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¿Dónde se encontrarían Saccharomyces cerevisiae en las concentraciones más altas en el medio ambiente?

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Tengo asma de panaderos específicamente a la levadura 'Sc', y sé que debo evitar panaderías, cervecerías, etc.

He descubierto que no debo alterar las pilas de hojas en descomposición ni el mantillo de corteza en fermentación. ¿Dónde más?

¿Qué porcentaje más alto son las concentraciones en, por ejemplo, Florida, en comparación con el estado de Nueva York?


Aquí hay un enlace a un artículo interesante que informa sobre una encuesta de aislamientos silvestres de Saccharomyces cerevisiae en China.

Wang, Qi-Ming y col. (2012) Poblaciones sorprendentemente divergentes de Saccharomyces cerevisiae en ambientes naturales alejados de la actividad humana. Mol Ecol 21: 5404-5417

Una cita relevante del artículo:

Además de las uvas y la corteza de los árboles de roble (Quercus spp.), Se aisló con éxito S. cerevisiae de una variedad de frutas dañadas recolectadas en huertos o mercados en diferentes provincias de China; de la corteza de diferentes árboles de hoja caduca; suelo forestal y madera podrida recolectados en bosques primarios, secundarios y plantados originales ubicados en diferentes regiones que cubren zonas de clima templado, subtropical y tropical desde el norte hasta el sur de China. Inesperadamente, la tasa de éxito del aislamiento de S. cerevisiae a partir de muestras de fruta (6,5%) fue menor que la de las muestras de corteza de árbol (16,5%), suelo (10,8%) y madera podrida (9,2%). S. cerevisiae se aisló con más frecuencia de muestras de suelo forestal (tasa de éxito 13,7%) que de muestras de suelo de huerto (tasa de éxito 9,1%). Entre las frutas que dieron un aislamiento positivo de S. cerevisiae, las muestras de uva mostraron la tasa de éxito más baja.

La Tabla S2 en los registros de información complementaria aísla de la siguiente manera:

zonas climáticas sitios aislados __________________________________ tropical 5 20 subtropical 2 14 templado 13 51

Superficialmente, a partir de esto, parece que probablemente habría poca diferencia entre el estado de Nueva York (húmedo, continental) y Florida (húmedo, subtropical).


Todo sobre los pequeños microbios

Las levaduras son microorganismos eucariotas clasificados en el reino Hongos, con cerca de 1.500 especies descritas actualmente que dominan la diversidad de hongos en los océanos. La especie de levadura Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado para hornear y fermentar bebidas alcohólicas durante miles de años. También es extremadamente importante como organismo modelo en la investigación de la biología celular moderna, y es uno de los microorganismos eucariotas más investigados.

Las levaduras son muy comunes en el medio ambiente,

1) Aislado principalmente de material rico en azúcar. Los ejemplos incluyen levaduras naturales en la piel de frutas y bayas (como uvas, manzanas o melocotones) y exudados de plantas (como savia de plantas o cactus). Algunas levaduras se encuentran asociadas con el suelo y los insectos.

2) La función ecológica y la biodiversidad de las levaduras son relativamente desconocidas en comparación con las de otros microorganismos.

3) Se han encontrado levaduras que incluyen Candida albicans, Rhodotorula rubra, Torulopsis y Trichosporon cutaneum viviendo entre los dedos de los pies de las personas como parte de la flora de su piel.

3) Las levaduras también están presentes en la flora intestinal de los mamíferos y algunos insectos.

4) Biorremediación de hidrocarburos. Algunas levaduras tienen aplicación en el campo de la biorremediación. Se sabe que una de estas levaduras, Yarrowia lipolytica, degrada el efluente del molino de aceite de palma, TNT (un material explosivo) y otros hidrocarburos como alcanos, ácidos grasos, grasas y aceites. También puede tolerar altas concentraciones de sal y metales pesados, y se está investigando por su potencial como biosorbente de metales pesados.

El petróleo crudo es una mezcla de hidrocarburos de diferentes tamaños. Diferentes microorganismos descomponen hidrocarburos de diferentes tamaños.

Uso en medio acuático

Los aficionados a los acuarios suelen utilizar la levadura para generar dióxido de carbono (CO2) para fertilizar plantas en acuarios plantados. En una configuración casera se usa ampliamente como una alternativa barata y simple a los sistemas de CO2 presurizados. El CO2 es utilizado por las plantas en el proceso de fotosíntesis, es muy importante para el crecimiento de las plantas. Es completamente seguro para peces y otros animales acuáticos.

