo podrían modularse estas respuestas con el tiempo y en el amplio rango de concentraciones de trombina que es probable que encuentren las plaquetas? ¿Cuál es el papel, si es que lo hay, de otras proteínas de unión a trombina que se encuentran en la superficie de las plaquetas?

Ahora se conocen las respuestas a al menos algunas de estas preguntas. Resulta que hay otros tres miembros de la familia PAR 4: PAR2, PAR3 y PAR4. Al igual que PAR1, dos de estos receptores, PAR3 y PAR4, son activados por la trombina. PAR2 no lo es. Las plaquetas humanas expresan PAR1 y PAR4, mientras que las plaquetas de ratón expresan PAR3 y PAR4 pero no PAR1. Esto, por supuesto, explica por qué la pérdida de PAR1 no tuvo ningún efecto sobre la función plaquetaria en ratones.

La trombina produce una variedad de respuestas en las plaquetas porque los receptores PAR están acoplados a más de un tipo de proteína G. Las respuestas graduadas a una variedad de concentraciones de trombina pueden explicarse en parte por una relación entre la cantidad de trombina presente y el número de proteínas PAR escindidas por segundo, y en parte por diferencias entre los miembros de la familia PAR en la concentración de trombina requerida para la escisión. Entonces, por ejemplo, PAR1 es un mejor sustrato para la trombina que PAR4. Cuando ambos están presentes, la escisión de PAR1 presumiblemente precede a la escisión de PAR4 a medida que se acumula la trombina (Fig. 1a) 5,6. Por otro lado, una vez que se escinde PAR4, parece indicar durante más tiempo 7.

La comunicación entre la enzima trombina que escinde proteínas (tijeras) y los miembros de la familia de proteínas PAR desencadena vías de señalización que activan las células sanguíneas. a, En los seres humanos, las plaquetas expresan PAR1 y PAR4. Estos se acoplan a las vías de señalización intracelular a través de interruptores moleculares del Gq, G12 y GI familias de proteínas. Cuando la trombina elimina los extremos amino de PAR1 y PAR4, se activan varias vías de señalización (flechas de colores), uno de cuyos resultados es la secreción de ADP. Al unirse a su receptor, P2Y12, ADP activa G adicionalI-vías mediadas. En ausencia de heridas, la activación plaquetaria se contrarresta mediante la señalización de la prostaglandina I2. La escisión de PAR1 por la trombina parece estar habilitada por la unión de la trombina a la glicoproteína Ibα. B, Las plaquetas de ratón expresan PAR3 y PAR4. PAR4 parece ser el único responsable de la señalización 1, mientras que PAR3 permite la escisión de PAR4, lo que le permite responder a concentraciones más bajas de trombina.

El hecho de que las plaquetas humanas expresen PAR1 y PAR4 mientras que las plaquetas de ratón expresan PAR3 y PAR4 parece ser un ejemplo de soluciones divergentes a un problema común: cómo inducir una variedad de respuestas a la trombina. Aunque el PAR3 de ratón es un buen sustrato para la trombina, da señales deficientes, si es que lo hace. En otras palabras, por alguna razón ha perdido la capacidad de activar las proteínas G, al tiempo que conserva la capacidad de ser escindida por la trombina. No obstante, cuando el gen que codifica PAR3 se eliminó de los ratones, las plaquetas respondieron considerablemente menos bien a la trombina 5. Por tanto, se sugirió que PAR4 es el principal mediador de las respuestas de los ratones a la trombina, y que PAR3 tiene un papel de apoyo, permitiendo la escisión de PAR4 a concentraciones bajas de trombina. Si es así, entonces uno podría predecir que la eliminación de PAR4 aboliría la señalización de trombina en las plaquetas de ratón.

Sambrano et al. Ahora he eliminado el gen PAR4 en ratones y descubrí que las plaquetas ya no son activadas por la trombina. Los resultados muestran el requisito de PAR4 y respaldan el papel de ayuda previsto para PAR3 (Fig. 1b). Para que hubiera surgido esta disposición incómoda, el PAR3 de ratón no solo tuvo que perder su capacidad intrínseca de señalizar cuando se escindió, sino que también tuvo que "adquirir" la capacidad de ayudar a la activación de PAR4. Se podría especular que estas diferencias entre las plaquetas humanas y de ratón no son una mera casualidad, sino que son apropiadas por otras razones. Eso aún está por verse.

Como muestran los autores, las respuestas de las plaquetas a la trombina fueron completamente abolidas en ratones que carecían de ambas copias del gen PAR4. Los ratones con una copia del gen mostraron una alteración moderada en la formación de coágulos. Aunque este deterioro no alcanzó significación estadística, parece haber una tendencia aquí: las plaquetas de ratón pueden requerir que la mayoría, si no todos, de sus receptores de trombina sean completamente funcionales. Si esto también es cierto para las plaquetas humanas, entonces las variaciones heredadas en la estructura de los miembros de la familia PAR que resultan en una reducción en la señalización podrían traducirse en diferencias entre las personas en el riesgo de desarrollar accidentes cerebrovasculares y ataques cardíacos. Hasta ahora, no se han reportado variaciones que alteren la función en PAR1 y PAR4, pero se ha descrito una 8 para PAR2.

¿Son las proteínas PAR suficientes para explicar todas las respuestas de las plaquetas a la trombina? Dados los nuevos resultados 1 y el hecho de que el bloqueo simultáneo de PAR1 y PAR4 anula la capacidad de las plaquetas humanas para responder a la trombina 9, la respuesta parecería ser "sí". Pero estudios recientes 10,11 han revitalizado el debate sobre el papel del complejo multiproteína glucoproteína Ib / IX / V como sitio de unión y sustrato para la trombina. Todavía es demasiado pronto para predecir el resultado de ese debate. No obstante, los resultados de Sambrano et al. proporcionan una demostración concluyente del papel esencial de PAR4 en la activación de las plaquetas por la trombina y, por extensión, de la necesidad de la propia trombina. Su trabajo también vuelve a enfatizar la posibilidad de que los medicamentos que bloquean PAR1, PAR4 o ambos puedan ser útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos de la coagulación en humanos.


¿Qué es la proteasa? (con imagenes)

Una proteasa es un miembro de un grupo muy grande de enzimas que tienen una variedad de funciones en el cuerpo. Uno de ellos es como enzima digestiva para procesar proteínas. Sin proteasa, el cuerpo no podría digerir la proteína de los alimentos. Otros tipos de proteasas están involucradas en la regulación de eventos celulares, como la coagulación sanguínea. Estos también se llaman enzimas proteolíticas o proteinasas.

Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos que se mantienen unidas por enlaces peptídicos. Los pequeños fragmentos de proteínas se conocen como péptidos, y los fragmentos más grandes se denominan polipéptidos. Las enzimas que descomponen los péptidos se denominan peptidasas.

Las proteasas son tipos de proteínas que aceleran la degradación de otras. Se diferencian en la forma en que realizan esta actividad. Exopeptidasas escinde los aminoácidos terminales y mordisquea las proteínas. Rompen enlaces peptídicos para liberar aminoácidos. A diferencia de, endopeptidasas actúan dentro de la proteína y también escinden enlaces peptídicos, produciendo polipéptidos como resultado de sus actividades.

Hay varias clases de proteasas, según el tipo de aminoácido en el sitio donde ocurre la reacción y cualquier molécula adicional necesaria para la actividad. Por ejemplo, muchas proteínas requieren un átomo de metal para estar activo. Son conocidos como metaloproteinasas. Otras proteasas tienen un aminoácido conocido como serina en su sitio activo y se conocen como serina proteasas.

Los estudios iniciales de las proteasas, en fisiología humana, se realizaron para discernir su papel en la digestión en el sistema gastrointestinal. El objetivo de la digestión enzimática es romper moléculas más grandes en más pequeñas. Varias proteasas trabajan en conjunto con las peptidasas para degradar las proteínas de los alimentos a pequeños péptidos y aminoácidos. Estas pequeñas moléculas pueden ser absorbidas por las células intestinales y usarse como combustible o para construir nuevas moléculas de proteína.

Una cosa que todas estas proteasas digestivas tienen en común es que se sintetizan como formas inactivas más grandes para evitar que el tejido que las contiene sufra daños enzimáticos. Estos precursores se conocen como zimógenos. Otra característica que comparten es que todas son endopeptidasas, aunque varían en su preferencia por la parte de las proteínas que escindirán. Esta especificidad de sustrato se basa en la ubicación de aminoácidos específicos en las proteínas diana.

El estómago contiene la proteasa digestiva. pepsina, que es estimulado por el ácido clorhídrico del estómago. La pepsina descompone las proteínas en polipéptidos, que viajan al intestino. En esta ubicación, se rompen en pedazos aún más pequeños por las proteasas digestivas adicionales tripsina y quimotripsina. Todas estas enzimas son serina proteasas.

Otros tipos de proteasas actúan regulando la actividad de otras proteínas. Al escindir un sitio específico en una proteína, pueden activarla o desactivarla. Esto puede ser parte de un mecanismo para señalar un cambio fisiológico. Otra función de las proteasas es ayudar en el procesamiento de proteínas que se producen en formas más grandes, como la proteína precursora amiloide. Otras proteasas degradan proteínas que ya no son necesarias para la función celular.


Referencias

Carruthers, V.B. & amp Blackman, M.J. Un nuevo lanzamiento sobre la vida: conceptos emergentes en proteólisis e invasión de parásitos. Mol. Microbiol. 55, 1617–1630 (2005).

O'Donnell, R.A. & amp Blackman, M.J. El papel de las proteasas de merozoitos de la malaria en la invasión de glóbulos rojos. Curr. Opin. Microbiol. 8, 422–427 (2005).

Rosenthal, P.J. Cisteína proteasas de los parásitos de la malaria. En t. J. Parasitol. 34, 1489–1499 (2004).

Wickham, M.E., Culvenor, J.G. & amp Cowman, A.F. Inhibición selectiva de una salida en dos pasos de los parásitos de la malaria del eritrocito del huésped. J. Biol. Chem. 278, 37658–37663 (2003).

Harris, P.K. et al. Identificación molecular de una sheddase superficial de merozoito de malaria. PLoS Pathog. 1, 241–251 (2005).

Green, J.L., Hinds, L., Grainger, M., Knuepfer, E. & amp Holder, A.A. La proteína de merozoíto apical relacionada con trombospondina de Plasmodium (PTRAMP) se desprende de la superficie de los merozoitos por PfSUB2 tras la invasión de eritrocitos. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 114–117 (2006).

Li, J., Mitamura, T., Fox, B.A., Bzik, D.J. & amp Horii, T. Localización diferencial de fragmentos procesados ​​de Plasmodium falciparum antígeno repetido de serina y procesamiento adicional de su fragmento N-terminal de 47 kDa. Parasitol. En t. 51, 343–352 (2002).

Howell, S.A. y col. Distintos mecanismos gobiernan la eliminación proteolítica de una proteína de invasión clave en los patógenos apicomplexanos. Mol. Microbiol. 57, 1342–1356 (2005).

Aly, A.S. & amp Matuschewski, K.Una cisteína proteasa de la malaria es necesaria para Plasmodium los esporozoitos salen de los ooquistes. J. Exp. Medicina. 202, 225–230 (2005).

Miller, S.K. et al. Un subconjunto de Plasmodium falciparum Los genes SERA se expresan y parecen desempeñar un papel importante en el ciclo eritrocítico. J. Biol. Chem. 277, 47524–47532 (2002).

Li, J., Matsuoka, H., Mitamura, T. & amp Horii, T. Caracterización de proteasas implicadas en el procesamiento de Plasmodium falciparum antígeno repetido de serina (SERA). Mol. Biochem. Parasitol. 120, 177–186 (2002).

Aoki, S. et al. El antígeno repetido de serina (SERA5) se expresa predominantemente entre la familia multigénica SERA de Plasmodium falciparum, y los títulos de anticuerpos adquiridos se correlacionan con la inhibición sérica del crecimiento del parásito. J. Biol. Chem. 277, 47533–47540 (2002).

Pang, X.L., Mitamura, T. & amp Horii, T. Anticuerpos reactivos con el dominio N-terminal de Plasmodium falciparum El antígeno repetido de serina inhibe la proliferación celular aglutinando merozoitos y esquizontes. Infectar. Immun. 67, 1821–1827 (1999).

Blackman, M.J. Purificación de Plasmodium falciparum merozoitos para el análisis del procesamiento de la proteína de superficie de merozoitos-1. Métodos Cell Biol. 45, 213–220 (1994).

Contreras, C.E. et al. Se mide la actividad específica de la etapa de los posibles compuestos antipalúdicos in vitro por citometría de flujo en comparación con microscopía óptica y captación de hipoxantina. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99, 179–184 (2004).

Powers, J.C., Asgian, J.L., Ekici, O.D. y James, K.E. Inhibidores irreversibles de las proteasas de serina, cisteína y treonina. Chem. Rvdo. 102, 4639–4750 (2002).

Jackson, K.E. et al. Permeabilización selectiva de la membrana de la célula huésped de Plasmodium falciparumglóbulos rojos infectados con estreptolisina O y equinatoxina II. Biochem. J. 403, 167–175 (2007).

Saliba, K.J. & amp Kirk, K. Adquisición de nutrientes por parásitos apicomplexanos intracelulares: quedarse a cenar. En t. J. Parasitol. 31, 1321–1330 (2001).

Nyalwidhe, J. et al. Un derivado de biotina no permeante accede a la vacuola parasitófora en Plasmodium falciparumeritrocitos infectados permeabilizados con estreptolisina O. J. Biol. Chem. 277, 40005–40011 (2002).

Sajid, M., Withers-Martinez, C. & amp Blackman, M.J. Maduración y especificidad de Plasmodium falciparum proteasa-1 similar a la subtilisina, una serina proteasa similar a la subtilisina del merozoito de la malaria. J. Biol. Chem. 275, 631–641 (2000).

Jean, L., Withers-Martinez, C., Hackett, F. & amp Blackman, M.J. Inserciones únicas en Plasmodium falciparum La proteasa-1 similar a la subtilisina es crucial para la maduración y la actividad de la enzima. Mol. Biochem. Parasitol. 144, 187–197 (2005).

Blackman, M.J. et al. Una proteína similar a la subtilisina en los orgánulos secretores de Plasmodium falciparum merozoitos. J. Biol. Chem. 273, 23398–23409 (1998).

Yeoh, S. et al. La descarga subcelular de una serina proteasa media la liberación de los parásitos invasores de la malaria de los eritrocitos del huésped. Celda 131, 1072–1083 (2007).

Shenai, B.R., Sijwali, P.S., Singh, A. & amp Rosenthal, P.J. Caracterización de falcipaína-2 nativa y recombinante, una cisteína proteasa de trofozoíto principal y hemoglobina esencial de Plasmodium falciparum. J. Biol. Chem. 275, 29000–29010 (2000).

Sijwali, P.S., Shenai, B.R., Gut, J., Singh, A. & amp Rosenthal, P.J. Expresión y caracterización de la Plasmodium falciparum hemoglobinasa falcipaína-3. Biochem. J. 360, 481–489 (2001).

Sijwali, P.S. & amp Rosenthal, P.J. La disrupción genética confirma un papel crítico de la cisteína proteasa falcipain-2 en la hidrólisis de hemoglobina por Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 101, 4384–4389 (2004).

Sijwali, P.S., Koo, J., Singh, N. & amp Rosenthal, P.J. Las alteraciones genéticas demuestran roles independientes para las cuatro falcipaína cisteína proteasas de Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 96–106 (2006).

Kam, C.M. et al. Diseño y evaluación de inhibidores de dipeptidil peptidasa I (Catepsina C). Arco. Biochem. Biophys. 427, 123–134 (2004).

Klemba, M., Gluzman, I. y Goldberg, D.E. A Plasmodium falciparum la dipeptidil aminopeptidasa I participa en la degradación de la hemoglobina vacuolar. J. Biol. Chem. 279, 43000–43007 (2004).

Yuan, F., Verhelst, S.H., Blum, G., Coussens, L.M. & amp Bogyo, M. Una sonda basada en actividad selectiva para la familia de papaína cisteína proteasa dipeptidil peptidasa I / catepsina C. Mermelada. Chem. Soc. 128, 5616–5617 (2006).

Greenbaum, D.C. et al. Un papel de la proteasa falcipaína 1 en la invasión de la célula huésped por el parásito de la malaria humana. Ciencias 298, 2002–2006 (2002).

Wang, G., Mahesh, U., Chen, G.Y. & amp Yao, S.Q. Síntesis en fase sólida de péptidos vinil sulfonas como inhibidores potenciales y sondas basadas en la actividad de cisteína proteasas. Org. Letón. 5, 737–740 (2003).

Delplace, P., Fortier, B., Tronchin, G., Dubremetz, J.F. & amp Vernes, A. Localización, biosíntesis, procesamiento y aislamiento de un antígeno principal de 126 kDa de la vacuola parasitófora de Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 23, 193–201 (1987).

Delplace, P. et al. Proteína p126: un antígeno de vacuola parasitóforo asociado con la liberación de Plasmodium falciparum merozoitos. Biol. Celda 64, 215–221 (1988).

Tallarida, R.J. Sinergismo farmacológico: su detección y aplicaciones. J. Pharmacol. Exp. El r. 298, 865–872 (2001).

Withers-Martinez, C. et al. Expresión de recombinante Plasmodium falciparum proteasa-1 similar a la subtilisina en células de insectos.Caracterización, comparación con la proteasa del parásito y modelado de homología. J. Biol. Chem. 277, 29698–29709 (2002).

Henningsson, F., Wolters, P., Chapman, H.A., Caughey, G.H. & amp Pejler, G. Las catepsinas C y S de mastocitos controlan los niveles de carboxipeptidasa A y la quimasa, proteasa 5 de mastocitos de ratón. Biol. Chem. 384, 1527–1531 (2003).

Hodder, A.N. et al. Caracterización enzimática, filogenética y estructural del inusual dominio de proteasa similar a la papaína de Plasmodium falciparum SERA5. J. Biol. Chem. 278, 48169–48177 (2003).

Hackett, F., Sajid, M., Withers-Martinez, C., Grainger, M. & amp Blackman, M.J. PfSUB-2: una segunda proteína similar a la subtilisina en Plasmodium falciparum merozoitos. Mol. Biochem. Parasitol. 103, 183–195 (1999).

Palmer, J.T., Rasnick, D., Klaus, J.L. & amp Bromme, D. Vinilsulfonas como inhibidores de cisteína proteasa basados ​​en mecanismos. J. Med. Chem. 38, 3193–3196 (1995).

Delplace, P., Dubremetz, J.F., Fortier, B. & amp Vernes, A. Un exoantígeno de 50 kilodalton específico para la etapa de liberación-reinvasión de merozoitos de Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 17, 239–251 (1985).