Consumo humano:

Suplementos naturales y probióticos para consumo humano La levadura se utiliza en suplementos nutricionales populares entre los veganos y los conscientes de la salud, donde a menudo se la denomina & # 8220 levadura nutricional & # 8221. Suele ser Saccharomyces cerevisiae.

Es una excelente fuente de proteínas y vitaminas, especialmente las vitaminas del complejo B, cuyas funciones están relacionadas con el metabolismo, así como con otros minerales y cofactores necesarios para el crecimiento.

Algunos suplementos probióticos utilizan la levadura Saccharomyces boulardii para mantener y restaurar la flora natural en el tracto gastrointestinal grande y pequeño. Se ha demostrado que S. boulardii reduce los síntomas de la diarrea aguda en los niños, previene la reinfección de Clostridium difficile, reduce las deposiciones en pacientes con SII con predominio de diarrea y reduce la incidencia de diarreas asociadas a antibióticos, viajeros y VIH / SIDA.


Introducción

Saccharomyces cerevisiae es posiblemente el organismo eucariota más estudiado además de los seres humanos. Su manejabilidad genética lo ha convertido en un organismo modelo valioso para la genética, la genómica, la biología celular y la bioquímica (por ejemplo, Goffeau et al., 1996 Spellman et al., 1998 Hartwell et al., 1974). Pero su larga historia de domesticación humana lo hace menos que ideal para la investigación de la ecología y la evolución. Los biólogos y ecologistas evolutivos a menudo prefieren estudiar otras especies del género. Saccharomyces, que comprende siete especies conocidas y muchos híbridos (Figura 1). Todos son tan manejables como S. cerevisiae en el laboratorio. Varios, incluidos S. cerevisiaeEl pariente más cercano, S. paradoxus, se encuentran solo en la naturaleza y no en fermentaciones humanas. Todos Saccharomyces Las especies tienen morfologías y fenotipos bioquímicos similares (Vaughan-Martini y Martini, 2011), aunque hay algunos rasgos ecológicamente significativos que difieren entre las especies, p. tolerancia a la temperatura (Sampaio y Gonçalves, 2008). Información sobre Saccharomyces las levaduras pueden poner S. cerevisiae biología molecular en contexto ecológico y evolutivo. Este clado también nos ha enseñado lecciones sobre ecología de nicho, hibridación, domesticación, genética de poblaciones y biogeografía que van más allá de las comparaciones con S. cerevisiae.

Aquí revisaremos el uso de S. paradoxus y sus parientes para comprender la historia natural, la ecología y la evolución de la levadura. Nos centramos en S. paradoxus porque es el mejor estudiado Saccharomyces levadura además S. cerevisiae. La literatura sobre Saccharomyces especies que no son S. paradoxus o S. cerevisiae está creciendo rápidamente e incluimos información sobre otros Saccharomyces especieS. eubayanus, S. uvarum, S. kudriavzevii, S. arboricola y S. mikatae) cuando esté disponible. Recomendamos más recientes Saccharomyces revisiones que se centran en comparaciones con S. cerevisiae (Replansky et al., 2008), especiación (Greig, 2009) y genómica evolutiva (Hittinger, 2013) para lectores interesados.


Resultados

Se recuperaron nueve especies diferentes de levaduras del mosto de uva y del fermento resultante. Parece que ocurrieron dos períodos distintos de expansión microbiana: uno anterior que comprende losSaccharomyces y uno posterior que comprende solo S. cerevisiae. S. cerevisiae aún no se pudo detectar en el primer día de fermentación, el día 11 era la especie dominante. Está claro que S. cerevisiae era muy raro inicialmente, pero aumentó en abundancia y desplazó a los diversos no-Saccharomyces especies como lo hizo (Fig. 1): esto coincide con las observaciones dinámicas de la población de levadura de otros fermentos tradicionales (Pretorius 2000, Xufre et al. 2006).

El cambio en la composición de la comunidad de levadura, la temperatura y la concentración de etanol durante un fermento de vino tradicional. Se muestra el cambio en el tamaño de la población (unidades formadoras de colonias, ufc) de lasSaccharomyces levaduras (líneas finas de trazos negros) y S. cerevisiae (líneas finas negras sólidas) en cuatro barricas separadas durante 20 días de fermentación. También se muestra el cambio promedio en la temperatura (línea roja gruesa) y los niveles de etanol estimados a partir del cambio en la gravedad específica (línea azul gruesa) para estos cuatro barriles durante los días 6 a 16 de fermento.