Proteasas ADAMTS en fisiología y enfermedad cardiovascular

La familia de las a desintegrinas y metaloproteinasas con motivo de trombospondina (ADAMTS) comprende 19 proteasas que regulan la estructura y función de las proteínas extracelulares en la matriz extracelular y la sangre. El papel cardiovascular mejor caracterizado es el de ADAMTS-13 en sangre. Los niveles de ADAMTS-13 moderadamente bajos aumentan el riesgo de accidente cerebrovascular isquémico y los niveles muy bajos (menos del 10%) pueden causar púrpura trombocitopénica trombótica (PTT). El ADAMTS-13 recombinante se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de TTP. Recientemente, se han descubierto nuevas funciones cardiovasculares para las proteasas ADAMTS. Varios miembros de la familia ADAMTS son importantes en el desarrollo de los vasos sanguíneos y el corazón, especialmente las válvulas. Varios estudios también han investigado el papel potencial de ADAMTS-1, -4 y -5 en las enfermedades cardiovasculares. Escinden proteoglicanos como el versicano, que representan los principales componentes estructurales de las arterias. ADAMTS-7 y -8 están atrayendo un interés considerable debido a su implicación en la aterosclerosis y la hipertensión arterial pulmonar, respectivamente. Mutaciones en el ADAMTS19 gen causa enfermedad progresiva de las válvulas cardíacas y variantes de sentido erróneo en ADAMTS6 están asociados con la conducción cardíaca. En esta revisión, discutimos en detalle la evidencia de estos y otros roles cardiovasculares de los miembros de la familia ADAMTS, sus sustratos proteolíticos y los posibles mecanismos moleculares involucrados.

1. Introducción

La matriz extracelular (MEC) guía la formación de tejidos cardiovasculares durante la embriogénesis y la respalda durante la edad adulta proporcionando apoyo estructural, guía del comportamiento celular y secuestro de factores de crecimiento. En las grandes arterias y vasos sanguíneos, el colágeno y las fibras elásticas proporcionan un soporte estructural esencial para evitar la rotura. Una arteria sana consta de tres capas (túnicas): túnica adventicia, media e íntima (figura 1). La íntima está en contacto con la luz del vaso y está formada por células endoteliales (CE) unidas a una membrana basal rica en colágeno IV, laminina, nidogeno y proteoglicanos (PG) de heparán sulfato (HS) (sindecano, perlecano). La túnica media está formada por células de músculo liso vascular (VSMC), que expresan condroitín-sulfato (CS) / dermatan-sulfato (DS) -PG (CSPG) (como versicano y agrecano) y elastina. Hay láminas fenestradas de elastina llamadas laminillas entre las cuales hay fibras de colágeno, capas delgadas de MEC ricas en PG y CMLV. La elastina, que es distensible y tiene una baja resistencia a la tracción, funciona como un depósito elástico y distribuye la tensión de manera uniforme a lo largo de la pared y sobre las fibras de colágeno [1]. La adventicia es la capa más externa de un vaso sanguíneo y consiste en una MEC rica en colágeno secretada por fibroblastos que previene la rotura vascular a presiones muy altas. La adventicia también es un reservorio de células madre y juega un papel esencial en la regulación de las funciones de las poblaciones celulares en la túnica íntima y media [2]. Varias PG están presentes en las diferentes capas. En la túnica media, contribuyen a las propiedades viscoelásticas de la pared del vaso. Esta función de las PG está mediada por sus cadenas de glicosaminoglicanos (GAG). Debido a su alta carga negativa, estos GAG atraen contraiones y agua al tejido [3, 4]. Además, los CSPG como el versicano y el agrecano son componentes esenciales de las valvas de las válvulas cardíacas y, en particular, de la capa media de la ECM, la esponjosa, mientras que la elastina y el colágeno predominan en las capas ventricular / auricular y fibrosa, respectivamente [5,6] (figura 2). Las proporciones de PG y colágenos / fibras elásticas intercaladas proporcionan un medio de equilibrio entre la rigidez y la flexibilidad de los tejidos cardiovasculares [7]. Por esta razón, la remodelación de la ECM vascular por las proteasas secretadas tanto por las CE como por las CMLV es crucial para establecer las propiedades mecánicas de estos tejidos. Además, la degradación de ECM es necesaria para la migración y proliferación de CMLV, así como la infiltración de células inflamatorias en condiciones patológicas. Entre las proteasas involucradas en esta acción dinámica, los miembros de la familia de las metaloproteinasas de matriz (MMP) se han investigado ampliamente debido a su capacidad para escindir los componentes elásticos de la ECM como los colágenos (MMP-1, -8, -13, -14) y elastina (MMP-12). Además, las proteasas de la familia relacionada de una desintegrina y metaloproteinasas (ADAM) ejercen un papel fundamental en la MEC vascular debido a su capacidad para escindir selectivamente el ectodominio de las proteínas de membrana (desprendimiento). El papel de estas familias de metaloproteinasas en los trastornos cardiovasculares se ha revisado exhaustivamente en otro lugar [8,9].

Figura 1. Implicación de las proteasas ADAMTS en la fisiología y enfermedad cardiovascular. Aterosclerosis y hemostasia: disminución de la actividad proteoglicanasa (a1) se asocia con acumulación de proteoglicanos, mayor internalización de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (a2) y formación de células espumosas (a3), que eventualmente conduce a la formación de una placa aterosclerótica. Se puede formar un trombo encima de una placa si el colágeno se expone a la sangre. ADAMTS-13 regula la capacidad del factor von Willebrand (VWF) para reclutar plaquetas en el sitio de exposición al colágeno e iniciar la formación de trombos. En la aorta, la actividad de proteoglicanasa reducida (a1) provoca acumulación de proteoglicanos, aumento de la presión osmótica, reducción de la viabilidad de las células del músculo liso vascular (CMLV) y alteración de la mecanosensibilidad (B). BM, CE de membrana basal, FvW de células endoteliales, factor de von Willebrand.

Figura 2. Organización de la matriz extracelular (MEC) en válvulas cardíacas. (a) Se muestra la composición de ECM en una válvula madura. La formación de la ventricularis y la fibrosa durante el desarrollo es un proceso molecular complejo y estrictamente regulado en el que las proteasas de ADAMTS juegan un papel esencial. (B) La actividad disfuncional de ADAMTS puede conducir a un cierto grado de ECM desorganizado, forma de válvula alterada y fugas de la válvula. La ECM desorganizada puede presentarse como una abundancia de proteoglicanos, lo que puede deberse a una actividad de proteoglicanasa insuficiente o posiblemente a un ensamblaje incorrecto de la ECM en el ventricularis (por ejemplo, microfibrillas de fibrilina-1 / elastina). ADAMTS-1, -5 y -9 han sido implicados en el desarrollo de válvulas cardíacas por estudios en ratones y ADAMTS-19 por una enfermedad genética humana.

Esta revisión se centra en una familia de metaloproteasas estrechamente relacionada, una metaloproteinasa similar a la desintegrina con motivo de trombospondina (ADAMTS) y su función (pato) fisiológica en el corazón y los vasos sanguíneos. En los seres humanos, la familia ADAMTS comprende 19 metaloproteinasas secretadas, así como 7 proteínas similares a ADAMTS desprovistas de actividad catalítica [10]. Comparten una composición de dominio común que consiste en un péptido señal, un prodominio, un dominio catalítico de metaloproteinasa (Mp, ausente en las proteínas similares a ADAMTS), seguido de dominios auxiliares no catalíticos como un dominio (Dis) similar a desintegrina, un motivo central de trombospondina tipo I (TSR), un dominio rico en cisteína (CR), un dominio espaciador (Sp) y, con la excepción de ADAMTS-4, un número variado de TSR en el extremo C-terminal (tabla 1) . Algunos miembros tienen dominios C-terminales adicionales, como un dominio de mucina (presente en ADAMTS-7 y ADAMTS-12), un dominio similar a Gon-1 (en ADAMTS-20 y ADAMTS-9) y un PLAC (proteasa y lacunina) dominio (en ADAMTS-2, -3, -6, -10, -12, 14, -16, -17, -18 y -19). Además, ADAMTS-13 es único entre las proteasas ADAMTS ya que presenta dos dominios CUB [subcomponente del complemento C1r / C1s / proteína de erizo de mar embrionario Uegf (factor de crecimiento epidérmico de erizo) / proteína morfogénica ósea 1] [11,12]. Una característica común de la familia es la presencia de un motivo de unión a zinc en el dominio Mp, que contiene la secuencia consenso H EXX H XXGXX H, en la que los tres residuos de histidina subrayados coordinan un átomo de zinc, que junto con un residuo de glutamato, ejerce un papel catalítico. Este motivo es seguido en el extremo C por un residuo de metionina que constituye un giro estructural (giro Met) conservado dentro de la familia de metalopeptidasas metzincina (que comprende MMP, ADAM, ADAMTS y astacinas) [13].

Tabla 1. Resumen de los roles cardiovasculares, funciones proteolíticas y organización de dominios de la familia ADAMTS. Para las funciones y enfermedades cardiovasculares, los números entre paréntesis indican miembros específicos de la familia ADAMTS. EAC, enfermedad arterial coronaria PAH, hipertensión arterial pulmonar TAAD, aneurismas y disecciones de aorta torácica TTP, púrpura trombocitopénica trombótica VSMC, células de músculo liso vascular VWF, factor von Willebrand WMS, síndrome de Weill-Marchesani. Los dominios de la proteína ADAMTS se abrevian como sigue: S, péptido señal Pro, prodominio Mp, dominio de metaloproteinasa Dis, dominio similar a desintegrina CR, dominio Sp rico en cisteína, dominio espaciador Muc, dominio similar a mucina CUB, subcomponente del complemento C1r / C1s / proteína embrionaria de erizo de mar Uegf (factor de crecimiento epidérmico de erizo) / proteína morfogénica ósea 1 PL, dominio de proteasa y lacunina GON, dominio similar a gon-1.

Las proteasas de ADAMTS se activan generalmente después de la eliminación proteolítica del prodominio N-terminal mediante convertasas de proproteína de tipo subtilisina (por ejemplo, Furin, PCSK6) [14]. Con la excepción de ADAMTS-13, que circula en sangre, los otros miembros de la familia ADAMTS parecen funcionar en el ECM. Las enzimas activadas secretadas se regulan principalmente a través de la inhibición por los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP) [15] y la endocitosis [16].

Se pueden definir distintas subfamilias de ADAMTS sobre la base de la homología de secuencia (tabla 1). Probablemente evolucionaron a través de un proceso de duplicación de genes que resultó en neofuncionalización o subfuncionalización [17] y algunos todavía comparten un repertorio de sustrato común.

ADAMTS-1, -4, -5, -8 y -15 se caracterizan por su capacidad para escindir PG y, por lo tanto, se denominan colectivamente "proteoglicanasas". Aunque están relacionados de forma más lejana, ADAMTS-9 y -20 también exhiben esta actividad proteolítica distinta.

ADAMTS-2 es una N-propeptidasa procolágeno bien caracterizada que escinde los propéptidos N-terminales del colágeno tipo I, II y III [18]. ADAMTS-3 y ADAMTS-14 muestran un alto grado de homología con ADAMTS-2 y pueden escindir el procolágeno in vitro. ADAMTS-3 es esencial para la linfangiogénesis a través de la activación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) -C [19,20].

Los pares relacionados ADAMTS7 / 12, ADAMTS6 / 10, ADAMTS16 / 18 y ADAMTS17 / 19 no están bien caracterizados [21]. ADAMTS10 y ADAMTS17 las mutaciones dan lugar al espectro similar al síndrome de Weill-Marchesani (WMS) y se han asociado funcionalmente con el ensamblaje de microfibrillas de fibrilina [21]. También se ha demostrado que ADAMTS-6 promueve la formación de microfibrillas de fibrilina-1 [22].

ADAMTS-13, con mucho el miembro de la familia mejor caracterizado, regula la función del factor von Willebrand (VWF) en la hemostasia primaria [23,24].

Mientras que los roles no cardiovasculares de los diferentes miembros de la familia ADAMTS se han discutido en excelentes revisiones recientes [10, 14], aquí discutiremos en detalle la participación de las proteasas ADAMTS en la biología y enfermedad cardiovascular.

2. Proteoglicanos y proteoglicanasas en fisiología y enfermedad cardiovascular

2.1. Proteoglicanos

Varios miembros de la familia ADAMTS escinden específicamente PG. Debido a que "la biología de una proteasa es realmente la biología de sus sustratos" [14], analizaremos brevemente el papel de los PG en el sistema cardiovascular. En los vasos sanguíneos, las PG se expresan principalmente por las CE y las CMLV en la túnica íntima y media, respectivamente, donde regulan las propiedades biofísicas de la ECM [3,19]. Además, a través de sus interacciones con las proteínas ECM, los factores de crecimiento y las quimiocinas, las PG regulan una variedad de procesos como la señalización celular, la proliferación, la migración y la apoptosis [25]. El aumento de la acumulación de PG es una característica de la aterosclerosis [26,27] y los aneurismas [28], así como de enfermedades hereditarias como la valvulopatía aórtica pediátrica y las válvulas mitrales mixomatosas del adulto [29].

Los PG se clasifican de acuerdo con el GAG predominante unido covalentemente a los residuos de serina en su núcleo proteico, PG de heparina / heparán sulfato (HS) y condroitina-sulfato / dermatán sulfato (CS / DS). Los CS-GAG contienen D-ácido glucurónico y norte-acetilo-D-galactosamina, mientras que en DS-GAG, el D-el ácido glucurónico se epimeriza en L-ácidoidurónico. Los HS-GAG contienen D-ácido glucurónico o L-ácidoidurónico alternando con norte-acetilo-D-glucosamina. Los GAG no solo son importantes para generar una presión osmótica de Donnan en el tejido vascular debido a sus cargas negativas [4], sino también para mediar en la captación de lipoproteínas de la circulación.

La acumulación subintimal de depósitos (placas) ricos en lípidos e inflamatorios en arterias medianas y grandes es un sello distintivo de la aterosclerosis (figura 1a). El agrandamiento de las placas dificulta el flujo sanguíneo normal, lo que provoca isquemia de órganos y necrosis tisular. La rotura de la placa con la formación subsiguiente de trombos puede causar oclusión vascular que conduce a eventos cardiovasculares potencialmente fatales como infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Los PG como el versicano y el aggrecan también tienden a acumularse en los aneurismas y disecciones de la aorta torácica (TAAD) [28,30,31] y durante el envejecimiento normal de la aorta [32], lo que da como resultado un aumento de la presión osmótica que altera la ECM ( Figura 1B). Además, la acumulación de PG puede interrumpir la mecanosensibilidad de las CMLV y crear tensiones en la pared aórtica que pueden predisponer o propagar una disección [33].

Las HSPG como el perlecano y los cuatro sindecanos transmembrana se sintetizan principalmente por las CE en la íntima e inhiben los procesos proaterogénicos como la retención de lipoproteínas, la infiltración de células inflamatorias, la proliferación de CMLV y la trombosis [34,35]. Dado que los HSPG no son sustratos principales de ADAMTS, no se analizarán en detalle aquí. En cambio, nos centraremos en los CSPG.

Los CSPG son expresados ​​principalmente por VSMC en la tunica media [25]. A diferencia de las HSPG, las CSPG pueden iniciar procesos ateroscleróticos mejorando tanto el depósito como la internalización de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) que han penetrado en la pared arterial después de la transcitosis o disfunción endotelial [27,36] (figura 1).a). Los CSPG pueden formar complejos de alta afinidad con partículas de LDL, que luego son internalizadas de manera más eficiente por las CMLV y los macrófagos infiltrados que las LDL nativas [37,38]. Una vez internalizadas, las LDL mejoran la síntesis de ésteres de colesterol intracelular y la formación de espuma subsiguiente [39]. La interacción entre las lipoproteínas y los CSPG implica un enlace iónico entre los aminoácidos básicos de la apoproteína B (apoB) y los grupos sulfato cargados negativamente en los GAG [40]. Además, cuanto más largas sean las cadenas de CS, mayor será la afinidad por las LDL [41]. Para respaldar la idea de que la unión directa de partículas de LDL a CSPG es un paso clave en la aterogénesis, los ratones transgénicos que expresan partículas de LDL donde los aminoácidos cargados positivamente en apoB habían sido reemplazados por neutros exhibieron significativamente menos lesiones ateroscleróticas que los ratones que expresan apoB de tipo salvaje. [42]. Los CSPG comprenden PG de agregación grandes como versican y aggrecan y PG pequeños ricos en leucina (SLRP) como biglycan y decorin. Debido a su capacidad para unirse tanto al hialuronano, el único GAG no sulfatado, como a las lectinas, los PG de gran agregación también se denominan hialectanos [43]. Los hialectanos tienen una estructura similar, que comprende dos dominios globulares en los extremos N y C, denominados G1 y G3, respectivamente, y un dominio GAG central que contiene sitios de unión para cadenas GAG. El dominio G1 se une al hialuronano, mientras que el dominio G3 contiene la región de unión a lectina (figura 1a).

Versican es el principal hialectano en la vasculatura, donde desempeña un papel en los procesos de desarrollo y reparación como la adhesión celular, la proliferación y la migración, el ensamblaje de la ECM y la inflamación [25,26,44]. Está presente en 5 isoformas (V0-V4), generadas por empalme alternativo dentro de la región central rica en GAG. La expresión de versican es esencial para el desarrollo normal del corazón y los vasos sanguíneos [45,46]. El versican participa en varios aspectos del desarrollo de lesiones vasculares y está presente en placas ateroscleróticas, lesiones reestenóticas, lesiones que surgen durante la reparación del injerto y lesiones aneurismáticas [27] Los niveles de Versican aumentan drásticamente en la aterosclerosis [27, 47], lo que sugiere que su acumulación puede ser en parte responsable del aumento de la deposición / internalización de LDL en la pared del vaso (figura 1a).

Aggrecan, un CSPG importante en el cartílago, se ha identificado recientemente en aortas humanas [28,30,31,48-53] y, junto con versican, se ha demostrado que se acumula en las aortas de pacientes con TAAD, lo que resulta en un aumento presión osmótica que perturba el ECM [30] (figura 1B). Aquí, es importante tener en cuenta que el agrecano tiene un orden de magnitud más CS que el versicano [54] y, por lo tanto, más potencial para ejercer presión osmótica. Además de CS, aggrecan también contiene queratán sulfato (KS) GAG (donde el D-galactosa reemplaza al ácido hexurónico) agrupados en una región rica en KS [54].

El núcleo proteico de las SLRP como el biglicano es pequeño (40-60 kDa) y se caracteriza por la presencia de 11-12 repeticiones en tándem ricas en leucina y la unión de 1-2 cadenas GAG CS / DS [55]. Las repeticiones en tándem ricas en leucina se unen a los colágenos, regulando así la formación de fibrillas de colágeno [56-58].