El jugo de uva en sí es un medio duro, entre otras cosas, tiene un pH bajo de ∼ 3.5 e impone una presión osmótica porque el azúcar es típicamente ∼ 200–350 g / L (Ribereau-Gayon et al. 2006). Con el fin de diferenciar entre los efectos del etanol solo, o la interacción entre el etanol y las otras tensiones impuestas por el mosto, se probaron las tasas de crecimiento de las diversas especies de la comunidad en un medio de laboratorio benigno (YPD) y en jugo de uva suplementado. con etanol al 0%, 3% y 9% a 30 ° C. La tasa de crecimiento resultó ser significativamente afectada por el tipo de medio, el nivel de etanol, las especies de levadura y todas las posibles interacciones de estos efectos (ANOVA de tres vías, todos los efectos principales y las posibles interacciones producidas PAG & lt 0,001). La importancia de estos efectos permaneció cuando las levaduras se agruparon en S. cerevisiae y no-Saccharomyces clases, además de la interacción medio-nivel de etanol: las tasas de crecimiento de ambas clases disminuyeron a medida que aumentaba el nivel de etanol. La figura 2 muestra la magnitud de estos efectos y sus interacciones. Un ANOVA muestra que la diferencia entre la tasa de crecimiento de S. cerevisiae y la noSaccharomyces en jugo de uva sin etanol es altamente significativo (PAG & lt 0,0001): aquí S. cerevisiae tiene una ventaja de aptitud física del 4,1% por hora (metro = 0,04 h −1). Esta ventaja puede no parecer muy grande, pero permitiría que S. cerevisiae aumente del 0,1% al 99,9% de una comunidad en solo 14 días. La diferencia entre S. cerevisiae y el no-Saccharomyces especies en el jugo de uva sigue siendo significativa con la adición de etanol al 3% (ANOVA unidireccional, PAG & lt 0,0001). En este entorno, S. cerevisiae es 6.2% por hora más en forma (metro = 0.06 h −1 10 días para pasar de 0.1% a 99.9%): parece que la adición de etanol al jugo de uva aumentó la ventaja competitiva de S. cerevisiae en aproximadamente la mitad de lo que se observa solo en el jugo de uva. Al examinar los datos, encontré que no había una diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre ninguna de las especies en YPD solo (ANOVA, PAG = 0.5), y que la adición de etanol al 3% a YPD no alteró esto (ANOVA, PAG = 0,1). Un examen más detenido muestra que, si bien la mayoría de losSaccharomyces especies no pudieron crecer en YPD con etanol al 9%, un miembro de la comunidad no mostró diferencias significativas en el crecimiento en comparación con S. cerevisiae (PAG = 0,19). En igualdad de condiciones, este aislado de Issatchenkia terricola es tan competitivo como S. cerevisiae en presencia de etanol hasta concentraciones del 9%.

El efecto del medio ambiente y la concentración de etanol en la tasa de crecimiento de especies en la comunidad de levaduras. La figura muestra el cambio (media ± SE) en la tasa de crecimiento (según lo estimado por el cambio máximo en la densidad óptica [DO, absorbancia a 660 nm] durante 24 horas) de la no-Saccharomyces (los triángulos significan seis especies, norte = 3 para cada especie) y S. cerevisiae (cuadrados norte = 6) en YPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, símbolos abiertos de glucosa al 2%, línea discontinua) y jugo de uva (símbolos sólidos, línea sólida) suplementado con 0%, 3% y 9% volumen / volumen de etanol.

La naturaleza del medio ambiente (jugo frente a YPD) tuvo un efecto grande y significativo en la diferencia en la tasa de crecimiento entre S. cerevisiae y la noSaccharomyces a 30 ° C. Parece claro que los niveles bajos de etanol no envenenan significativamente a losSaccharomyces levadura en esta comunidad, y que algunas parecen tolerantes a niveles razonablemente altos de etanol. Estos datos sugieren que la ventaja ecológica de S. cerevisiae se debe al hecho de que se adapta mejor al jugo per se en comparación con el no-Saccharomyces, y esto se agrava aún más mediante la adición de etanol. Esto proporciona evidencia de que la producción de etanol y la adaptación de un mejor crecimiento en presencia de etanol es un ejemplo de retroalimentación evolutiva de la construcción de nichos. ¿Son estos aspectos la explicación completa del cambio en la composición de la comunidad? Aparte del aumento diseñado en los niveles de etanol, hay al menos otro cambio ambiental que se correlaciona con la disminución de losSaccharomyces y el aumento de S. cerevisiae: temperatura (ver Fig. 1).