El biglicano es uno de los principales PG que se encuentran en las lesiones ateroscleróticas humanas [59-62]. Al igual que el agrecano y el versicano, el biglicano se une a las partículas de LDL, aunque con una afinidad reducida debido al menor número de cadenas de GAG ​​[63]. Bgn Los ratones knockout no mostraron una reducción de la retención de LDL en la pared arterial, probablemente debido a la compensación de otros CSPG [64].Sin embargo, la sobreexpresión de biglicano en ratones aumentó la retención arterial de lipoproteínas apoB y promovió la aterosclerosis [62,65]. El biglicano también puede ejercer una función antiaterosclerótica. En ratones genéticamente susceptibles a desarrollar lesiones ateroscleróticas (que ya tienen deleción de la apolipoproteína E, ApoE, o receptor de LDL, LDLR), la abolición de la expresión de biglicanos aumentó la inflamación de la placa mediada por macrófagos [64]. El biglicano también se considera un iniciador temprano de la lesión de estenosis aórtica, lo que contribuye al engrosamiento de la pared [66]. Además, el biglicano se ha implicado en la formación de TAAD, ya que Bgn/LDLR Los ratones con doble knockout mostraron una mayor incidencia de TAAD [67] y pérdida de mutaciones funcionales en Bgn da como resultado TAAD sindrómico de inicio temprano en humanos [68]. Bgn Los ratones knockout también mostraron aneurismas aórticos abdominales espontáneos (AAA) [69]. Dado que la deficiencia de biglicano altera la formación de fibras de colágeno en la pared aórtica y contribuye a la rotura de las fibras elásticas [67,70], esto afectará la capacidad del vaso para sostener las fuerzas de tensión.

2.2. Proteoglicanasas

Los niveles fisiológicos de PG están regulados por la actividad proteoglicanasa de varios miembros de la familia ADAMTS. Se ha demostrado que ADAMTS-1, -4, -5, -8, -9, -15 y -20 escinden, aunque en diferente medida, tanto el versicano [71-75] como el aggrecano [76]. La única escisión de ADAMTS de la isoforma versicano V1 descrita hasta la fecha ocurre en el enlace Glu441 ↓ 442Ala dentro del βDominio GAG [71-75]. Los sitios de clivaje equivalentes en el αLa región GAG en las isoformas V0 y V2 se ha identificado como Glu1428 ↓ 1429Ala [71] y Glu405 ↓ 406Gln, respectivamente [77]. Agrecan es escindido por proteasas ADAMTS en múltiples sitios [78], aunque el evento de escisión más perjudicial para su función ocurre en el enlace Glu392 ↓ Ala393 (numeración Uniprot P16112) en la región entre los dominios G1 y G2 [79]. Es importante destacar que se ha demostrado que la escisión mediada por ADAMTS de agrecano y versicano libera fragmentos bioactivos. El fragmento de escisión G1-DPEAAE 441 versican V1, llamado versikine, está involucrado en una variedad de procesos biológicos como la señalización inmune [80] y la apoptosis [81], mientras que el fragmento de escisión G1-NIVSFE 405 V2 se ha identificado como un hialuronano- proteína de unión previamente identificada en el cerebro humano [77]. Se ha demostrado que un fragmento de agrecano de 32 aminoácidos de largo generado por la escisión mediada por MMP en Asn360 ↓ Phe361 y la escisión mediada por ADAMTS en Glu392 ↓ Ala393 interactúa con el receptor tipo Toll-2 y excita las neuronas nociceptivas en los condrocitos [82,83] . Después de la escisión de ADAMTS en Glu392 ↓ Ala393, el neopéptido 393 ARGS puede difundirse desde la ECM al plasma, la orina y el líquido sinovial [84,85]. Entre las proteasas de ADAMTS mencionadas anteriormente, ADAMTS-4 y -5 muestran la actividad proteolítica más fuerte contra el agrecano [86,87] y el versicano [88], además, también se ha demostrado que escinden el biglicano SLRP en Asn186 ↓ 187Cys [86,89 ]. Esta actividad de proteoglicanasa ejerce funciones importantes en la biología vascular y puede contribuir a enfermedades cardiovasculares como la aterosclerosis y los aneurismas, como se describe en las siguientes secciones.

2.2.1. ADAMTS-1: ¿amigo (en TAAD) o enemigo (en aterosclerosis)?

ADAMTS-1 fue el primer miembro de la familia en ser descrito [90]. Los primeros modelos de knockout murinos mostraron la participación de esta enzima en la fertilización y el desarrollo del sistema urogenital [91-94], pero pronto se reconoció que ADAMTS-1 juega un papel cardiovascular importante. El repertorio de sustratos de ADAMTS-1 parece extenderse más allá de los CSPGs aggrecan [95] y versican [88]. Reportado in vitro los sustratos incluyen nidogen-1 y -2 [96,97], semaforina 3C [98], inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) -2 [99], proteína de unión al factor de crecimiento de la insulina (IGFBP) -2 [100], sindecan-4 [101] y trombospondinas 1 y 2 [98,102]. Actividad de ADAMTS-1 versicanase in vitro es considerablemente más débil que el de ADAMTS-4 o ADAMTS-5 [88], pero parece biológicamente importante en ciertos procesos de desarrollo como la foliculogénesis [94]. Los estudios en ratones sugieren que la actividad de ADAMTS-1 versicanasa dentro del cojín endocárdico contribuye a la maduración de la válvula y la trabeculación del miocardio [103,104]. Sin embargo, la proteólisis de ADAMTS-1 de sustratos no PG o actividades no proteolíticas pueden ser parcialmente responsables de estos fenotipos.

En los vasos sanguíneos, ADAMTS-1, como ADAMTS-4 y -5, es expresado por CE, CMLV y macrófagos invasores [105-108]. La expresión de ADAMTS-1 se incrementó en las lesiones ateroscleróticas humanas [105] y su actividad versicanasa puede contribuir a la inestabilidad de la placa [71,105]. Ratones transgénicos que sobreexpresan Adamts1 en una ApoE - / - antecedentes fueron investigados por Jönsson-Rylander et al. [107], pero no se informaron las mediciones de la formación de lesiones ateroscleróticas. Sin embargo, la ligadura de la arteria carótida en estos ratones mostró un aumento significativo en la formación de la neoíntima, lo que sugiere un efecto de ADAMTS-1 sobre la migración / proliferación de VSMC (tabla 2). En apoyo de esto, dos miARN dirigidos ADAMTS1, miR-265b-3p y miR-362-3p, parecían inhibir la proliferación y migración de CMLV [123,124].

Tabla 2. Adamts ratones knockout y sobreexpresión en vivo. AB, hipertrofia cardiaca inducida por banda aórtica BAV, válvula aórtica bicúspide AngII, angiotensina II PAH, hipertensión arterial pulmonar PPS, polisulfato de pentosano TAAD, aneurismas y disecciones de aorta torácica. La manipulación genética está en ratones si no se especifica lo contrario.

También se ha informado de que la angiotensina II (Ang II) y otros estímulos asociados con la remodelación vascular inducen la expresión de ADAMTS-1 en la aorta [125]. Ya que Adamts1 ratones knockout tienen una mortalidad perinatal elevada [92], heterocigotos Adamts1 Se probaron ratones +/− en un modelo TAAD [109]. los Adamts1 El genotipo +/− exacerbó los aneurismas aórticos y las disecciones aórticas letales inducidas por el tratamiento con el factor hipertensivo Ang II. La administración de TAAD inducida por Ang II en casi el 80% de los Adamts1 +/− ratones y disecciones aórticas letales en casi el 50% de estos ratones, en comparación con casi el 10 y el 8% en los ratones de tipo salvaje [109]. Este fenotipo se asemeja al de Fbn1 C1039G / + , un modelo de ratón del síndrome de Marfan (MFS) caracterizado por una baja incidencia de disecciones y roturas aórticas en comparación con otros modelos de ratón MFS [126]. En estos "ratones Marfan", el introducido Fbn1 La mutación C1039G interrumpe el andamio de microfibrillas, que tiene efectos complejos complejos (incluida la disminución de los niveles de proteína ADAMTS-1) debido a las muchas complejidades mecánicas del nicho de microfibrillas de fibrilina y sus funciones en la formación de fibras elásticas, la señalización del factor de crecimiento y la biología de las CMLV [127,128 ]. Sin embargo, en los aneurismas aórticos humanos, los niveles de ADAMTS-1 no cambian o aumentan [30,129,130].

En conclusión, estos hallazgos sugieren que ADAMTS-1 puede jugar un papel perjudicial en la etiología de la aterosclerosis, mientras que se requieren más estudios para establecer su participación en el desarrollo de aortopatías.

2.2.2. ADAMTS-4, una potencial diana terapéutica en aterosclerosis y TAAD

ADAMTS-4 escinde CSPG como versicano y agrecano [87,88], brevican [131] y SLRP como fibromodulina [86,87] y biglicano [86,89], así como sustratos no PG como la proteína de matriz oligomérica del cartílago. (COMP) [132].

Aunque ADAMTS-4, como todos los demás miembros de la familia ADAMTS, con la excepción de ADAMTS-13, se une predominantemente a la ECM [86,87], puede difundirse en el plasma después de un daño cardiovascular. Los niveles plasmáticos elevados de ADAMTS-4 se han encontrado sistemáticamente en pacientes afectados por enfermedad de las arterias coronarias (EAC) [129,133-135], aterosclerosis [106,136-138] y TAAD [112,129]. Algunos de estos estudios asociaron niveles elevados de ADAMTS-4 en plasma con una mayor gravedad de la EAC [134,136] y la desestabilización de la placa [137,138]. También se encontraron niveles aumentados de ADAMTS-4 en áreas ricas en macrófagos de placas ateroscleróticas humanas y placas coronarias inestables [106,138]. Es importante destacar que estos hallazgos en humanos concuerdan con los obtenidos a partir de varios modelos de ratón (tabla 2). Se demostró que los niveles de ADAMTS-4 aumentan en las placas ateroscleróticas y el plasma de ApoE nocaut [111,138] y LDLR - / - ApoB 100/100 [99] ratones con doble knockout a medida que avanzaba la aterosclerosis. Además, la deleción genética de Adamts4 en un ApoE el fondo knockout produjo un fenotipo aterosclerótico más leve, con una mayor estabilidad de la placa en comparación con sus compañeros de camada [111]. ApoE/Adamts4 Los ratones con doble knockout también mostraron una escisión reducida tanto del versicano como del agrecano en las arterias, sin compensación mostrada por otras proteoglicanasas como ADAMTS-1 y -5. Esto se asoció con una reducción de la deposición de lípidos y la infiltración de macrófagos, pero un aumento de la proliferación de CMLV [111]. Además, en ausencia de ADAMTS-4, se observó un aumento de la apoptosis de los macrófagos y una disminución de los niveles de citocinas proinflamatorias [111]. Estos datos sugieren que la actividad de ADAMTS-4 está asociada con placas ateroscleróticas más inestables. Por lo tanto, la inhibición terapéutica de ADAMTS-4 puede ser beneficiosa en las últimas etapas del desarrollo aterosclerótico.

Supresión de Adamts4 Se demostró que reduce significativamente el agrandamiento del diámetro aórtico, la formación de aneurismas, la disección y la rotura aórtica en un modelo de ratón de TAAD esporádica inducida por una dieta rica en grasas y una infusión de AgII [112]. Estos fenotipos se asociaron con una menor infiltración de macrófagos, apoptosis de CMLV y degradación de versican [112]. Expresión de Adamts4 aumenta con el tratamiento con Ang II y la inyección de miR-126a-5p, un miRNA dirigido Adamts4, se ha demostrado recientemente que reduce la dilatación aórtica y la degradación del versicano, así como aumenta la supervivencia en estos ratones [139]. La regulación negativa severa de este miARN puede ser uno de los mecanismos responsables de la regulación positiva observada de Adamts4 expresión en el modelo Ang II [139].

In vitro, ADAMTS4 Se ha demostrado que la caída reduce la infiltración de macrófagos [129] y la apoptosis de las CMLV [112], dos procesos que son críticos para el desarrollo de aneurismas aórticos [140] y el éxtasis de la placa [141]. En ambos casos, la actividad versicanasa de ADAMTS-4 puede desempeñar un papel. El versicano de longitud completa está dotado de propiedades adhesivas y su escisión por las proteoglicanasas de ADAMTS facilita la migración de las células inmunitarias [80,142]. Además, la versikina, el fragmento de escisión de versican generado por ADAMTS, puede promover la apoptosis [81], antagonizando así el efecto antiapoptótico del versican de longitud completa [143,144]. ADAMTS-4 también puede participar directamente en la apoptosis de las CMLV después de la translocación al núcleo y la escisión de la poli ADP ribosa polimerasa-1 (PARP-1), una molécula clave en la reparación del ADN y la supervivencia celular [112]. La PARP-1 de longitud completa promueve la supervivencia celular, mientras que la PARP-1 escindida puede inducir la apoptosis [145]. Finalmente, se ha demostrado que ADAMTS-4 ejerce efectos proapoptóticos independientemente de su actividad catalítica [146], lo que sugiere que ADAMTS-4 puede inducir la apoptosis a través de diferentes mecanismos.

Curiosamente, la expresión de ADAMTS-4 aumentó en el miocardio de ratas sometidas a hipertensión y la adición de polisulfato de pentosano inhibió ambos Adamts4 expresión y escisión versicana y mejora de la función miocárdica [147].

Estas observaciones clínicas y en vivo Los datos de los modelos de ratón de la enfermedad apuntan a múltiples funciones de ADAMTS-4 en los tejidos cardiovasculares enfermos. Si la inhibición terapéutica de ADAMTS-4 podría ralentizar la progresión de la enfermedad vascular en particular, merece una mayor investigación.

2.2.3. ADAMTS-5 regula los niveles de proteoglicanos cardiovasculares

ADAMTS-5 se ha estudiado ampliamente en el contexto de la degradación del agrecano en el cartílago y es un objetivo validado para el tratamiento de la osteoartritis [148]. Más recientemente, ha surgido una función cardiovascular para ADAMTS-5, que se ha revisado recientemente [148] y se resumirá brevemente aquí.

In vitro, ADAMTS-5 es una proteoglicanasa más potente que ADAMTS-1 y -4 [87,88] y la ausencia de ADAMTS-5 en vivo provoca acumulación de PG cardiovasculares (tabla 2). Por ejemplo, Adamts5 ratones knock-out mostraron anomalías graves en las valvas de la válvula pulmonar debido a la disminución de la escisión del versicano y la posterior acumulación de versicano y agrecano [53,113,114] de manera similar, exhibieron dilatación de la aorta torácica con acumulación de agrecano y biglicano [51]. Sería interesante comparar este fenotipo con el de los ratones knock-in que expresan el versicano resistente a la escisión de ADAMTS (es decir, mutado en el sitio Glu1428 ↓ 1429Ala), llamados ratones V1R, pero desafortunadamente no se ha descrito su fenotipo cardiovascular [149]. Si bien la mayoría de los ratones V1R eran viables y fértiles, algunos de ellos mueren por hemorragia de órganos después del retrocruzamiento [149].

Se encontró que ADAMTS-5 se redujo notablemente en las aortas de ApoE ratones knockout, que desarrollaron espontáneamente lesiones ateroscleróticas, lo que provocó la acumulación de versican y biglycan [150]. El ADAMTS-5 recombinante redujo la capacidad de unión de LDL del biglicano y liberó partículas de LDL de las lesiones aórticas humanas [150], lo que sugiere un papel de esta enzima en la regulación de la retención de lipoproteínas mediada por PG (figura 1a). ADAMTS-5 se expresa tanto en CMLV [151,152] como en macrófagos [106], dos tipos de células que también expresan versicano [151,153-155] y TIMP-3 [156-158], el principal inhibidor de ADAMTS-4 y -5 [ 15]. Una vez que se forma una placa, su estabilidad se asocia con altos niveles de expresión de TIMP-3 [158,159] y versican [160]. Por lo tanto, el desarrollo de la placa aterosclerótica se ve afectado por un desequilibrio entre la expresión de proteoglicanasas, inhibidores de proteoglicanasas y PG, donde cada proteína puede ejercer un papel beneficioso / perjudicial en diferentes etapas del proceso.

En estudios de TAAD, los niveles de ARNm de ADAMTS-5 se encuentran disminuidos [30,161] y esto se ha confirmado recientemente a nivel de proteínas, tanto en plasma como en biopsias aórticas [152]. Los modelos de ratón de TAAD pueden ayudar a aclarar el papel de ADAMTS-5 en esta enfermedad. En el modelo Ang II, Adamts5 Los ratones knockout mostraron un aumento de la dilatación aórtica, lo que sugiere que ADAMTS-5 desempeña un papel no redundante en el mantenimiento de las propiedades viscoelásticas de la MEC aórtica [51]. La pérdida de ADAMTS-5 se asoció con un aumento de los niveles de proteína de versican y TGF-β [50], un jugador crucial en el desarrollo de TAAD [160]. Al mismo tiempo, se redujo la expresión de la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP-1) [50], un fenómeno que se ha demostrado que exacerba la dilatación aórtica [162]. Sorprendentemente, en este modelo, un aumento en los niveles de proteína ADAMTS-1 no compensó la ausencia de ADAMTS-5, ya que la escisión de versican disminuyó severamente [50]. Esto puede explicarse por la mayor actividad intrínseca versicanasa de ADAMTS-5 [88].

En conjunto, estos datos sugieren que la actividad proteolítica de ADAMTS-5 es esencial para regular los niveles de PG cardiovasculares y que las alteraciones podrían afectar el proceso de la enfermedad en la aterosclerosis y TAAD. Como consecuencia, cualquier tratamiento para la osteoartritis debe tener como objetivo preservar la actividad de ADAMTS-5 en los vasos sanguíneos para evitar un desequilibrio en los niveles de PG [148].

2.2.4. ADAMTS-8, un contribuyente a la hipertensión arterial pulmonar

Las propiedades enzimáticas de ADAMTS-8, incluido su repertorio de sustratos, no se han investigado exhaustivamente. El único sustrato informado es el agrecano, que se escindió in vitro, pero con una relación enzima / sustrato extremadamente alta [163]. A pesar de la homología de ADAMTS-8 con ADAMTS-1, -4 y -5, estos datos arrojan dudas sobre la inclusión de ADAMTS-8 en la subfamilia de proteoglicanasas. ADAMTS8 se ha identificado como un gen supresor de tumores en varios tipos de cánceres [164] y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el ADAMTS8 locus se han asociado con la hipertensión en un estudio de asociación de todo el genoma (GWAS) [165]. A nivel de proteínas, ADAMTS-8 se expresa en gran medida en el pulmón y el corazón [119,166] y, junto con ADAMTS-1, -4 y -5, se ha detectado en lesiones carotídeas humanas y placas ateroscleróticas coronarias avanzadas [106,107]. La expresión de ADAMTS-8 aumentó en los pulmones de pacientes con hipertensión arterial pulmonar (HAP) y en modelos de HAP de ratón / rata [119]. En un modelo de HAP inducida por hipoxia, los ratones que tienen una deleción dirigida de Adamts8 en las células del músculo liso de la arteria pulmonar (Adamts8 ΔSM22α ) mostraron una disminución de la presión sistólica del ventrículo derecho y la hipertrofia del ventrículo derecho en comparación con los ratones de tipo salvaje, lo que sugiere un papel crucial de ADAMTS-8 en el desarrollo de HAP [119]. La adición de ADAMTS-8 recombinante a las CE de la arteria pulmonar pareció ejercer un papel proinflamatorio y proapoptótico [119], similar a sus efectos sobre las líneas celulares de carcinoma nasofaríngeo [167]. Estos datos sugieren similitudes potenciales entre la función de ADAMTS-8 en PAH y en cáncer. Dado que ADAMTS-8 también se expresa en el corazón, un modelo de knockout condicional con deleción específica de cardiomiocitos de Adamts8 (Adamts8 ΔαMHC ) se generó [119]. Estos ratones mostraron una disminución de la hipertrofia cardíaca, fibrosis y disfunción del ventrículo derecho en respuesta a la hipoxia.

En conjunto, estos resultados implican a ADAMTS-8 en el desarrollo de HAP y potencialmente a otros fenotipos cardiovasculares, pero se necesitan más estudios para caracterizar el repertorio, el mecanismo de acción y la regulación del sustrato de ADAMTS-8.

2.2.5. ADAMTS-9 en el desarrollo del corazón

Desde el punto de vista evolutivo, ADAMTS-9 parece ser el miembro más antiguo de la familia, sobre la base de su alta homología con las proteasas de nematodos y moscas de la fruta, denominadas Gon-1 y Adamts-A, respectivamente [72,168-170]. También es el miembro más grande de la familia ADAMTS, que comprende 14 repeticiones TSR y un dominio tipo Gon-1 en el extremo C-terminal (tabla 1).

Adamts9 los ratones knockout no sobrevivieron después de los 7,5 días de gestación por razones desconocidas, pero posiblemente debido al importante papel de ADAMTS-9 en la formación y función de los cilios primarios [171,172]. Los ratones knockout heterocigotos mostraron una penetrancia variable de anomalías cardíacas que afectaban al miocardio, las válvulas mitrales, las válvulas aórticas y la aorta proximal, asociadas con un exceso de versicano [120], lo que sugiere que esta enzima está implicada en el desarrollo del corazón (tabla 2).

En un estudio de la expresión génica asociada con la ruptura del AAA, se compararon los tejidos aórticos de la reparación de emergencia de un AAA roto con el tejido de la cirugía electiva. Esto identificó un conjunto de 5 genes expresados ​​en fibroblastos exclusivamente regulados positivamente en AAA, que incluyen ADAMTS9 [173].

3. ADAMTS-7 en la enfermedad de las arterias coronarias

ADAMTS-7 es un objetivo terapéutico potencial en la aterosclerosis y enfermedades asociadas como la CAD.La evidencia de un papel perjudicial se ha acumulado durante la última década e incluye 1) aterosclerosis reducida tras la ablación de la Adamts7 gen en ratones (tabla 2) 2) GWAS que muestran una asociación de ADAMTS7 SNP con CAD y 3) detección inmunohistoquímica de ADAMTS-7 en placas ateroscleróticas humanas.

Nocaut de Adamts7 sobre un fondo aterosclerótico reducido el área total de lesión aterosclerótica en la aorta de Adamts7 −/− /ApoE - / - ratones en un 62% (machos) y un 54% (hembras) en comparación con los controles de los compañeros de camada. En Adamts7 −/− /Ldlr - / - ratones, las reducciones fueron del 37% y 52%, respectivamente [116]. Estos hallazgos sugieren que la inhibición farmacológica de la actividad de ADAMTS-7 podría ralentizar la progresión de la aterosclerosis. Adamts7 Los ratones - / - también mostraron una respuesta alterada de las CMLV a la lesión del alambre arterial [116,117]. Mostraron una formación de neoíntima muy reducida tras la lesión vascular, que se había visto previamente en ratas sobre Adamts7 derribo con ARNip en un modelo de lesión con balón [118]. Utilizando el mismo modelo, se observó el efecto contrario cuando se sobreexpresó ADAMTS-7 [118]. Estos efectos de ADAMTS-7 en VSMC en vivo de acuerdo con los hallazgos in vitro [116–118,174].

GWAS ha demostrado que los SNP en el ADAMTS7 locus se asocian con CAD [174]. El SNP que se cree que causa la asociación es rs3825807, de los cuales el alelo G se asocia con un riesgo reducido de CAD. Provoca una sustitución de serina a prolina en la posición 214 del prodominio de ADAMTS-7. La prolina se encuentra cerca de motivos de reconocimiento de proproteína convertasas de tipo subtilisina, como furina y PCSK6, que activan ADAMTS-7 mediante la eliminación proteolítica del prodominio inhibidor. Se demostró que la prolina dificulta la eliminación del prodominio, lo que en consecuencia reduce la activación de ADAMTS-7 [174] y potencialmente media el riesgo reducido de EAC asociado con el alelo G. CMLV del genotipo G / G para rs3825807 también migró menos in vitro en comparación con el genotipo A / A.

La inmunohistoquímica de las placas ateroscleróticas humanas identificó la proteína ADAMTS-7 [174,175]. En las placas carotídeas, los niveles de ADAMTS-7 aumentaron en pacientes con síntomas cerebrovasculares en comparación con pacientes sin estos síntomas y los niveles altos también se correlacionaron con un mayor riesgo de eventos cardiovasculares posoperatorios [175].

Varios in vitro Se han informado sustratos de ADAMTS-7 en la literatura, pero no se han establecido vínculos claros con la aterosclerosis y el comportamiento de las CMLV [117,176,177]. Se utilizó el método basado en espectrometría de masas de etiquetado isotópico de amina terminal de subestados (TAILS) para identificar sustratos de ECM potenciales, que identificaron la proteína de unión de TGF-β latente 4 (LTBP4) como sustrato [178]. LTBP4 es un componente de microfibrillas / fibras elásticas en el pulmón y los vasos sanguíneos grandes y también se coexpresa con ADAMTS-7 en el corazón [179,180]. Se une a varias proteínas ECM, incluidas fibrilina-1, fibulina-4 y fibulina-5, que son esenciales para la formación de fibras elásticas en los vasos sanguíneos grandes [179,181,182]. La proteólisis de LTBP4 por ADAMTS-7 probablemente afecte este proceso, pero esto queda por investigar. en vivo. La importancia de la proteólisis de LTBP4 por ADAMTS-7 para la aterosclerosis tampoco está clara en la actualidad. Sin embargo, un informe reciente mostró que LTBP4 El gen se expresó de forma diferencial entre las placas de pacientes sintomáticos y asintomáticos [183], lo que sugiere que LTBP4 puede afectar la composición de las placas ateroscleróticas.

Mientras que varios otros miembros de la familia ADAMTS están regulados por el inhibidor de metaloproteasas endógeno TIMP-3, ADAMTS-7 es más susceptible a la inhibición por TIMP-4, que inhibió ADAMTS-7 de manera eficiente a concentraciones nanomolares bajas [178]. Tanto TIMP-4 como ADAMTS-7 tienen una distribución tisular restringida con una expresión particularmente abundante en tejidos cardiovasculares adultos [116,184].

En resumen, ADAMTS-7 es una diana terapéutica potencial en la EAC y enfermedades relacionadas que resultan de la aterosclerosis, pero se necesita más investigación para validarlo como diana y permitir una mejor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados.

4. ADAMTS-13, púrpura trombocitopénica trombótica y accidente cerebrovascular

ADAMTS-13 circula en la sangre a una concentración de aproximadamente 6 nM, donde recorta los multímeros del FvW recién secretados que, de otro modo, serían demasiado trombogénicos [185] (figura 1).a). La actividad de ADAMTS-13 muy baja (menos del 10%) causa la enfermedad TTP y la actividad de ADAMTS-13 moderadamente baja se asocia con un accidente cerebrovascular isquémico, que también es una característica de la TTP. En la PTT, los multímeros del FvW que son demasiado largos se agregan espontáneamente a las plaquetas en ausencia de daño endotelial [186]. La PTT es una enfermedad rara que pone en peligro la vida y que se presenta con mayor frecuencia en adultos jóvenes o de mediana edad previamente sanos, con una incidencia anual de 6 por millón en el Reino Unido [187,188]. Muestran anemia hemolítica microangiopática grave (MAHA), trombocitopenia grave y daño de órganos diana. Los órganos más comúnmente afectados son el corazón, el cerebro, los riñones y el tracto gastrointestinal [189]. El MAHA es el resultado de los microtombos que ocluyen los pequeños vasos y dañan los glóbulos rojos, mientras que la trombocitopenia severa es causada por el consumo de las plaquetas que quedan atrapadas en los microtrombos. El daño de los órganos terminales resulta de la oclusión de los pequeños vasos que oxigenan los órganos [188]. En una pequeña minoría de pacientes con PTT, la actividad de ADAMTS-13 es baja debido a mutaciones heredadas en la región codificante del ADAMTS13 gen [189]. La forma más común de PTT es la PTT inmunomediada (iTTP), que involucra autoanticuerpos contra ADAMTS-13, que eliminan rápidamente la enzima de la circulación e inhiben su actividad al evitar la unión a su sustrato VWF [190]. Los autoanticuerpos que se dirigen a los dominios N-terminales hasta el dominio Sp pueden ser inhibidores, en consonancia con el descubrimiento de varios exositos en estos dominios [190-195]. El tratamiento de iTTP actualmente consiste en intercambio de plasma (PEX) para eliminar los autoanticuerpos patógenos y proporcionar ADAMTS-13, junto con rituximab para suprimir la producción de autoanticuerpos [186,196]. PEX es fundamental y salva vidas cuando los pacientes se presentan en el hospital en una emergencia. Más recientemente, PEX también se complementa con Caplacizumab, una construcción que consta de dos anticuerpos de dominio único fusionados que se dirigen al mismo epítopo en el dominio VWF A1 y reducen la agregación plaquetaria [197]. El ADAMTS-13 recombinante se encuentra actualmente en un ensayo clínico de fase 2, en el que se utiliza para complementar PEX en pacientes con iTTP con el objetivo de acelerar la recuperación y reducir el uso de PEX (ClinicalTrials.gov: NCT03922308). Mientras que la mayoría de los agentes antitrombóticos conllevan un riesgo de hemorragia, es poco probable que esto ocurra con ADAMTS-13 recombinante debido al mecanismo único por el cual se regula su actividad. No está regulado por un inhibidor fisiológico (p. Ej., TIMP, [198]), sino por la disponibilidad limitada y condicional de exositos de VWF y enlaces escindibles. Estos normalmente están enterrados dentro del dominio globular del VWF A2 y solo se exponen cuando el dominio A2 se despliega ante un esfuerzo de cizallamiento elevado en la circulación [199-201]. El VWF ultralargo sufre un esfuerzo de cizallamiento elevado cuando sale del endotelio y entra a la circulación, lo que provoca la proteólisis por ADAMTS-13, que reduce el tamaño del multímero y, por lo tanto, reduce la fuerza de tracción ejercida sobre la molécula, evitando un mayor despliegue y escisión del VWF A2. dominios [199,202]. VWF es el único sustrato informado de ADAMTS-13. La especificidad de la proteasa es conferida por exositos en varios dominios ADAMTS-13 que unen exositos complementarios en el dominio C-terminal del VWF A2 al enlace escindible [193,194,203-205]. Además, los subsitios en el dominio Mp acomodan las cadenas laterales del FvW a ambos lados del enlace escindible y se suman a la especificidad general de la enzima [204,206,207].

Mientras que los niveles de actividad de ADAMTS-13 inferiores al 10% pueden causar TTP, los niveles bajos que caen dentro del rango normal (cuartil más bajo) se asocian con un mayor riesgo de desarrollar un accidente cerebrovascular isquémico [208-210]. En pacientes que presentan lesión cerebral isquémica aguda, la relación entre los niveles de antígeno del FvW y la actividad de ADAMTS-13 (FvW: Ag / ADAMTS-13Ac) predice la mortalidad y se asocia con un impacto en la función cerebral de los supervivientes [211]. Además, en los pacientes con PTT que se han recuperado y están en remisión, los niveles más bajos de actividad de ADAMTS13 después de la recuperación se asocian con un accidente cerebrovascular [212]. En modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico, la administración de ADAMTS-13 recombinante después de un accidente cerebrovascular parece ser beneficiosa [213,214].

5. Otros miembros de la familia ADAMTS

5.1. La procolagenasa ADAMTS-2 en la reparación del miocardio

ADAMTS-2 es la principal enzima que escinde el propéptido N del procolágeno tipo I, lo que permite el ensamblaje de trímeros de colágeno en fibrillas / fibras [215]. Aunque esto se ha estudiado principalmente en la piel, también puede ocurrir en otros tejidos. Por ejemplo, el análisis de corazones de pacientes cardiomiopáticos mostró una regulación positiva de ADAMTS2, lo que puede reflejar el importante papel del colágeno en la reparación y cicatrización del miocardio. El colágeno que se deposita para "reparar" el daño miocárdico requiere la eliminación del prodominio por parte de ADAMTS-2 para que se formen las fibras de colágeno. Es probable que el aumento de la expresión de colágeno requiera un aumento de la expresión de ADAMTS-2. Esto también puede explicar la alteración Adamts2 expresión en ratones tratados con isoproterenol, que induce miopatía e hipertrofia cardíacas [216] (tabla 2). En undamts2 En ratones nulos, se intensificaron los efectos perjudiciales de la sobrecarga de presión sobre el corazón [110], posiblemente debido a mecanismos de reparación alterados que involucran al colágeno.

5.2. ADAMTS-6 en el desarrollo cardíaco y la duración del QRS

ADAMTS6 Se ha detectado ARNm en el corazón del ratón, específicamente en el tracto de salida, las válvulas, las aurículas y el miocardio ventricular [115]. Se desconoce la función fisiológica de ADAMTS-6, pero in vitro los estudios sugieren que puede estar relacionado con el de las microfibrillas de fibrilina-1 y las adherencias focales [22]. Es importante destacar que ADAMTS-6 ha sido implicado en la biología cardíaca por un GWAS, que encontró que dos ADAMTS6 variantes sin sentido (S90 L y R603 W) se asociaron con la duración del intervalo QRS del electrocardiograma [115], que refleja la despolarización del ventrículo cardíaco. Un QRS prolongado es un predictor de mortalidad tanto en la población general como en pacientes afectados por enfermedades cardiovasculares [217-219]. Las variantes de sentido erróneo S90 L en el prodominio y R603 W en el primer dominio similar a TSP-1 alteran gravemente la secreción de proteínas [115]. Curiosamente, S90 L se asoció con QRS más largo y R603 W con una duración de QRS más corta. En personas de ascendencia europea, aproximadamente 1/500 es heterocigoto para la variante S90 L, mientras que R603 W es raro en personas de ascendencia europea, pero es común en personas de ascendencia africana, donde aproximadamente 1/70 es heterocigoto (https: // gnomad .broadinstitute.org /). Sin embargo, ambas variantes pueden ser patógenas en un estado homocigoto y / o funcionar como factores de riesgo de enfermedad cardíaca en forma heterocigótica. Un papel cardíaco para ADAMTS-6 también está en línea con los defectos cardíacos congénitos fatales de ratones homocigotos para una mutación nula en Adamts6, que mueren pre / perinatalmente [115]. Sus defectos cardíacos embrionarios comprenden el ventrículo derecho de doble salida, un defecto del tabique auriculoventricular y la hipertrofia ventricular. Curiosamente, los ratones hemicigóticos para la mutación nula son viables y no muestran defectos cardíacos estructurales, pero sus ventrículos expresan niveles bajos de proteína conexina-43, la principal proteína de unión gap miocárdica en el corazón humano y de ratón. Los niveles reducidos de conexina-43 parecen tener una causa postranscripcional, ya que los niveles de ARNm del gen correspondiente (Gja1) no se vieron afectados [115]. En resumen, estos hallazgos sugieren que ADAMTS-6 puede desempeñar un papel en el desarrollo del corazón y en la regulación de la despolarización ventricular mediada por la unión gap.

5.3. ADAMTS-10 y manifestaciones cardiovasculares de WMS

Mutaciones en ADAMTS10 causan una forma autosómica recesiva de WMS [220-222]. El WMS es un trastorno hereditario poco común de los tejidos conectivos que se caracteriza por baja estatura, braquidactilia, rigidez de las articulaciones, cráneo ancho, defectos cardíacos y una variedad de anomalías oculares [222,223]. Tres distintos ADAMTS10 Se identificaron mutaciones en dos familias consanguíneas y en un caso esporádico de WMS, incluida una mutación sin sentido y dos mutaciones de empalme [220]. Entre las características clínicas de los pacientes con WMS que tienen ADAMTS10 las mutaciones fueron estenosis aórtica y pulmonar con válvulas displásicas y miocardiopatía hipertrófica obstructiva [220]. El síndrome de Weil-Marchesani también es causado por mutaciones en la fibrilina-1 (FBN1) y LTBP2, lo que implica a ADAMTS-10 en la biología de las microfibrillas de fibrilina-1 [21]. Las microfibrillas de fibrilina-1 son conjuntos de ECM que son esenciales para la formación de fibras elásticas en los vasos sanguíneos, pulmones, piel, ligamentos y otros tejidos elásticos. También regulan la biodisponibilidad de los factores de crecimiento de la superfamilia de TGF-β y proteína morfogenética ósea (BMP) [224]. Posteriormente se confirmó que ADAMTS-10 regula la función de las microfibrillas de fibrilina y se une a la fibrilina-1 en dos sitios que coinciden con las mutaciones de fibrilina-1 en el WMS [225]. También co-localiza con fibrilina-1 en tejidos y acelera el ensamblaje de microfibrillas en cultivos de fibroblastos [226]. Características oculares en WMS causadas por ADAMTS10 las mutaciones pueden deberse a la reducción de la escisión de la fibrilina-2 [227]. Las mutaciones en otros genes implicados en la biología de las microfibrillas de fibrilina causan los trastornos relacionados síndrome similar a WMS (ADAMTS17) y displasia geleofísica (LTBP3, ADAMTSL2, fibrilina 1) [228].