El examen de la química de la fermentación muestra que el etanol y el CO2 no son los únicos productos: debido a que la reacción es exogónica, también se libera energía. La energía teórica liberada de la conversión de una solución un equimolar de glucosa: fructosa en etanol y CO2 es 104,43 kJ / mol (Williams 1982). Debido a que el jugo de uva está cerca de una glucosa molar: fructosa, esto no está lejos de la energía potencial liberada durante los fermentos. Se necesitan ∼ 3.43 J para calentar 1 ml de jugo de uva a 1 ° C. Por lo tanto, la fermentación de 1 L de una solución equimolar de glucosa: fructosa liberaría 104,43 kJ, y esto podría calentar el jugo de uva en ~ 30 ° C. Por supuesto, esta es una situación teórica en la que la conversión es instantánea, 100% eficiente y completamente aislada. Si bien estas condiciones rara vez se cumplen, está claro que, además del etanol y el CO2, la fermentación produce una gran cantidad de energía que se transfiere al medio ambiente. De hecho, la temperatura de los fermentos puede cambiar drásticamente a medida que avanzan (Ribereau-Gayon et al. 2006). Los fermentos seguidos en el río Kumeu se llevaron a cabo en una habitación con aire acondicionado, pero aún así aumentaron de 15 ° C a 25 ° C (ver Fig. 1): este aumento se correlaciona con el aumento en la frecuencia de S. cerevisiae. No es descabellado asumir que el aumento de temperatura se debe a las acciones fermentativas de S. cerevisiae.

Debido a que la temperatura cambió durante el fermento, me interesó saber si esto jugó algún papel en el cambio observado en la composición de la comunidad. ¿Cómo varían las tasas de crecimiento de los distintos miembros de la comunidad de levaduras con la temperatura? El perfil térmico de un subconjunto de especies en la comunidad se determinó en YPD y jugo de uva para examinar la posible interacción entre el ambiente y la temperatura. La tasa máxima de crecimiento se vio significativamente afectada por el medio ambiente (YPD o jugo de uva), las especies de levadura, la temperatura y por todas las posibles interacciones de estos efectos (como lo muestra un ANOVA de tres vías, todos los efectos principales y las posibles interacciones producidas PAG & lt 0,0001). La figura 3 muestra la magnitud de la interacción entre el medio ambiente, la temperatura y las especies de levadura. Está claro que S. cerevisiae tiene una ventaja en la tasa de crecimiento sobre lasSaccharomyces especies solo en jugo de uva que es & gt20 ° C: aquí S. cerevisiae tiene una ventaja de aptitud promedio de 7.3% por hora (metro = 0,07 nueve días para pasar del 0,1% al 99,9%). La ventaja de S. cerevisiae no es aparente por debajo de 20 ° C en el jugo de uva ni a ninguna temperatura en el medio YPD (no hay una diferencia significativa entre S. cerevisiae y noSaccharomyces en YPD en general PAG = 0.06 el marginal PAG El valor se debe a la mayor tasa de crecimiento de losSaccharomyces especies a 30 ° C). Una posible razón del efecto de la temperatura en el jugo se debe a una interacción entre el pH bajo y la temperatura porque ambos afectan la integridad de la membrana celular: parece que S. cerevisiae se adapta mejor a estas condiciones a través de la retroalimentación evolutiva de la construcción de nichos.

El efecto del medio ambiente y la temperatura sobre la tasa de crecimiento de especies en la comunidad de levaduras. El cambio (media ± SE) en la tasa de crecimiento (según lo estimado por el cambio máximo en la densidad óptica [DO, absorbancia a 660 nm] por hora) de laSaccharomyces (triángulos de cuatro especies, norte = 3 cada uno) y S. cerevisiae (cuadra cuatro aislamientos, norte = 3 cada uno) en YPD (símbolos abiertos, línea discontinua) y jugo de uva (símbolos sólidos, línea sólida) en un rango de temperaturas.