5.4. ADAMTS-16, un potencial regulador de la presión arterial

Actualmente se desconoce la función de ADAMTS-16, con informes contradictorios sobre su posible participación en la fertilidad masculina y la determinación del sexo [229,230]. Hasta ahora, el único sustrato descrito es la fibronectina [231]. ADAMTS-16 se ha identificado como un gen de rasgo cuantitativo (QTG) para la presión arterial en humanos [232,233] y ratas [234]. Para investigar la función cardiovascular de ADAMTS-16, Adamts16 Se han generado ratas knockout [121] (tabla 2). Estas ratas muestran una presión arterial sistólica más baja, una menor rigidez arterial y un grosor de la túnica media en comparación con las ratas de tipo salvaje, lo que sugiere una participación de ADAMTS-16 en la regulación de la hemodinámica [121]. Es más, Adamts16 las ratas knock-out sobrevivieron más tiempo, aunque exhibieron anomalías renales [121]. Se necesitan más datos para determinar un posible papel de ADAMTS-16 en la regulación de la presión arterial.

5.5. ADAMTS-19 en la valvulopatía progresiva

Un estudio reciente de enfermedad valvular de inicio temprano identificó mutaciones en ADAMTS19 por secuenciación del exoma completo. Cuatro pacientes de dos familias consanguíneas portaban mutaciones homocigotas en ADAMTS19 causando una gran deleción de múltiples exones en una familia y una proteína ADAMTS-19 truncada en la otra familia [122]. Para confirmar la causalidad, Adamts19 Se generaron ratones knockout (tabla 2). De los homocigotos Adamts19 En ratones knockout, el 38% mostró insuficiencia de la válvula aórtica y / o estenosis aórtica a los tres meses de edad, lo que confirma un papel importante de ADAMTS-19 en la fisiología de la válvula aórtica. Análisis de expresión de lacZ en Adamts19 ratones knockout mostraron una fuerte expresión localizada de lacZ por las células intersticiales valvulares en las cuatro válvulas alrededor de E14.5 y la expresión de estas células hasta la edad adulta. El análisis ultraestructural del ECM sugirió alteraciones en la organización del ECM, incluida la acumulación de PG. La observación de la acumulación de PG plantea la cuestión de si esto es secundario a una función celular / fisiología de la válvula alterada o un recambio reducido de PG por ADAMTS-19.

6. Orientación terapéutica de ADAMTS

Los inhibidores de ADAMTS podrían potencialmente usarse terapéuticamente para reducir la actividad enzimática que contribuye o agrava la enfermedad cardiovascular (por ejemplo, para ADAMTS-7). Sin embargo, ha demostrado ser un desafío desarrollar inhibidores terapéuticos de metaloproteinasas con suficiente selectividad para prevenir los efectos secundarios causados ​​por la inhibición cruzada de metaloproteinasas relacionadas [235]. Los inhibidores selectivos pueden ser anticuerpos monoclonales [235] o moléculas pequeñas, teniendo estas últimas la clara ventaja de que pueden administrarse por vía oral. Los inhibidores selectivos de moléculas pequeñas se pueden diseñar sobre la base de la estructura tridimensional disponible de la enzima diana o se pueden identificar mediante selección de alto rendimiento (HTS) de grandes bibliotecas de compuestos. Para seleccionar bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de su potencial inhibidor, se necesitan enzimas purificadas y un ensayo de actividad de alto rendimiento. Normalmente, los ensayos de actividad de alto rendimiento para las proteasas implican la tecnología de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), en la que la proteólisis de un péptido pequeño genera una señal fluorescente [236]. Para ADAMTS-7, hemos desarrollado un ensayo de actividad de este tipo utilizando un péptido LTBP4 pequeño como sustrato eficiente y actualmente lo estamos convirtiendo para HTS de bibliotecas de moléculas pequeñas (manuscrito en preparación).

Por otro lado, cuando la actividad de un miembro de la familia ADAMTS ha demostrado ser beneficiosa en un determinado contexto patológico, pueden contemplarse los denominados potenciadores o activadores. Por ejemplo, se han informado anticuerpos monoclonales capaces de aumentar la actividad catalítica de ADAMTS-13 [237]. Otro enfoque innovador para aumentar la actividad de ADAMTS puede implicar interferir con la endocitosis mediada por LRP-1. Recientemente hemos informado de un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse a ADAMTS-5 y bloquear su unión a LRP-1 sin interferir con su actividad proteoglicanasa [238], lo que resulta en la acumulación de ADAMTS-5 activo en el medio extracelular. Dicho anticuerpo puede usarse para rescatar la actividad de proteoglicanasa de ADAMTS-5 en modelos de aterosclerosis y TAAD de ratón (tabla 2).

7. Conclusión

Los miembros de la familia ADAMTS cumplen múltiples funciones distintas en los tejidos cardiovasculares (tabla 1). Varios de ellos son importantes para la embriogénesis y homeostasis de la válvula cardíaca (figura 2), pero en general la multitud de procesos fisiológicos afectados por las proteasas de ADAMTS refleja las múltiples funciones de la ECM, como la regulación del comportamiento celular y el secuestro de una amplia gama de crecimiento celular. factores. Se ha aprendido mucho sobre las proteasas ADAMTS a partir de estudios en animales, pero se debe tener precaución al extrapolar datos de ratones a enfermedades humanas en ausencia de estudios clínicos. En este sentido, una conclusión debe estar respaldada por datos recopilados de alta calidad. in vitro, in vivo y ex vivo pero hasta ahora este objetivo se ha logrado solo para unos pocos miembros de la familia. Sin embargo, cada año se publican nuevos y emocionantes hallazgos, que aclaran gradualmente las funciones fisiológicas de esta fascinante familia de proteasas.


Métodos

Los datos de la proteasa

Las proteasas en P. falciparum se predijeron utilizando un enfoque de genómica comparativa y un enfoque de aprendizaje automático supervisado basado en máquinas de vectores de soporte (SVM) [1-3]. La clasificación y la anotación se realizaron de acuerdo con la nomenclatura de proteasa MEROPS, que se basa en relaciones intrínsecas evolutivas y estructurales [110].

Análisis y datos de red

El conjunto completo de asociaciones proteína-proteína para P. falciparum se extrajo de la base de datos STRING descargada [4] cada asociación entre un par de proteínas tiene una puntuación de confianza (S) que varía de 0,15 a 0,999 que se infiere de la evidencia utilizada para establecer la asociación, como la transferencia de homología, las asignaciones de la vía KEGG, sintenia cromosómica conservada, co-ocurrencia filogenética y co-ocurrencia en la literatura [111]. Este conjunto de asociaciones se visualizó en Cytoscape [112] y se convirtió en un gráfico ponderado no dirigido, donde hay un solo borde entre cualquier par de proteínas y el valor S se utiliza como peso. La red se caracterizó utilizando NetworkAnalyzer [113] y se detectaron módulos significativos utilizando MINE [114] y MCODE [115]. Los valores predeterminados se utilizaron para los tres complementos. El conjunto de proteínas directamente asociadas con las 77 proteasas en el conjunto de asociación se examinó utilizando BiNGO [116] para determinar si alguna categoría de proteínas, tal como se identifica por sus términos de Ontología de genes, estaba sobrerrepresentada. La prueba hipergeométrica se utilizó con la corrección de fecha de falso descubrimiento de Benjamini y Hochberg. Se seleccionó un nivel de significancia de 0.05.

La minería de datos ómicos

Descargamos el P. falciparum secuencia genómica y datos de anotación [18], datos de microarrays transcriptómicos [6-8], datos proteómicos de espectrometría de masas [9-12] y datos del interactoma proteína-proteína [5] para proteínas asociadas a la red de PlasmoDB, el centro de recursos del genoma de Plasmodium (http://www.plasmodb.org) [117]. Dominios / motivos conservados en P. falciparum Las secuencias se identificaron buscando en InterPro [118]. Se obtuvieron múltiples alineaciones utilizando el programa ClustalX [119] y T-coffee [120], seguido de inspección y edición manual. Los árboles filogenéticos se infirieron mediante los métodos de unión de vecinos, máxima parsimonia y máxima verosimilitud, utilizando MEGA5 [121].


Contenido

Actualmente, las proteasas se clasifican en seis grupos:

  • Serina proteasas
  • Proteasas de treonina
  • Proteasas de cisteína
  • Proteasas del ácido aspártico
  • Metaloproteasas
  • Proteasas del ácido glutámico

Las proteasas de treonina y ácido glutámico no se describieron hasta 1995 y 2004, respectivamente. El mecanismo utilizado para escindir un enlace peptídico implica hacer que un residuo de aminoácido que tenga la cisteína y treonina (peptidasas) o una molécula de agua (ácido aspártico, peptidasas de ácido metalo y glutámico) sean nucleófilos para que pueda atacar el grupo carbonilo del péptido. Una forma de producir un nucleófilo es mediante una tríada catalítica, en la que se usa un residuo de histidina para activar la serina, la cisteína o la treonina como nucleófilo.


Proteasas en la sangre - Biología

En su libro de 1996, La caja negra de Darwin, Michael Behe ​​argumentó que la cascada de coagulación de la sangre de los vertebrados era `` irreductiblemente compleja ''. Lo que el profesor Behe ​​quiere decir con esto es que todos y cada uno de los elementos de la compleja cascada de enzimas y cofactores deben estar en su lugar para la sangre. coagulación para trabajar. Dado que, según Behe, un sistema irreductiblemente complejo no puede ser producido por la selección natural darwiniana, debe haber sido producido por otra cosa. Debe haber sido diseñado.

Después de la publicación del libro de Behe, varios científicos se apresuraron a señalar que Behe ​​estaba equivocado en muchas de sus afirmaciones sobre la cascada de la coagulación de la sangre. El trabajo de Russell Doolittle y muchos otros científicos ha demostrado con bastante claridad que el sistema evolucionó mediante un proceso de duplicaciones de genes a partir de serina proteasas que alguna vez fueron enzimas digestivas. No es sorprendente que Behe ​​afirme que las muchas críticas a su trabajo son incorrectas. En agosto de 2000 publicó un ensayo en Internet:

En defensa de la Irreducible Complejidad de la Cascada de Coagulación Sanguínea.
Una respuesta a Russell Doolittle, Ken Miller y Keith Robison.

Una respuesta al intento de defensa de Behe

Como escribí en mi libro de 1999 Finding Darwin's God, el trabajo pionero de Russell Doolittle sobre la evolución de las proteínas ha demostrado que la cascada de la coagulación de la sangre podría, y de hecho fue, producida por la evolución darwiniana. La defensa del Dr. Behe ​​de su posición en sentido contrario le obliga a explicar por qué mi descripción de la evolución del sistema (págs. 152-161) no es válida. En su defensa publicada en la web, escribe que mi descripción es & Quota just-so story que no aborda ninguna de las dificultades que enfrentaría la evolución de un sistema tan intrincado.

Curiosamente, Behe ​​casi ignora mi descripción de la evolución de la coagulación sanguínea en la langosta y no refuta mi escenario para su evolución (basado, por supuesto, en el trabajo de investigación de Doolittle). Describí el sistema de la langosta en mi libro por dos razones: (1) Como el sistema de vertebrados es (según los estándares de Behe) irreductiblemente complejo, y (2) Es un sistema más simple cuya evolución paso a paso es relativamente fácil de entender. cuenta para.

Behe observa con bastante acierto que mi propia descripción de la evolución del sistema de coagulación de los vertebrados es bastante breve. una decisión, por desgracia, de mi editor en Harper-Collins (el editor del libro). No obstante, todavía tengo mi borrador original de esta sección editada, que el lector puede querer consultar. (Haga clic aquí para ver mis ideas sobre la evolución del sistema de coagulación de los vertebrados). Sin embargo, ¿con qué elementos de mi descripción, además de su esbozo, discrepa?

Behe afirma que la orientación de una proteasa, una enzima digestiva, al torrente sanguíneo es una `` situación potencialmente mortal '' y les dice a los lectores de su documento web que podemos decir cuán mortal podría ser esto al observar situaciones en las que faltan proteínas reguladoras. organismos modernos ''. En otras palabras, Behe ​​quiere que veamos qué sucede cuando las versiones actuales altamente reguladas de las proteasas de la coagulación carecen de sus factores reguladores. Sin embargo, a pesar de esta bravuconería, Behe ​​no tiene pruebas de que la orientación errónea de una proteasa inactiva al torrente sanguíneo pueda causar daño. De hecho, el descubrimiento reciente de que los genes de las proteínas anticongelantes en el pescado surgieron exactamente de tal distribución errónea de las proteasas en el torrente sanguíneo (Chen, L., DeVries, AL & amp Cheng, C.- HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3811 & shy3816 ( 1997) y Chen, L., DeVries, AL & amp Cheng, C.-HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3817 & shy3822 (1997)) sugiere que es exactamente lo contrario.

Habiendo hecho afirmaciones infundadas sobre el "peligro" de tal mutación, Behe ​​dice que sería difícil ver qué "ventaja" presentaría esto al organismo. La respuesta, por supuesto, es que proporcionaría una ligera mejora en la capacidad del organismo para coagular la sangre, y ese es el punto. El sistema de coagulación no tiene que funcionar a toda máquina de inmediato. En un vertebrado primitivo con un sistema circulatorio de baja presión, una mejora muy leve en la coagulación sería ventajosa y se vería favorecida por la selección natural.

Behe luego se pregunta cómo la proteasa circulante podría localizarse en el sitio de un coágulo, como si esto fuera una dificultad insuperable. No es. Como sugerí en mi borrador original sobre la evolución de la coagulación, un proceso bien entendido llamado mezcla de exones podría haber colocado un "dominio EGF" en la secuencia de proteasa, y el "problema" que Behe ​​desconcierta se resuelve en un instante.

Finalmente, Behe ​​enfatiza que el problema real no es generar un coágulo, es "regular" ese coágulo mediante un inhibidor de la proteasa para que no se vuelva destructivo. Pero eso tampoco es un problema para la evolución. Como de costumbre, Behe ​​imagina una proteasa de coagulación que es tan poderosa como las proteasas completamente evolucionadas en los vertebrados modernos. Sin embargo, recuerde que este es el mismo tipo que se preocupó hace un momento o dos de que la proteasa no sería lo suficientemente fuerte como para coagularse de manera efectiva. Quiere tener las dos cosas. La respuesta a su objeción es exactamente lo que escribí en el borrador:

& quot. un sistema de coagulación primitivo, adecuado para un animal con presión arterial baja y flujo sanguíneo mínimo, no tiene la capacidad de coagulación para presentar este tipo de amenaza. Pero tan pronto como el coágulo ocasional se vuelve lo suficientemente grande como para presentar riesgos para la salud, la selección natural favorecería la evolución de los sistemas para mantener la formación de coágulos bajo control. ¿Y de dónde vendrían estos sistemas? A partir de proteínas preexistentes, por supuesto, duplicadas y modificadas. Los tejidos del cuerpo producen una proteína conocida como alfa-1-antitripsina que se une al sitio activo de las serina proteasas que se encuentran en los tejidos y los mantiene bajo control. Entonces, tan pronto como los sistemas de coagulación se volvieron lo suficientemente fuertes, la duplicación de genes habría presentado a la selección natural un inhibidor de proteasa funcional que luego podría evolucionar a antitrombina, un inhibidor similar que hoy bloquea la acción de la proteasa primaria que escinde el fibrinógeno, la trombina ''.

En resumen, ninguno de los puntos planteados por Behe ​​es adecuado para explicar por qué el sistema de coagulación de los vertebrados no pudo haber evolucionado. Además, como ha demostrado claramente el trabajo de Doolittle, la hipótesis de la evolución hace predicciones comprobables con respecto a las secuencias de ADN de las proteínas de la coagulación, y estas predicciones han resultado ser correctas una y otra vez.

¿Por qué el "desafío bioquímico a la evolución" de Behe ​​ha recibido tan poco apoyo dentro de la comunidad científica? Sugeriría que la razón es simple. Su hipótesis está equivocada. Los complejos sistemas bioquímicos de los organismos vivos, incluida la cascada de coagulación de los vertebrados, son completamente comprensibles en términos de la evolución darwiniana.

Kenneth R. Miller
Profesor de biología
Universidad de Brown
Providence, RI 02912


PAR y proteasas: cooperación en la progresión del cáncer

Factor tisular

TF es una glicoproteína de membrana presente en las células subendoteliales que inicia la coagulación sanguínea. La ruptura del endotelio expone TF a factores de coagulación presentes en el torrente sanguíneo. TF se une al FVII y provoca su activación (FVIIa). El complejo TF / FVIIa puede activar adicionalmente FX (FXa), que junto con su cofactor FVa, genera trombina (FIIa) a partir de protrombina por conversión proteolítica. La trombina inicia la coagulación mediante la activación plaquetaria y la conversión de fibrina a partir del fibrinógeno, lo que da como resultado una coagulación sanguínea eficaz [83].

El TF es también el procoagulante más destacado de las células cancerosas y es un determinante de la progresión tumoral [97]. Se ha descubierto TF en la superficie de distintas células malignas, vasculatura tumoral y microambiente tumoral: células madre, macrófagos, CE y miofibroblastos [9, 10, 40, revisado en 98, 99]. También se reconoce ampliamente que la expresión de TF se correlaciona con una mayor invasividad y un estadio clínico más alto de la enfermedad maligna y se asocia con un pronóstico general deficiente [revisado en 40, 97]. Las células tumorales expresan de forma endógena TF de forma constitutiva, o inducen la producción de TF en su entorno mediante la producción de sustancias solubles capaces de provocar que los monocitos y las CE lo expresen [98]. La expresión de TF se asocia con eventos cancerígenos durante la transformación oncogénica, ya que existe una creciente evidencia de que las mutaciones de los protooncogenes y genes supresores de tumores influyen en su expresión [40]. En el cáncer colorrectal, la K-ras y p53 las mutaciones que provocan las vías de señalización mediadas por MAPK y PI3 dan como resultado una mayor expresión de TF [100]. En el cáncer de pulmón, se hicieron observaciones similares para PTEN y p53 mutaciones [101]. También se ha demostrado que la expresión de TF está modulada en otros cánceres por formas mutantes constitutivamente activas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII) en células de glioma y vulva, así como quinasas de la familia Src, producción de TGF-β e hipoxia [40].

Existen numerosos mecanismos por los cuales el FT afecta la biología del cáncer. Primero, tras la activación por los factores VII y X y la creación de complejos con ellos (TF / VIIa, TF / Xa, TF / VIIa / Xa), TF promueve la señalización mediada por PAR-1 y PAR-2 ​​responsable de la respuesta proliferativa del cáncer. células [38, 97, 102]. Además, TF puede señalar directamente a través de su cola citoplasmática a través de Rac1 y p38 y remodelación citoesquelética [103]. Además, una isoforma de TF empalmada alternativamente (asTF) también afecta el crecimiento tumoral independientemente de la escisión de VIIa y PARs, a través de la activación de las integrinas α6β1 y αVβ3 sobre las CE para promover la angiogénesis [97, 104]. El asTF humano promovió el crecimiento tumoral y la angiogénesis en el cáncer de páncreas [105], pero estuvo inactivo en el mecanismo de metástasis dependiente de coagulantes en un modelo de cáncer de mama [106].