Resultados

Utilizamos los medios informados y las variaciones de fenotipado morfológico cuantitativo de 4.718 cepas YKO haploides [17] para identificar los condensadores fenotípicos. Nuestra definición de trabajo de un capacitor es un producto genético que causa una gran variación en múltiples fenotipos no redundantes cuando se eliminan. Para identificar los productos génicos que cumplen con este criterio, se deben superar tres obstáculos: (1) se debe generar una medida de varianza que no dependa de la media para no confundir los cambios en la varianza con los cambios en el fenotipo medio [18] (2 ) los fenotipos biológica o físicamente redundantes deben eliminarse (reducción dimensional) y (3) debe generarse una puntuación sólida para la varianza general en múltiples fenotipos.

Abordamos el primer obstáculo trazando, para cada fenotipo, la desviación estándar versus la media de cada YKO, ajustando una regresión más baja (ponderada localmente) a cada gráfico y calculando la distancia residual de cada punto de la regresión (Figuras 1B y S1 ). Estos residuos de desviación estándar, que representan una medida de varianza controlada por la media, se estandarizaron para ponderar cada fenotipo por igual.

Para la reducción dimensional, utilizamos la partición alrededor de los medoides (PAM), una variante robusta de la agrupación de k-medias. Al analizar el ancho de silueta promedio, una medida de separación de grupos, estimamos que los 220 fenotipos originales se pueden reducir a 70 fenotipos representativos ("medoides") (Figura S2).

Para generar una sola medida de la varianza fenotípica general cuando se elimina un gen, promediamos los 35 residuos principales (de 70) de la desviación estándar para cada YKO (Tabla S1). Esta puntuación, que denominamos potencial fenotípico, fue extremadamente robusta incluso a grandes cambios en el procedimiento de agrupamiento y promediación y no pareció estar sesgada por los posibles efectos de borde en el procedimiento de bajada (Figuras S3-S6).

Para identificar genes con puntuaciones de potencial fenotípico significativamente más altas de lo esperado por casualidad, comparamos la distribución de puntuaciones de todos los YKO con las distribuciones generadas cuando los valores dentro de cada fenotipo se permutan por primera vez. Sobre la base de este análisis de permutación, los 502 genes con el mayor potencial fenotípico se identificaron como supuestos condensadores fenotípicos con una tasa estimada de falso descubrimiento (FDR) de 0,34 (Figura 1C). Este FDR maximiza el número estimado de verdaderos positivos (Figura S7 y consulte Materiales y métodos). Por lo tanto, estimamos que 333 genes del total de 502 identificados son verdaderos positivos, con un potencial fenotípico más alto de lo que podría predecirse por casualidad. Para el análisis posterior, los 502 genes superiores se separaron en tres clases.Los 60 genes principales de alta confianza (FDR = 0), los siguientes 206 genes de confianza media (límite de FDR = 0.10) y los siguientes 266 genes de baja confianza (límite de FDR = 0.34) se denominan "C1," C2 ". y "C3", respectivamente.

Validación de condensadores fenotípicos

Validamos nuestra identificación de condensadores repitiendo el fenotipado de 50 cepas C1 y 50 cepas de control en nuestro laboratorio. Los mutantes haploides en la biblioteca YKO utilizados para el fenotipado original se pasaron durante un número desconocido de generaciones. Debido a que algunos knockouts podrían aumentar las tasas de mutación y, por lo tanto, causar variabilidad fenotípica que no está asociada con la pérdida de amortiguación ambiental, usamos en su lugar una biblioteca YKO diploide heterocigótica convertible haploide [19] y mantuvimos el número de generaciones entre la esporulación y la fijación en un máximo de ∼50. Las cepas C1 exhibieron más variabilidad fenotípica que las cepas de control (Figuras 2 y S8). Los fenotipos también parecían ser muy heterogéneos entre las cepas C1, lo que sugiere que los knockouts no están todos alterando una pequeña cantidad de procesos de alto nivel que dan como resultado un conjunto limitado de fenotipos. Con las medias fenotípicas y las desviaciones estándar de solo las 100 cepas convertidas en haploides, repetimos el cálculo del potencial fenotípico como se describe anteriormente, utilizando los 70 medoides fenotípicos ya identificados (Figura 2, parte inferior derecha). Nuestra expectativa era que este análisis repetido habría reducido la potencia porque el número proporcionalmente grande de cepas C1 que exhiben una alta varianza sesgaría la regresión más baja para disminuir la magnitud de los residuos. Incluso con esta limitación, encontramos que las puntuaciones de potencial fenotípico eran claramente más altas en las cepas C1 (pag & lt 9,8 × 10 −10, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney). Para una medida menos conservadora del potencial fenotípico, tomamos muestras de los datos de las cepas de condensadores y de control en una proporción aproximada a sus números en el análisis original (cinco a 42), calculamos las puntuaciones en 1000 muestreos repetidos y promediamos todas las 1000 muestras para calcular el resultado final. potenciales fenotípicos (Figura S9). Si bien este análisis todavía da como resultado un sesgo conservador debido a una reducción de los residuos en los bordes de la regresión más baja debido a menos puntos de datos, los capacitores exhiben potenciales fenotípicos ∼2 veces más altos que los controles (pag & lt 2,7 × 10 −10, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney). Una excepción notable es RAD27, que tiene un potencial fenotípico más bajo que todas las cepas de control menos tres en el primer análisis más conservador y todas menos nueve en el análisis de muestreo menos conservador. La deleción de RAD27 causa un fenotipo mutante espontáneo fuerte [20], lo que sugiere que la alta variabilidad fenotípica observada en el YKO original podría deberse a la acumulación de mutaciones. También probamos diez capacitores en las clases C2 o C3 y estos también exhibieron puntajes de potencial fenotípico significativamente más altos que las cepas de control (pag & lt 0,002, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney).