En modelos experimentales y clínicos, las células cancerosas que expresan TF tenían una mayor tendencia a hacer metástasis en comparación con las células deficientes en TF [106]. Los efectos de TF sobre la metástasis pueden estar mediados por mecanismos que dependen o son independientes de la activación de la coagulación, es decir, a través de la función de señalización de TF. Es probable que el factor tisular promueva el potencial proliferativo e infiltrativo en lugar de las propiedades adhesivas de las células metastásicas [30, 68, 107]. También hay pruebas de que el FT desempeña un papel en la intravasación de las células tumorales, que es el primer paso en la diseminación de las células malignas [108].

Aunque TF puede promover la activación tanto de PAR-1 como de PAR-2, parece que TF o el complejo TF / FVIIa normalmente desencadena la señalización de PAR-2 ​​pero no de PAR-1 en las células cancerosas [38, 67-69, 99, 102, 109, 110]. En modelos experimentales de cáncer de mama, se observó inhibición del crecimiento tumoral y angiogénesis después de bloquear la función de señalización del TF pero no su actividad de coagulación, y después de la inhibición de PAR-2, pero no de la actividad de PAR-1 [109, 110]. Se observó un fenotipo similar en el glioblastoma (GBM), que es el tumor cerebral primario más agresivo que se caracteriza por una neovascularización intensa, hiperplasia e hipercoagulación de la CE [73]. Los experimentos con líneas celulares GBM determinaron que había expresión de PAR-1 y PAR-2 ​​en estas células, así como en las paredes de los vasos vasculares dentro del área invasiva de los tumores cerebrales [31, 72, 73]. Sin embargo, solo la estimulación de la vía PAR-2 ​​condujo a una mayor secreción de VEGF e IL-8, lo que sugiere que la señalización de PAR-2 ​​/ MAPK / ERK1 / 2, pero no PAR-1 / PI3K / Akt, regula la angiogénesis en GBM. Es de destacar que en las células GBM existe una correlación entre TF y expresión de PAR-2 ​​[72]. También hay evidencia de que la hipoxia regula al alza la expresión de PAR-2 ​​en tumores cerebrales. Hay un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la expresión de PAR-2 ​​en CE microvasculares hipóxicas frente a normóxicas de GBM, lo que da como resultado una regulación positiva de HB-EGF y un fenotipo proangiogénico [111]. Poole et al. han demostrado recientemente que PAR-2, que es un factor central en la inflamación y el dolor neurogénico, mantiene la inflamación a través de un nuevo mecanismo de acoplamiento de canales TRP. Al generar lípidos bioactivos como 5 ′, 6′-EET y 12 (S) -HETE, los efectos proinflamatorios de PAR-2 ​​se mantienen a través de señales de Ca 2+ dependientes de TRPV4 [112]. Esto puede resultar extremadamente relevante en este contexto, ya que se ha demostrado que TRPV4 afecta la angiogénesis en múltiples niveles [113, 114]. Por último, la señalización inducida por EGFR en las células de glioma estimula la expresión de TF, FVII y PAR-2, lo que aumenta la activación de PAR-2 ​​mediada por TF / VIIa en las células cancerosas [115], y las células cancerosas pueden secretar aFVII que puede actuar solo para activar PAR-2 ​​[116].

La activación de PAR-2 ​​mediada por TF / VIIa da como resultado un aumento transitorio en los niveles de Ca 2+ y desencadena la señalización intracelular que depende de la familia MAPK (p44 / 42, p38, JNK), PI3, quinasas similares a Src, Jak / STAT , Rutas de Rho GTPasas, Rac1 y Cdc42 [40, 80, 102]. Además, se han observado niveles elevados de proteínas proangiogénicas, como VEGF, Cyr61, VEGF-C, CTGF, CXCL1, IL8 y moduladores inmunitarios, como GM-CSF (o CSF2) y M-CSF (o CSF1). [38, 68, 73, 97]. La eficacia de la activación de mediadores angiogénicos mediada por TF / VIIa / PAR-2 ​​es mayor que la inducida por la señalización de PAR-1 [38]. La señalización de PAR-2 ​​activada por TF también da como resultado un aumento de la expresión de MMP-9, que se correlaciona positivamente con la capacidad de invasión de las células tumorales de mama MCF-7 [70] y puede estar relacionada con la respuesta de MMP-9 al metabolismo del ácido araquidónico [117]. Se informó que las interacciones TF / FVIIa / PAR-2 ​​son críticas para la migración e invasión de células de cáncer de mama MDA-MB-231 hacia el medio acondicionado con fibroblastos NIH-3T3 [68]. Por lo tanto, la activación de PAR-2 ​​inducida por TF / VIIa facilita la proliferación y supervivencia, así como el potencial metastásico de las células cancerosas [50, 68, 70].

En las células de cáncer de mama, la activación de PAR-2 ​​también puede ser inducida por FXa así como por los complejos TF / FXa o TF / FVIIa / FXa. La posterior fosforilación de MAPK o activación de Erk1 / 2 estimula la migración e invasión de células cancerosas [67, 68].

En los tumores con niveles elevados de TF (estado protrombótico), el mecanismo metastásico predominante es el resultado de la actividad de coagulación del TF en lugar de su capacidad de señalización inherente [109]. La actividad procoagulante del TF conduce a la generación de trombina, activación plaquetaria y protección dependiente de plaquetas de las células asesinas naturales, así como a la formación de fibrina y al reclutamiento de monocitos / macrófagos, todo lo cual influye en las propiedades angiogénicas y metastásicas del tumor [6, 97, 106 , 118]. Estudios de Yokota et al. [106] proporcionó una nueva perspectiva sobre la metástasis dependiente de TF mediada por trombina basada en un modelo de ratón hipertrombótico con deficiencia de trombomodulina (ratones TM Pro). Las metástasis de cáncer de mama dependientes de TF, pero independientes de la vía de contacto, se asociaron con hiperactividad de las plaquetas y formación de agregados plaquetas-leucocitos. La deleción genética de la glicoproteína plaquetaria Ibα (GPIbα) y el leucocito CD11b excluyó a estos receptores de las metástasis dependientes de plaquetas. Además, el bloqueo de PAR-1 tanto del huésped como del tumor disminuyó significativamente el potencial metastásico de las células tumorales. Se obtuvieron resultados similares en modelos de melanoma, lo que confirma la contribución de PAR-1 al melanoma y las metástasis mamarias [97].

Trombina

La generación de trombina (IIa) es el paso central en la coagulación sanguínea. Como se mencionó anteriormente, la trombina escinde el fibrinógeno para producir fibrina y activa las plaquetas sanguíneas, lo que da como resultado la formación de un tapón de sangre eficaz después de la lesión de los vasos. Sin embargo, la trombina enzimáticamente activa también se detecta en varios tipos de tumores malignos extirpados quirúrgicamente (p. Ej., Cáncer de pulmón microcítico, cáncer renal, ovárico, laríngeo, pancreático y gástrico, así como melanoma) [11, 98, 119, 120]. .

La presencia de TF en las células tumorales contribuye a la generación de trombina en el microambiente tumoral independientemente de la coagulación sanguínea.Múltiples dianas de trombina (p. Ej., Plaquetas sanguíneas y activación de CE, generación de fibrina) contribuyen a la progresión del cáncer al proporcionar una matriz para nuevos vasos y colonias de células tumorales metastásicas [118, 121, 122]. Los primeros informes de una función novedosa de la trombina en las metástasis de células tumorales se publicaron a principios de la década de 1990 [123-128]. Cuando se incubó con células de carcinoma W256, la α-trombina produjo un aumento del 50-300% en la adhesión a las células endoteliales aórticas de rata y fibronectina [123-127]. Los precursores y análogos de la trombina, como protrombina, protrombina-1, mesil-trombina, exo-sitio-trombina, DFP-trombina y nitrotrombina, imitaron el efecto de la α-trombina [123-127]. Curiosamente, la α-trombina junto con sus inhibidores, a saber, hirudina o complejo antitrombina III-heparina, no fue tan eficaz para mejorar la adhesión de las células tumorales como la forma nativa de la enzima [123-127]. Los datos indican un nuevo mecanismo de interacción de la trombina en la metástasis de células tumorales que no es proteolítico. Además, los ratones trasplantados con células de cáncer de ovario humano (SKOV3) demostraron un tamaño tumoral elevado y una tasa de supervivencia reducida cuando se trataron con trombina [122]. Queda por determinar si la señalización de la trombina funciona de forma sinérgica con las vías de metabolización del araquidonato que estimulan el crecimiento del cáncer de ovario [129]. Además de su papel fundamental en la vía de la coagulación, la trombina se considera el principal activador de PAR-1 y PAR-4. Por tanto, muchas respuestas celulares, incluidas las observadas en las células cancerosas, como el reordenamiento citoesquelético [130], son dependientes de la trombina. La evidencia de un papel crucial de la generación de trombina dependiente de TF y la activación de PAR-4 plaquetaria mediada por trombina en la progresión del cáncer y la metástasis proviene de estudios realizados en ratones modificados genéticamente. Las células estromales y tumorales están involucradas en múltiples etapas de la tumorigénesis, incluida la proliferación, angiogénesis, invasión y supervivencia. Los animales sin plaquetas, PAR-4 o fibrinógeno estaban protegidos de la metástasis [118, 121, 122]. El tratamiento de las células del melanoma B16a con α-trombina resultó en un número significativamente mayor de colonias pulmonares metastásicas [123-127]. La protrombina, la ɣ-trombina y la trombina de ratón, pero no la nitrotrombina, pudieron imitar el efecto de la α-trombina de aumentar el potencial de colonización pulmonar de las células tumorales [123-127]. La administración de trombina por vía intravenosa con células de cáncer de colon (CT26) y células de melanoma (B16a) aumentó de 4 a 413 veces las metástasis pulmonares murinas [131]. El potencial metastásico se redujo con la hirudina, un inhibidor específico de la trombina [4, 122, 132].

Trombina / PAR-1 en fibroblastos

Durante el proceso de coagulación, la conversión de protrombina en trombina y su actividad posterior conduce a la escisión del fibrinógeno para formar fibrina. Los depósitos de fibrina en el microambiente del tumor son el depósito de trombina que se libera tras la degradación de la fibrina por la plasmina [133]. los in vitro Los experimentos proporcionaron pruebas de que las células estromales de tumores malignos, como los fibroblastos, expresan niveles elevados de PAR-1 y PAR-2 ​​en comparación con lesiones benignas o tejidos normales en los que no se observa dicha expresión [74]. La señalización crónica mediada por PAR-1 en los fibroblastos NIH-3T3 puede provocar una transformación del crecimiento [85]. Según se informa, la expresión de PAR-1 en el microambiente impulsa la progresión e induce la quimiorresistencia del cáncer de páncreas [134] regulando la migración de monocitos y la producción de quimiocinas dependiente de fibroblastos.

Trombina / PAR-1 en células endoteliales

Las células endoteliales son otro objetivo de las interacciones trombina / PAR. La activación de PAR-1 mediada por trombina regula las vías inflamatorias que también están implicadas en la progresión del cáncer. Mayor producción de lípidos y expresión de PAF, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α y moléculas adhesivas (E-selectina, P-selectina, molécula de adhesión intracelular 1 y molécula de adhesión celular vascular 1, integrinas) promueve la proliferación de CE, el reclutamiento de plaquetas y la unión de células malignas [4, 5, 128, 135-138]. La inhibición de la actividad de PAR-1 inhibe el crecimiento de EC aumentando la fracción sub-G0 / G1, reduciendo así el porcentaje de células en la fase S [139]. Además, la activación de la trombina / PAR-1 regula la función de barrera entre las CE modulando las uniones adherentes (AJ) [140]. El aumento de la permeabilidad de la barrera endotelial en respuesta a las acciones asociadas a la trombina / PAR se debe a la modificación de VE-cadherina, p120 y β-catenina a través de la señalización dependiente de la proteína quinasa C [138, 140]. La disfunción de la barrera endotelial genera una matriz proangiogénica temporal que es la base para la activación de la cascada trombina / PAR / IP3 / Ca 2+ / MAPK y las respuestas celulares subsiguientes [98]. La regulación al alza de factores angiogénicos como VEGF, VEGFR2 y angiopoyetina-2 a través de la vía dependiente de trombina / PAR junto con una mayor permeabilidad de barrera de las CE resulta en la inducción de angiogénesis y diseminación del cáncer [4, 141].

La integrina αvβ3 se encuentra principalmente en las células de los vasos sanguíneos y juega un papel esencial en la angiogénesis. Localización de αvβ3 se altera en respuesta a metabolitos de eicosanoides proinflamatorios como el 12 (S) -HETE, lo que provoca la retracción de la CE y la alteración de la función de barrera [142-144]. La expresión de la integrina αvβ3 está regulada por la actividad PAR-1 mediada por trombina. La activación de los PAR por trombina también conduce a una mayor expresión de gelatinasas que degradan el colágeno IV y aumentan la permeabilidad de los vasos para promover la migración e invasión de células endoteliales y cancerosas [120].

En las CE, la trombina puede escindir directamente PAR-1, que se cree que conduce a un fenotipo proinflamatorio, o puede hacerlo indirectamente después de que activa una proteasa intermedia llamada proteína C (proteína C activada (APC)) que luego actúa sobre PAR- 1. Sin embargo, cuando el dominio GLA de APC forma un complejo con su receptor afín, EPCR y trombomodulina (TM), la especificidad de señalización de PAR-1 se altera a un fenotipo antiinflamatorio o protector. Por tanto, en las CE, la modulación de la especificidad de señalización de la proteasa de la coagulación a través de PAR-1 depende de si la trombina actúa directamente sobre PAR-1, o indirectamente, a través de APC, y si APC está unida a EPCR [145]. En las CE, tanto la trombina como la proteína C activada (APC) pueden actuar sobre PAR-1 para afectar resultados opuestos, pero se cree que esto depende de si la última proteasa está en complejo con EPCR.

La vía APC / EPCR / PAR-1 induce la motilidad, la proliferación de CE y la angiogénesis a través de la señalización protectora vascular y la formación de tubos para promover la diseminación de las células cancerosas [146, 147]. Además, el modulador de la hemostasia asociado a EC, TM, también influye fuertemente en el potencial metastásico asociado con la función procoagulante de la trombina [148].

Informes recientes han vinculado la activación de PAR-2 ​​y TRPV4, donde se sabe que TRPV4 mejora la proliferación de EC y la migración de EC tumoral mediada por ácido araquidónico [112, 113].

Trombina / PAR en plaquetas

Las plaquetas humanas expresan dos tipos de PAR desencadenadas por trombina, a saber, PAR-1 de alta afinidad y PAR-4 de baja afinidad. Ambos receptores activan los efectos celulares pleiotrópicos mediante el acoplamiento a la proteína Gαq y Gα13, que conduce a la activación de la fosfolipasa Cβ, la hidrólisis de los fosfoinosítidos y el aumento de la concentración de calcio citoplasmático, lo que da como resultado la activación de la integrina αIIbβ3y agregación plaquetaria [5, 6, 91, 149]. Los informes iniciales que describen el sistema de PAR dual en plaquetas humanas explicaron este fenómeno por el hecho de que PAR-1 y PAR-4 interactúan con diferentes concentraciones de activador y, por lo tanto, pueden sintonizar la señalización de trombina de manera más eficiente [30]. Estudios adicionales revelaron que PAR-4 funciona de manera diferente a PAR-1, en que la escisión inducida por trombina de PAR-4 da como resultado una activación mucho más prolongada de Gαq. Esto conduce a una respuesta sostenida de Ca 2+, que prolonga la señalización secundaria, en comparación con PAR-1, que es crucial para la fase tardía de la agregación plaquetaria [150]. A concentraciones bajas de trombina, PAR-1 puede actuar como cofactor de PAR-4. También existe una actividad PAR mitógena mediada por trombina derivada de las plaquetas, así como para las CE y los miocitos de los vasos [97, 120]. Las plaquetas recubiertas con trombina sobreviven más tiempo, lo que brinda a las células cancerosas la oportunidad de adherirse e invadir aún más [4, 120, 151]. Además, las células tumorales recubiertas por plaquetas están protegidas de la eliminación mediada por células asesinas naturales [152].

La agregación de plaquetas y la generación de fibrina resultante se acompaña de una mayor expresión de proteínas adhesivas (glicoproteína GPIIb / IIIa, factor de von Willebrand, P-selectina, fibronectina) en plaquetas que se han sometido a estimulación con trombina [4]. Estas proteínas adhesivas permiten que las células malignas formen complejos con trombos de fibrina y plaquetas sanguíneas en los espacios vasculares del melanoma y los cánceres epiteliales [revisado en 4]. Estos complejos mejoran la supervivencia de las células cancerosas y el potencial metastásico. El tratamiento con trombina de las plaquetas promovió la adhesión de las células del melanoma a las plaquetas, lo que aumentó la metástasis pulmonar [129].

Además de la agregación plaquetaria, la escisión de PAR-1 y PAR-4 mediada por trombina induce la liberación selectiva de reguladores proangiogénicos y mitogénicos plaquetarios (PDGF, VEGF y angiopoyetina-1) que facilitan la migración de células progenitoras endoteliales y la formación de nuevas redes capilares, que es un paso fundamental para las metástasis [153]. En comparación con los sujetos sanos, las plaquetas de pacientes con cáncer de mama producen niveles mucho más altos de VEGF en respuesta a la estimulación con trombina [151]. La trombina indujo este efecto a través de la activación de PAR-1, mientras que la estimulación de PAR-4 resultó en la secreción de endostatina, un factor antiangiogénico [151].

Trombina / PAR-1 en células cancerosas

La trombina puede provocar una respuesta de señalización a través de la interacción directa con PAR-1 presente en las células tumorales [4, 14, 41, 48]. In vitro Los estudios con varias líneas de células cancerosas mostraron una correlación entre la sobreexpresión de PAR-1 en las células cancerosas y una mayor capacidad de invasión y desarrollo de metástasis a distancia [14, 17, 18, 41-44, 52, 94, 154]. Además, en pacientes con cáncer de pulmón, gástrico o de mama, la expresión de PAR-1 fue un factor pronóstico independiente y desfavorable en términos de supervivencia global, mientras que en pacientes con cáncer de próstata resultó ser un factor pronóstico de recidiva local [17, 18, revisado en 155]. La disminución de la expresión de PAR-1 se asoció con una menor capacidad de invasión de las células cancerosas [68].

La expresión de PAR-1 se ha confirmado en cánceres de melanoma, mama, pulmón, esófago, gástrico, colon, próstata, páncreas, hígado, ovario, endometrio y cabeza y cuello (tabla 1) [17, 38, 43-45, 78, 79, revisado en 155-157]. Curiosamente, aunque PAR-1 se expresa en células madre hematopoyéticas normales, su expresión está notablemente disminuida en la leucemia mieloide aguda [158]. El efecto celular inducido por PAR-1 depende de la concentración de agonista, de modo que una concentración baja de trombina (menos de 3 nM) estimula la proliferación de células cancerosas y el crecimiento tumoral, mientras que los niveles elevados de trombina conducen a la apoptosis [159]. La mayoría de los efectos celulares se desencadenan mediante la activación duradera de los segundos mensajeros ERK1 / 2. Sin embargo, múltiples vías de señalización intracelular pueden estar implicadas en la activación de la trombina / PAR-1 (descrita a continuación) [118, 160].

Apoptosis, proliferación, migración e invasión

En modelos murinos de tumores benignos, la activación de PAR-1 da como resultado el crecimiento tumoral y la invasión al silenciar los genes proapoptóticos [154]. Sin embargo, en cánceres epiteliales y células de melanoma, la activación de PAR-1 mediada por trombina desencadena vías de supervivencia [5, 50, 75, 77, 154, 161]. La sobreexpresión y activación de PAR-1 en líneas celulares de melanoma no metastásico estimula la vía de señalización de Akt / PKB, lo que conduce a una disminución en la expresión de Bim y Bax, así como a niveles de caspasa-3 y caspasa-9 escindidos. La inhibición de la actividad de PAR-1 disminuyó el crecimiento tumoral durante en vivo experimentos, confirmando los efectos relacionados con la apoptosis provocados por este receptor [5].

En numerosos cánceres, la respuesta a la activación de PAR-1 inducida por trombina aumenta la proliferación celular, así como la motilidad y la migración en los ensayos de barrera de Matrigel [45, 46, 50, 77]. En las células de carcinoma hepático Hep3B, PAR-1 y PAR-4 activan vías de señalización promigratorias comunes mediante la activación de las tirosina quinasas receptoras Met, PDGFR y ROS quinasa, así como la inactivación de la proteína tirosina fosfatasa, PTP1B [162]. En el cáncer de nasofaringe, la activación de PAR-1 inducida por trombina conduce a una mayor expresión de MMP-2 y MMP-9, que están estrechamente asociadas con la metástasis tumoral, ya que pueden degradar la matriz extracelular y romper la membrana basal [43, 60].

Mayor expresión de integrinas

Las integrinas son proteínas transmembrana que median las interacciones entre las CE y la matriz extracelular que son vitales para el éxito de la angiogénesis [41, 42, 120]. Existe evidencia sustancial de que el aumento de la expresión de proteínas de adhesión debido a la actividad de PAR mediada por trombina da como resultado un aumento del potencial metastásico de las células cancerosas [4, 41-43]. PAR-1 aumenta las propiedades invasivas de las células tumorales principalmente al promover la adhesión a los componentes de la matriz extracelular. Varias líneas de células cancerosas (por ejemplo, pulmón y melanoma) exhiben una mayor adhesión a las plaquetas, así como a las CE aórticas y capilares después de la estimulación con trombina / PAR-1 [4, 14, 41, 42, 130]. La adhesión impulsada por PAR-1 a los componentes de la matriz extracelular se produce a través de tres mecanismos: (1) fosforilación de la quinasa de adhesión focal y paxilina, e inducción de complejos de contacto focal, (2) movilización de integrinas en la superficie celular sin alterar su nivel de expresión, y (3) reclutamiento específico de integrina αvβ5 a los sitios de contacto focal [163]. Interacción de las células cancerosas con la integrina αvβ5 y la reorganización citoesquelética facilita la migración celular, la invasión y el desarrollo metastásico en el cáncer de pulmón y el melanoma [43, 163, 164]. Además, la aplicación de anti-αvβ5 los anticuerpos atenúan específicamente esta invasión inducida por PAR-1 [163]. Expresión de integrina αIIbβ3 y la P-selectina en respuesta a PAR-1 puede conducir a la unión de las células del melanoma a las CE y las plaquetas y de esta manera también aumentar el potencial metastásico de las células cancerosas [14, 41, 42, 120]. Mayor expresión de αIIbβ3 La proteína se informó en varios tumores malignos [4, 14, 41, 42, 165, 166].

Angiogénesis

El desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, angiogénesis (angio-embarcación, génesis—Creación) es el proceso fundamental para el crecimiento y la progresión del tumor [167, 168]. Los vasos sanguíneos pequeños proporcionan oxígeno y nutrientes a las células cancerosas y eliminan los productos de desecho metabólicos. Se supone que los tumores malignos no pueden crecer por encima de 2-3 mm 3 sin vasculatura [168]. Los estudios de embriogénesis murina y cáncer demostraron que la expresión de PAR-1 es necesaria para la angiogénesis, ya que la mitad de los embriones animales privados de PAR-1 murieron debido a un desarrollo insuficiente de la vasculatura, mientras que la activación de la señalización de PAR-1 previno la muerte de las células cancerosas [169]. En células de melanoma y cáncer de mama, la expresión de PAR-1 se correlaciona con un aumento de los niveles de VEGF y la estimulación de la angiogénesis y el crecimiento tumoral [161]. También existe una correlación entre la expresión de trombina y VEGF en células de glioma, lo que sugiere un posible mecanismo autocrino de regulación de la angiogénesis en tumores cerebrales.

La escisión de PAR mediada por trombina en cáncer, células sanguíneas y células de la pared vascular da como resultado la activación de la transcripción de muchos genes proangiogénicos como VEGF y su receptor (VEGFR), TF, MMP-2, angiopoetina-2 (Ang-2), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), MAP y quinasas PI3 [120, 142, 170-173]. Residencia en in vitro En los estudios, el VEGF procedente de plaquetas y células cancerosas puede secretarse a los pocos minutos de la activación [170]. Además, la activación de PAR mediada por trombina induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través del aumento de la expresión del factor 1 inducido por hipoxia (HIF-1) [116]. HIF-1 activa la transcripción del gen VEGF y su expresión responde a los metabolitos del ácido araquidónico [174].

La señalización PAR-1 y PAR-4 después de la activación plaquetaria conduce a la síntesis y liberación de tromboxano (TXA2) y ácido 12-hidroxieicosatetraenoico (12 (S) -HETE) [6, 142, 143, 175-181]. Estos son productos finales metabólicos de la actividad ciclooxigenasa (COX-1) y lipoxigenasa (12-LOX) sobre el ácido araquidónico y son mediadores importantes de la formación de trombos, el tono vascular y la angiogénesis a través de su acción sobre receptores específicos (TPα, GPR31) y la regulación transcripcional. de factores como VEGF y HIF1α [144, 174-186]. El ácido araquidónico es liberado como sustrato de estas enzimas de la membrana celular por la fosfolipasa citosólica A2 (cPLA2a) que responde a la señalización de PAR-1 y PAR-4 de manera diferencial dependiendo de si está acoplado a la vía COX-1 o a la 12- Vía LOX [187]. La activación por trombina de PAR-1 y PAR-4 también conduce a la formación de eicosanoides esterificados a la misma velocidad que la liberación de ácidos libres. Sin embargo, el HETE esterificado a fosfatidiletanolamina después de esta reacción se presenta al exterior de la célula en lugar de reciclarse en el sustrato interior y tiene funciones únicas en ese contexto [188].

Transición epitelial-mesenquimal

Otro fenómeno potencialmente importante en la metástasis del cáncer, al menos en parte regulado por la trombina, es la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) [44]. El mecanismo, con su proceso inverso, una transición mesenquimatosa-epitelial (MET), mejora la capacidad de los cánceres sólidos para diseminarse y colonizar sitios distantes [189]. Los tumores malignos compuestos por células moderadamente diferenciadas también pueden contener regiones de escasa diferenciación. Estas células pueden desprenderse de la masa tumoral e invadir el estroma adyacente después de sufrir un evento similar a la EMT. Pierden la expresión de marcadores de diferenciación epitelial y adquieren la capacidad de expresar marcadores mesenquimales y de "tallo". Estas células también contribuyen a la migración de células madre circulantes (CSC) que se diseminan y dan lugar a metástasis. Durante la EMT, algunas características del epitelio diferenciado (p. Ej., Polaridad apico-basal y adherencias célula-célula) se reemplazan por rasgos mesenquimales: polaridad de atrás hacia adelante, capacidad de migración celular individual e invasión de la lámina basal y los vasos sanguíneos [189]. . Para colonizar eficazmente nuevos sitios, estas células también deben ser capaces de someterse al proceso MET inverso para volver a diferenciar y restablecer la organización de las células [189].

Los estudios experimentales sobre líneas celulares de cáncer gástrico revelaron que la activación de PAR-1 mediada por trombina conduce a la reprogramación de la expresión génica mediante la estimulación de factores de transcripción como SNAIL1, que se sabe que impulsa la EMT en el embrión [44].Además, en los cánceres epiteliales (p. Ej., Gástrico y de mama), el complejo trombina / PAR-1 conduce a la alteración de los componentes de la membrana basal (aumento de la expresión de fibronectina, Wnt y β-catenina, disminución de la expresión de E-cadherina) así como del citoesqueleto. proteínas (miosina IIA y filamina B), que regulan colectivamente la EMT implicada en la progresión de tumores malignos [45, 46, 75, 77, 94, 189].

Las MMP son proteasas dependientes de zinc secretadas por células tumorales y hospedadoras. Es ampliamente reconocido que las MMP están involucradas en la progresión del cáncer y la metástasis al facilitar la invasión de las células tumorales a través de la membrana basal y el tejido estromal [39, 157, 190]. La coexpresión de MMP y PAR se asocia con alta invasividad (infiltración más profunda del tumor, invasión linfovascular, ocurrencia más frecuente de metástasis en los ganglios linfáticos, estadio clínico más avanzado de la enfermedad) y mala supervivencia en varios tumores malignos, p. Ej., Mama, gástrico, esofágico , cánceres de vesícula biliar, hepatocelular, de pulmón y de ovario [18, revisado en 39, 157, 189].

Además, los estudios con líneas celulares de cáncer de mama, vesícula biliar y de ovario han demostrado que las MMP (MMP-1, MMP-9, MMP-13, MMP-14) pueden activar la señalización de PAR, especialmente mediante la escisión de PAR-1 (la mayoría de los tumores ) o PAR-2 ​​(cáncer de pulmón) [15, 39, 52, 71]. Además, se determinó que los fibroblastos senescentes potencian los eventos carcinogénicos cutáneos tempranos mediante la activación de PAR-1 mediada por MMP-1 [191]. De las MMP probadas, MMP-1 presenta la correlación positiva más fuerte con la migración celular y la invasividad. El bloqueo de la actividad PAR-1 mediada por MMP-1 en modelos de xenoinjerto de cáncer de ovario peritoneal avanzado da como resultado la inhibición de la angiogénesis y la metástasis [39].

La activación de PAR-1 plaquetaria por MMP-1 también puede conducir a Rho-GTP así como a la activación de la señal MAPK, promoviendo así la agregación plaquetaria y aumentando la motilidad plaquetaria y la proliferación celular [87]. El zimógeno ProMMP-1 se convierte en MMP-1 en la superficie de las plaquetas después del contacto con las fibrillas de colágeno. El bloqueo de la señalización de MMP-1 / PAR-1 inhibe en gran medida la trombosis en animales, lo que demuestra que la vía del colágeno / MMP-1 / PAR-1 es un activador de los eventos de señalización plaquetaria independientes de la trombina. Como los PAR estimulan la expresión y liberación de 12 (S) -HETE que regula al alza MMP9 [117], parece haber un precedente para la regulación bidireccional de la señalización de MMP y PAR.

Tripsina

La tripsina es otra serina proteasa que activa PAR-2 ​​en las células cancerosas. La concentración de tripsina aumenta en pacientes con cáncer de estómago, colon, páncreas y ovario [54, 155, 192]. El aumento de expresión de PAR-2 ​​y su influencia en la proliferación de células cancerosas se definió en cánceres de estómago, esófago, colorrectal, páncreas, escamoso oral, hígado, colangiocarcinoma, pulmón, mama y ovario, así como en melanoma y tumores cerebrales (tabla 3). ) [53, 54, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 71, 155, 193-195]. PAR-2 ​​también puede expresarse en gran medida en regiones tumorales ricas en estroma. Estudios de Shi et al. han demostrado funciones duales intrigantes para PAR-2 ​​estromal en el desarrollo del cáncer de páncreas, a saber, que PAR-2 ​​potenció el crecimiento del tumor primario pero disminuyó la linfangiogénesis y la consiguiente metástasis en los ganglios linfáticos [194]. Los hallazgos definieron a PAR-2 ​​como un regulador negativo de la linfangiogénesis en el cáncer de páncreas. Por el contrario, la expresión de PAR-2 ​​se correlacionó con la profundidad de la invasión de la pared, la metástasis hepática, así como la infiltración linfática y venosa en pacientes con cáncer gástrico [193]. Los pacientes con tumores PAR-2 ​​positivos tuvieron un pronóstico significativamente más precario que aquellos con tumores con expresión negativa.

In vitro Los estudios con cánceres epiteliales han demostrado que PAR-2, como PAR-1, ejerce actividad mitogénica [46, 53, 54, 56-61, 64, 71, 155, 193-195]. La tripsina y el péptido activador de PAR-2, SLIGKV, aumentaron significativamente la actividad gelatinolítica de MMP-2, así como la señalización de ERK / AP-1, MEK1 / 2 y MAPK para promover la proliferación, migración y metástasis de células cancerosas [53, 57, 58, 60–62, 195]. El aumento de la actividad de MMP-2 sugiere que PAR-2 ​​puede estar implicado en la invasión del cáncer por la vía MMP / EGFR / MAPK / ERK1 / 2 [60]. PAR-2 ​​también puede activar los canales de Ca 2+ para promover la liberación de prostaglandina E2, lo que da como resultado la proliferación celular estimulada por EGFR [53]. Empleando un ensayo de migración a través de la barrera de Matrigel, se determinó que la transactivación de la tirosina quinasa del receptor Met por PAR-2 ​​está involucrada en la invasión de células hepatocelulares y de colangiocarcinoma [58].

La influencia de la inflamación en el cáncer es innegable. Existen conexiones interesantes entre el sistema nervioso y la regulación de la inflamación, donde el nervio vago participa en un circuito de retroalimentación sistémica que también involucra a los PAR [revisado en 196]. Estudios recientes determinaron que la isoforma PAR-1 en las fibras C vagales en los pulmones de los ratones podría evocar un potencial de acción en respuesta a la trombina, tripsina o el péptido activador de PAR-1 TFLLR-NH (2) [197]. Los canales del TRPV que inducen dolor e inflamación también están regulados por los PAR y sus mediadores lipídicos bioactivos proinflamatorios posteriores, como el 12 (S) -HETE [198-204]. Si bien asociamos principalmente la inflamación neurogénica con la nocicepción, debe tenerse en cuenta que las células tumorales pueden migrar a través de una ruta perineural, lo que puede hablar con los gradientes de lípidos bioactivos de PAR proinflamatorios a lo largo de los nervios que sirven como balizas de metástasis [205-207]. De manera similar, se han descrito mecanismos neurogénicos que relacionan la activación de los PAR con la extravasación de plasma y que dependen de mediadores lipídicos bioactivos [112, 208]. Las biopsias alrededor de la glándula de Bartholin de mujeres con vestibulodinia revelan más terminaciones nerviosas intraepiteliales que las personas sanas y una mayor liberación de mediadores inflamatorios que conducen a la sensibilización de la fibra del nervio C y una mayor proliferación [209]. Debido a esta inflamación neurogénica, estos pacientes suelen experimentar infecciones por levaduras recalcitrantes que pueden producir hiperplasia epitelial y cáncer [210].

Microbioma, PAR, cáncer

Los PAR se han implicado en muchas interacciones huésped-microbio que, con el tiempo, pueden resultar relevantes para descifrar el papel del microbioma en la aparición y progresión del cáncer, así como en otras enfermedades con raíces en procesos inflamatorios infecciosos [211-217]. Insulto microbiano por steotococos neumonia se sabe que estimula las proteasas derivadas del huésped para activar los PAR [218]. Porphyromonas gingivalis puede activar PAR en células epiteliales orales para regular al alza IL-6 [219], y recientemente se demostró que la bacteria estimula PAR-2 ​​dando como resultado la expresión de MMP9 y la promoción del carcinoma oral de células escamosas [220]. Ambos Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus en la piel producen proteasas que alimentan la activación de los PAR en los queratinocitos, lo que provoca inflamación [221]. Los propios microbios producen numerosas proteasas que ayudan en la diseminación microbiana superando algunos de los mismos procesos logísticos que las células cancerosas que hacen metástasis deben sortear para diseminarse [222-225]. Se está investigando activamente la interacción entre el microbioma y el huésped para afectar los cambios en el tejido y el microambiente hematológico [226, 227]. Las proteasas bacterianas pueden escindir los PAR para modular la inflamación y se han estudiado por su potencial para comprometer la función de barrera del huésped [228]. Con ese fin, es concebible que las células circulantes o metastatizantes de tumores o nichos madre puedan aprovechar tales cambios. Recientemente, también hay pruebas de la activación por proteasa microbiana de un TLR nuevo en un mecanismo similar a la activación de PAR [229].

Como tema de reflexión, el microbioma intestinal ha recibido mucha atención en relación con la enfermedad y el bienestar [230-233]. Por lo tanto, en el clima de los alimentos modificados genéticamente que se cultivan o manipulan, es de destacar que los abundantes rendimientos de ciertos granos en la industria agrícola dependen de la expresión de serpinas [233, 234], lo que puede tener implicaciones para la regulación de PAR en el intestino [235 –239].

Implicación clínica

Los resultados de los estudios teóricos presentados anteriormente sugieren que los PAR y la señalización asociada a los PAR pueden usarse como una posible diana terapéutica, ya sea sola o en combinación con otras modalidades, como quimioterapia, agentes antiangiogénicos y fármacos proapoptóticos. Un enfoque dirigido por PAR es atractivo ya que se dirige tanto al tumor como a su microambiente. In vitro y en vivo Los estudios proporcionan evidencia de que la inhibición de la señalización asociada a PAR da como resultado una reducción del crecimiento tumoral, la invasividad y la metástasis [5, 41, 42, 240]. Hay antagonistas de señalización asociados a PAR funcionales (inhibidores de proteasas) y farmacológicos (inhibidores de ligando anclado o sitio de escisión de PAR) [19, 20]. El beneficio clínico puede proporcionarse mediante el bloqueo directo de PAR-1 o PAR-2 ​​en las células tumorales, la inhibición de PAR-1 en plaquetas, fibroblastos y CE (ATAP2, WEDE15, SCH530348, SCH79797, vorapaxar), así como la administración de inhibidores de trombina (hirudina, argatroban), TF (TFPI, mAb-10H10), MMP y otros inhibidores de serina proteasa (serpinas) [4, 5, 16, 22, 24, 87, 95, 96, 241, 242]. Aunque la inhibición experimental de la tripsina es factible, parece que es poco probable que la tripsina como diana de la terapia clínica tenga éxito debido a su distribución universal [60]. El bloqueo de proteínas expresadas en respuesta a la señalización provocada por PAR, por ejemplo, anti-αvβ5 Los anticuerpos, EGFR, Erb, Erk, inhibidores de MEK, así como los agentes que interfieren con el ARN PAR (ARN en horquilla corta (ARNhc)), también tienen potencial terapéutico [24, 61].