Se muestran micrografías representativas de ejemplos de cepas de condensadores fenotípicos putativos (HPR1, KEM1, SWI6, BEM2, CLA4, DIA2, RAD52) y de control (YDR279W e YCR100C). Las células se tiñen con FITC-concanavalina A (verde), rodamina faloidina (rojo) y DAPI (azul). Abajo a la derecha: histogramas de los potenciales fenotípicos de los YKO de control (negro) y del condensador fenotípico (rojo) de cepas diploides heterocigotas convertidas en haploides.

Como validación adicional, buscamos evidencia en la literatura de capacitores que causan una mayor variabilidad de celda a celda. De hecho, se ha demostrado que los knockouts de los condensadores CCR4, CLN3 y SWI6 dan como resultado una mayor variabilidad en el tamaño de las células diploides en los medios líquidos [21]. La eliminación de CCR4 también causa una morfología irregular de las colonias en un medio sólido, un hallazgo consistente con una mayor variación de célula a célula [22]. Otros dos miembros del complejo central CCR4-NOT, NOT5 y POP2, se identifican como condensadores en nuestra pantalla, lo que sugiere que la interrupción de este complejo regulador transcripcional probablemente resulte en heterogeneidad celular. Además, dos de los tres knockouts que aumentan el ruido de expresión intrínseco del promotor PHO5 son los condensadores ARP8 y SNF6 [23]. Por último, se ha demostrado que la eliminación del condensador FUS3 aumenta la variación de celda a celda en respuesta a una señal de feromona [24].

Los condensadores fenotípicos se enriquecen en varias categorías de ontología genética

A continuación, investigamos el conjunto completo de 502 condensadores para el enriquecimiento en términos de proceso de Gene Ontology (GO http://www.geneontology.org/) (Tabla S2). Los condensadores fenotípicos están altamente enriquecidos en numerosos procesos, la mayoría de los cuales pueden clasificarse ampliamente en mantenimiento y organización del ADN, ciclo celular y organización celular, respuesta a estímulos como el estrés, elongación del ARN o modificación de proteínas. Es probable que este conjunto diverso de términos enriquecidos represente procesos que pueden resultar en amplios cambios celulares cuando se interrumpen.

Específicamente, los condensadores contienen 123 de 565 ORF anotados con "organización cromosómica y biogénesis" y 80 de 275 ORF anotados con su término hijo, "organización de telómeros y biogénesis" (pag & lt 2,9 × 10 −27 y pag & lt 2,1 × 10 −25, respectivamente, distribución hipergeométrica con corrección de Bonferroni). Estos incluyen todos los genes anotados con actividad recombinasa, todo el complejo de holoenzima de telomerasa, todo el complejo RecQ helicasa-Topo III, todos menos un gen del módulo de recombinación homóloga, todos los genes implicados en la reparación posreplicación, todo el complejo CTF18m implicado en la cohesión de cromátidas hermanas. y la señalización del punto de control de la replicación del ADN, todo el módulo MMS22m que se cree que está involucrado en la reparación de roturas de doble cadena, y ambos genes del módulo HEX3m [25]. Sin embargo, es notable que no haya otros módulos que probablemente causen inestabilidad del ADN, incluido el módulo de reparación por escisión de nucleótidos, el módulo de punto de control de daño del ADN RAD9m, el módulo MUS81m involucrado en la escisión del ADN ramificado y el módulo TOF1m involucrado en la promoción de la cohesión de las cromátidas hermanas para reparar el daño del ADN [25].