La inhibición de actividades relacionadas que no están asociadas directamente con los efectos promotores del cáncer de los PAR también puede beneficiar a los pacientes con cáncer. Hay hallazgos intrigantes de un modelo animal de que la activación de PAR-1 y PAR-2 ​​mediada por trombina juega un papel en la patogenia de los efectos secundarios agudos de la radioterapia, por ejemplo, enteritis, donde la señalización mediada por PAR activa procesos inflamatorios, mitogénicos y proliferativos. en las células del intestino después de la radioterapia. Los inhibidores de PAR-1 disminuyeron la intensidad de los efectos secundarios agudos, inmediatos y tempranos (enteritis), pero no afectaron los efectos secundarios de aparición tardía [243–245]. Se presume que la patogenia de los efectos adversos tardíos es independiente de PAR. Además, los antagonistas de PAR-2 ​​potencian los efectos analgésicos de la morfina sistémica en un modelo de rata de dolor por cáncer de hueso [246].

Aunque los resultados de los modelos experimentales son prometedores, la inhibición de la actividad de PAR tanto en células normales como en células tumorales puede provocar efectos secundarios, como hemorragia, por lo que el descubrimiento de fármacos adaptados a PAR es un gran desafío. Los ensayos clínicos aún son limitados y hasta ahora están dirigidos a pacientes con enfermedades distintas del cáncer. Los antagonistas de PAR-1, como vorapaxar y atopaxar, se han evaluado en ensayos clínicos en pacientes con síndrome coronario agudo, infarto cerebral y aterosclerosis [24, 247].

Sin embargo, la comprensión de la base molecular del cáncer de mama y el melanoma proporciona nuevos objetivos potenciales para el descubrimiento de fármacos anticancerosos adaptados a la señalización dependiente de PAR.

Cáncer de mama

Existe una creciente evidencia de que los PAR, principalmente PAR-1 y PAR-2, son fuertes mediadores de la invasión celular en los cánceres epiteliales [68, 77]. Las células de cáncer de mama pueden expresar tanto PAR-1 como PAR-2 ​​[66, 68, 77], y su función en el carcinoma de mama es la más estudiada. PAR-1 no se expresa en el epitelio mamario normal, displasia o adenoma, pero se regula al alza en el carcinoma en el lugar (baja expresión) y se expresa altamente en líneas celulares de carcinoma de mama invasivo [47, 77, 154]. Estudios experimentales sobre cáncer de mama han demostrado que PAR-1 es activado por trombina, MMP y TF, mientras que PAR-2 ​​es activado por factores de coagulación VIIa, Xa o sus complejos con TF [16, 52, 66, 68, 77]. También hay observaciones de que PAR-1 y PAR-2 ​​actúan como una unidad funcional en este tipo de tumor [248]. El silenciamiento de PAR-2 ​​mediante shRNA atenúa la activación de PAR-1 mediada por trombina, lo que reduce la formación de colonias y la invasión celular [248].

La actividad de PAR media la migración de células de cáncer de mama a través de Matrigel (una membrana basal reconstituida), facilita la quimiocinesis celular a través de la vía de señalización Gαi / c-Src / JNK / paxilina, activa las vías de supervivencia dependientes de Akt y se correlaciona con el nivel de invasividad y potencial metastásico de numerosas líneas de células cancerosas [66, 77, 154, 163]. Los PAR también regulan los procesos de EMT en los tumores de cáncer de mama, lo que facilita la proliferación celular (en el lugar carcinoma), invasión de la membrana basal, degradación de la matriz e infiltración local (cáncer invasivo). Además, las interacciones de PAR con integrinas, la formación de complejos de contacto focal y la reorganización del citoesqueleto permiten la diseminación a distancia mediante intravasación y extravasación (a través de vasos linfáticos o sanguíneos). Por último, el proceso MET y las interacciones con la sangre y las CE facilitan la formación de metástasis (cáncer diseminado) [77]. La inhibición de la activación de PAR en células de cáncer de mama MDA-435 altamente metastásicas redujo la invasión celular [77]. La administración de un inhibidor de MMP-1 y P1pal-7 (inhibidor de la viabilidad celular mediada por la señalización de Akt) atenúa la actividad de Akt, promoviendo significativamente la apoptosis en xenoinjertos de tumores de mama e inhibiendo la metástasis a los pulmones hasta en un 88% [16].

Hay evidencia de en vivo estudios de progresión del cáncer de mama mediada por PAR [32]. La expresión de PAR-1 fue esencial para el crecimiento tumoral y la invasión en xenoinjertos mamarios a través de la interacción mediada por trombina con EGFR- y ErbB o por la vía de Ca 2+ mediada por MMP-1 derivada de fibroblastos [32, 52]. La transactivación persistente de EGFR y ErbB2 / Her2 por la vía PAR-1 escindida por trombina se ha demostrado en el carcinoma de mama invasivo, pero no en las células epiteliales mamarias normales [32, 94]. Existe evidencia de que Gαi / o, actividad metaloproteasa y liberación de HB-EGF (EGF de unión a heparina) son fundamentales para la transactivación de EGFR. Por último, la señalización de EGFR y ErbB2 / Her2 desencadenada por PAR da como resultado una activación prolongada de Erk-1/2 que conduce a la invasión de las células del carcinoma de mama. Estos resultados indican un beneficio terapéutico potencial de los inhibidores de las cinasas trombina, EGFR, ErbB y Erk en pacientes con cáncer de mama metastásico.

Melanoma

En los cánceres epiteliales, el mecanismo predominante que conduce a la diseminación metastásica es la EMT. En el melanoma, la transición de una lesión de la fase de crecimiento radial no invasivo (RGP) a la fase de crecimiento vertical invasiva y competente para metástasis (VGP) es un paso importante en la progresión tumoral, y la expresión de PAR está implicada en el proceso de transición RGP-VGP [249]. Las células de melanoma expresan tanto PAR-1 como PAR-2 ​​[50, 250]. El papel de PAR-2 ​​en la metástasis del melanoma no se había apreciado anteriormente, pero los hallazgos más recientes han demostrado su doble papel en el melanoma [187, 194]. En un modelo murino de melanoma B16 metastásico espontáneo, PAR-2 ​​contribuyó a la limitación de la progresión del cáncer local en un área, mientras mejoraba la diseminación metastásica a distancia. Numerosos informes documentan el papel de la señalización de PAR-1 en el fenotipo prometastásico de las células de melanoma [4, 5, 21]. Estudios experimentales en líneas celulares de melanoma demostraron que la señalización provocada por PAR-1 activa factores adhesivos, invasivos, antiapoptóticos y angiogénicos para promover la metástasis del melanoma [4, 5, 21, 251]. Una prueba adicional del papel de PAR-1 en la diseminación del melanoma es el hecho de que está altamente expresado tanto en líneas celulares de melanoma metastásico como en lesiones metastásicas en comparación con los nevos primarios y la piel normal [21, 250]. Además, las células de melanoma aisladas de lesiones que dan lugar a metástasis en pacientes tenían una expresión de ARNm y proteínas de PAR-1 más alta, en comparación con las obtenidas de lesiones que no desarrollaron enfermedad metastásica [252]. La movilidad y migración de las células de melanoma también está regulada por la activación de PAR-1 mediada por trombina [50, 252]. La trombina, cuya generación es dependiente de TF (procoagulante expresado en células de melanoma), es el activador de PAR-1 predominante [21, 107]. Sin embargo, también hay evidencia de que la activación de PAR mediada por MMP-1 existe en células de melanoma [5, 249]. Tanto MMP-1 como PAR-1 son altamente expresados ​​por melanomas VGP. Se cree que la MMP-1 facilita la invasión del melanoma al degradar el colágeno tipo I dentro de la piel, mientras que la activación de PAR-1 conduce a una mayor activación de los factores de crecimiento: FGFR-2 e IGF-1 [5, 249].

Los experimentos con el modelo de melanoma de metástasis murina B16F10 demostraron que las células transfectadas con PAR-1 exhibían un potencial de metástasis pulmonar sustancialmente mayor que aquellas privadas de señalización de PAR-1 [4, 48]. PAR-1 promovió el melanoma metastásico mediante la regulación del supresor de tumores Maspin y la proteína de unión gap Connexin 43. Villares et al. [253] determinó que Connexin 43 facilita la interacción entre células malignas y CE, y la expresión de maspin está disminuida en células de melanoma metastásico, donde existe una correlación inversa entre PAR-1 y expresión de Maspin [254]. PAR-1 también promueve la expresión de la molécula de adhesión celular de melanoma MCAM / MUC18 (MUC18), que es un marcador clave de la metástasis del melanoma. Es de interés que la actividad de PAR-1 aumente la expresión del receptor del factor activador de plaquetas (PAFR) y su ligando, por lo que no solo promueve la agregación plaquetaria sino que también aumenta los niveles de MUC18. Esto es extremadamente relevante para el proceso metastásico, ya que se demostró que la vía PAR1 / PAFR / MUC18 media la adhesión de las células del melanoma a las CE microvasculares, la migración transendotelial y la retención metastásica en los pulmones [251].

El silenciamiento de PAR-1 y la inhibición de la trombina afectan la capacidad de diseminación de las líneas celulares de melanoma metastásico [21, 22, 251]. La inhibición de la actividad de PAR en un 80% mediante el uso de ARNhc lentiviral disminuye el potencial metastásico pulmonar de las líneas celulares de melanoma que sobreexpresan PAR-1 [21]. El silenciamiento de PAR-1 también inhibe la expresión de la proteína adhesiva MUC18, que atenúa el fenotipo metastásico de las células de melanoma [251].

Para reducir las respuestas inmunitarias tóxicas de la terapia viral, se utilizó ARN de interferencia pequeño (ARNip) PAR-1 incorporado en liposomas neutros (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, DOPC) en experimentos en modelos de melanoma. Hubo una disminución significativa en el crecimiento tumoral, el peso y la formación de colonias pulmonares metastásicas en ratones tratados con PAR-1 siRNA-DOPC [21]. La administración de ARNip también dio como resultado una disminución de los niveles de expresión de VEGF, IL-8 y MMP-2 y una disminución de la densidad de los vasos sanguíneos. En otro estudio, la reducción de la expresión de PAR-1 por ARNip y la inhibición de la función de PAR-1 por el antagonista específico SCH79797 disminuyó significativamente la motilidad e invasividad de las células de melanoma en la medida de las células no metastásicas y de baja expresión de PAR-1 [252 ]. Un inhibidor de trombina específico, argatroban, también disminuye la migración y el potencial metastásico óseo de las células de melanoma B16BL6 [22].

Estos hallazgos sugieren que la estimulación del crecimiento tumoral y la metástasis dependiente de PAR-1 está regulada por factores invasivos, adhesivos y proangiogénicos y que PAR-1 podría ser un objetivo terapéutico potencial para pacientes con melanoma metastásico.

Resumen

La invasión y metástasis de las células tumorales implica interacciones complejas entre las células mesenquimales y la matriz extracelular, así como los componentes sanguíneos y las CE. Las proteasas de coagulación, metaloproteasas de matriz y serina proteasas interactúan con los PAR, promoviendo así múltiples actividades que conducen a la progresión del cáncer. Se necesitan más estudios para convertir los conocimientos teóricos en valor práctico.


Cómo funcionan los Serpins

Las serpinas inhiben la acción de su respectiva serina proteasa imitando la estructura tridimensional del sustrato normal de la proteasa.

  • La serina proteasa se une a la serpina en lugar de a su sustrato normal. Esto por sí solo bloquearía cualquier actividad adicional de la proteasa. Pero la serpiente tiene otro truco que jugar.
  • La proteasa hace un corte en la serpina que conduce a
    • la formación de un enlace covalente que une las dos moléculas
    • un cambio alostérico masivo en la estructura terciaria de la serpiente
    • que mueve la proteasa adherida a un sitio donde puede ser destruida.

    Borrelia burgdorferi, Proteasas derivadas del huésped y la barrera hematoencefálica

    HIGO. 1. Las BMEC humanas in vitro expresan glicoproteína P y proteínas de unión estrecha. (A) Las monocapas de BMEC humanas confluentes y subconfluentes se levantaron con EDTA. Las células se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min, se permeabilizaron con PBS que contenía Triton X-100 al 0,01% y se inactivaron con glicina-PBS 10 mM. Después del bloqueo con suero de cabra normal al 10%, las células se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-glucoproteína P de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína y anticuerpo policlonal de conejo anti-factor VIII-Rag, seguido de anticuerpo secundario acoplado a ficoeritrina. El análisis se realizó utilizando un FACScan y el software CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA). Se muestran los porcentajes de BMEC humanas controladas positivas tanto para el factor VIII-Rag como para la P-glicoproteína. (B) Se fijaron monocapas de BMEC humanas con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% y se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-ZO-1 humano. La presencia de ZO-1 se visualizó con anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488. Las imágenes de contraste de interferencia diferencial (panel izquierdo) y de fluorescencia (panel derecho) de BMEC humano mostraron que ZO-1 se expresa en las uniones celulares. Ampliación, × 400. HIGO. 2. Modelo in vitro para B. burgdodrferi 297 cruzando la BBB humana. Un total de 10 7 B. burgdodrferi 297 (Cama y desayuno) las células se incubaron durante la noche con BMEC humanas cultivadas hasta la confluencia en insertos Transwell. (A) Se utilizó microscopía de campo oscuro para determinar el número de espiroquetas que cruzaron las monocapas. Los datos de dos experimentos independientes con determinaciones por triplicado se expresan como porcentajes de B. burgdorferi (medias ± errores estándar de las medias) que se cruzaron en relación con el número total de espiroquetas en los pozos de control sin insertos. (Recuadro) Comparación de B. burgdorferi cruzamiento con BMEC humana (barra +) o sin BMEC humana (barra -). (B) TEER expresado como medias ± errores estándar de las medias para los experimentos mostrados en el panel A. Cont, control. HIGO. 3. B. burgdorferi cruza diferencialmente monocapas humanas de BMEC y HUVEC (EA.hy926). Un total de 10 6 B. burgdodrferi 297 (Cama y desayuno) las células se incubaron durante la noche con BMEC humana o HUVEC (EAhy.926) cultivadas hasta la confluencia en insertos Transwell. (A) Se utilizó microscopía de campo oscuro para determinar el número de espiroquetas que cruzaron monocapas humanas de BMEC o HUVEC. (B) PCR en tiempo real basada en la copia única B. burgdorferi en sentido estricto fla El gen (50) se utilizó para determinar el número de espiroquetas que cruzaron monocapas de BMEC o HUVEC humanas en los experimentos cuyos resultados se muestran en el panel A. Los datos de las determinaciones por triplicado se expresan como porcentajes de B. burgdorferi (medias ± errores estándar de las medias) que se cruzaron en relación con el número total de espiroquetas en los pozos de control sin insertos. (C) TEER medido como resistencia media (media ± errores estándar de las medias) para los experimentos cuyos resultados se muestran en los paneles A y B como se describe en Materiales y métodos. los PAG valores (según lo determinado por un estudiante emparejado t prueba) para los cambios TEER en las muestras de HUVEC de 5 y 18 h fueron 0.019 y 0.017, respectivamente (indicados por asteriscos). Cont, control. HIGO. 4. Activación del plasminógeno por cocultivos de B. burgdorferi y BMEC humano. Se cultivaron BMEC humanas en placas de 96 pocillos hasta que alcanzaron la confluencia (aproximadamente 105 células). El medio se cambió por medio DMEM-F-12 y al día siguiente se incrementaron las cantidades de B. burgdorferi Se añadió N40 (0, 10 3, 10 4, 10 5 células). (A) Activación del plasminógeno por BMEC humana en respuesta a la adición de espiroquetas. Veinticuatro horas después de la adición de espiroquetas, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se incubaron con 1 µg de plasminógeno humano por ml y Spectrozyme PL 5 mM. El aumento de absorbancia a 405 nm fue directamente proporcional a la cantidad de plasmina en una muestra dada. Las barras de error indican las desviaciones estándar basadas en seis experimentos realizados por duplicado. (B) Unión del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa exógeno a BMEC humana después de la adición de espiroquetas. Los cultivos se lavaron tres veces con PBS antes de la adición de 125 U de uPA recombinante humano por ml. Después de una incubación de 60 minutos, los cultivos se lavaron nuevamente tres veces con PBS. Después del lavado, se añadieron 200 µl de PBS que contenían 1 µg de plasminógeno por ml junto con Spectrozyme PL 5 mM. El aumento de la absorbancia a 405 nm se determinó después de 3 h. Tenga en cuenta la mayor capacidad de B. burgdorferi N40 para estimular la unión de BMEC humanas a uPA y activación de plasminógeno en comparación con cultivos de control incubados con espiroquetas. Las barras de error indican las desviaciones estándar basadas en tres experimentos realizados por duplicado. HIGO. 5. Papel de las proteasas en B. burgdorferi (Cama y desayuno) transmigración a través de BMEC humanas. Se utilizaron condiciones de suero reducido para examinar el papel de las proteasas del huésped en la transmigración de espiroquetas a través de BMEC humanas como se describe en Materiales y métodos y la leyenda de la Fig. 4. El recorrido de las BMEC humanas por B. burgdorferi Se examinó N40 en presencia de 1 µg de plasminógeno por ml. El recorrido del BMEC humano por B. burgdorferi N40 con 50 nM BB-94 solo, con 200 μM EACA solo, con BB-94 y EACA, o con 40 μg de α2Se muestra -antiplasmina por ml. Los resultados son los promedios de dos experimentos realizados por duplicado. Las barras de error indican las desviaciones estándar. HIGO. 6. Expresión de MMP-1 en respuesta a B. burgdorferi. Se inoculó un total de 105 BMEC humanas con cantidades crecientes de B. burgdorferi N40. Después de 24 h, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se ensayaron mediante análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo generado contra MMP-1. Tenga en cuenta el aumento de los niveles de MMP-1 con el aumento del número de B. burgdorferi células.


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