Los capacitores también incluyen 28 reguladores transcripcionales numerosos productos génicos involucrados en la producción global de ARNm, incluidos todos los miembros del complejo proteína quinasa del dominio carboxi-terminal, la mayoría de los miembros del complejo THO, que se cree que acopla la elongación transcripcional con el metabolismo del ARNm y exporta numerosos poros nucleares. proteínas asociadas, incluidos ambos miembros del complejo de exportación de ARNm SAC3 / THP1 al menos siete productos génicos involucrados en el empalme del ARNm aproximadamente la mitad de los productos génicos anotados en el procesamiento citoplasmático del ARNm (P) genes corporales involucrados en el transporte y degradación de proteínas, incluidos tres miembros del complejo alfa-1,6-manosiltransferasa localizado en Golgi y ocho productos génicos implicados en la acidificación vacuolar y genes implicados en el control de la actina (nueve genes) y la organización de los microtúbulos (12 genes) y en la emergencia o selección de las yemas.

Es probable que los condensadores fenotípicos sean concentradores de red

Las redes de interacción proteína-proteína (PPI) e interacción letal sintética (SLI) tienen un pequeño número de nodos muy conectados (hubs) y muchos más nodos mal conectados [26, 27]. En las redes PPI, es más probable que la eliminación de un concentrador sea letal que la eliminación de otros nodos [26]. Este hallazgo sugiere que las propiedades genéticas son, al menos en parte, rastreables a la arquitectura de la red global. Nuestras simulaciones numéricas de redes transcripcionales implican que es probable que la robustez sea una propiedad emergente de las redes complejas y que, en algunos casos, la arquitectura de la red restringe las propiedades funcionales y evolutivas [15, 16, 28]. Otros han predicho que los SLI son cruciales para comprender el almacenamiento en búfer [29] o que es probable que los condensadores fenotípicos sean concentradores [30,31]. Por lo tanto, preguntamos aquí si el potencial fenotípico de un gen se puede rastrear hasta la posición de la red.

En primer lugar, utilizamos redes derivadas tanto de citas bibliográficas seleccionadas [32] como del conjunto casi completo de interacciones de espectrometría de masas de captura por afinidad [33,34] para determinar si el grado medio de PPI (número de interacciones) de los condensadores es diferente a ese de otros genes. Descubrimos que los condensadores tienen más interacciones físicas que otros productos genéticos no esenciales, pero menos que los productos genéticos esenciales (Figura 3A). Debido a que los condensadores se enriquecen en categorías GO seleccionadas, una posible explicación para el alto grado de condensadores es que caen en categorías GO cuyos miembros tienden a estar altamente conectados. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los condensadores tienen significativamente más interacciones que los genes no esenciales emparejados con GO (Figura S10). Las excepciones a esta regla parecen ocurrir principalmente en las categorías de GO donde los genes esenciales y no esenciales no difieren en el grado de PPI.

(A) El número promedio de interacciones físicas de condensadores fenotípicos de confianza alta (C1, azul oscuro), media (C2, azul) y baja (C3, azul claro) frente a todos los genes no esenciales (gris claro) o esenciales (gris oscuro) utilizando todas las interacciones físicas en la red curada por la literatura de BioGRID (barras sólidas) o solo interacciones de espectrometría de masas de captura por afinidad (rayas diagonales).

(B) El potencial fenotípico promedio de todos los genes no esenciales (cuadrados azules) o genes no esenciales que no se han clasificado como un capacitor fenotípico (triángulos negros) agrupados por su número de PPI de espectrometría de masas de captura por afinidad.

(C) El número promedio de SLI que usan todas las interacciones anotadas en la red BioGRID curada por la literatura (barras sólidas), interacciones derivadas solo de experimentos SGA considerando solo genes usados ​​como cebo (rayas diagonales) e interacciones derivadas solo de experimentos SGA considerando solo genes no se utiliza como cebo (rayas horizontales).

(D) El potencial fenotípico promedio de todos los genes no esenciales (cuadrados azules) o no esenciales (triángulos negros) agrupados por su número de SLI de citas bibliográficas.

(E) Las tasas de crecimiento promedio para las cepas haploides KO (barras sólidas), diploides heterocigotas KO (franjas diagonales) y homocigotas diploides KO (franjas horizontales). Los valores son relativos al tipo salvaje.

(F) El potencial fenotípico promedio de todos los genes no esenciales (cuadrados azules) o no esenciales (triángulos negros) agrupados por sus tasas de crecimiento haploide. Las barras de error representan el error estándar de la media. Todos pag-los valores son una comparación con genes no esenciales, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney: *, pag & lt 0.05 **, pag & lt 0,001 ***, pag & lt 1 × 10 −5 ****, pag & lt 1 × 10 −10.

Un gráfico de potencial fenotípico frente al grado de IBP en contenedor muestra que los productos génicos con una mayor conectividad tienen en promedio un potencial fenotípico más alto (Figura 3B) .Esta relación se explica casi por completo por una mayor proporción de condensadores en los contenedores altamente conectados (Figura S11). Curiosamente, la proporción de condensadores cae precipitadamente a grados PPI por encima de 30, con proporciones similares en los contenedores más alto (& gt80 PPI) y más bajo (& lt3 PPI). La gran mayoría de los genes en este grupo más alto tienen un duplicado en el genoma, incluidas 28 proteínas ribosomales, tres histonas y, en particular, los homólogos de Hsp90: HSP82 y HSC82. Si bien es sorprendente, el hallazgo de que los homólogos de Hsp90 no actúan como condensadores en S. cerevisiae de acuerdo con nuestra definición es consistente con un estudio previo que encontró que la actividad de Hsp90, no el deterioro, permitía que nuevas mutaciones tuvieran una consecuencia fenotípica inmediata [35]. Sin embargo, encontramos un homólogo de la chaperona Hsp70, SSE1, para ser un condensador en la levadura, de acuerdo con estudios en otros miembros de la familia Hsp70 [36].

A continuación, utilizamos todos los SLI de las citas bibliográficas seleccionadas [32] y, de nuevo, encontramos que los condensadores tienen un grado más alto que otros genes no esenciales (Figura 3C, barras sólidas). Debido a que los ensayos SLI a escala del genoma solo se han completado para un subconjunto de genes (∼267 utilizado como cebo en experimentos de matriz genética sintética [SGA]), una posible explicación del alto grado SLI de los condensadores es que es más probable que se utilicen como cebo. Para controlar esta posibilidad, generamos una subred derivada solo de experimentos SGA y dividimos los genes de esta red en los que se habían utilizado como cebo y los que no. Para cada clase, encontramos que los condensadores tienen un mayor grado de SLI que otros genes no esenciales (Figura 3C, barras rayadas). El mayor grado de SLI de los condensadores se mantiene incluso cuando se controla el número de interacciones físicas de un gen (Figura S12) o cuando los condensadores se comparan con otros genes no esenciales dentro de las categorías GO (Figura S13). Un gráfico de potencial fenotípico versus grado SLI agrupados (Figura 3D) muestra que los genes con una conectividad más alta tienen en promedio un potencial fenotípico más alto, esta relación es casi completamente explicable por una mayor proporción de condensadores en los contenedores altamente conectados (Figura S11).

Efectos de los golpes de gracia de los capacitores fenotípicos en la tasa de crecimiento

Hemos demostrado que es probable que los condensadores sean concentradores PPI y / o SLI, que es menos probable que sean completamente redundantes funcionalmente y que están involucrados en una serie de procesos centrales en la celda. En este punto, uno podría preguntarse si la interrupción de la función del condensador tiene un efecto demasiado drástico en la aptitud para desempeñar un papel en la adaptación. Para investigar esta posibilidad, nos preguntamos si los condensadores son menos prescindibles que otros genes no esenciales comparando las tasas de crecimiento de mutantes haploides [37] o diploides [38]. Mientras que los capacitores parecen no tener ningún efecto sobre la tasa de crecimiento en el diploide heterocigoto, son menos prescindibles en knockouts diploides haploides y homocigotos, con una mayor disminución en la tasa observada en el haploide (Figura 3E). Este efecto se mantiene incluso cuando controlamos el grado de PPI (Figura S12) o cuando los condensadores se compararon con otros genes no esenciales dentro de las categorías GO (Figura S14). Los knockouts de genes que dan como resultado tasas de crecimiento drásticamente reducidas (menos del 70% del tipo salvaje) en promedio tienen potenciales fenotípicos más altos (Figura 3F) esta relación se explica por completo por una mayor proporción de condensadores que causan bajas tasas de crecimiento (Figura S11). Sin embargo, en la mayoría de los casos, los capacitores causan disminuciones en la tasa de crecimiento que no son tan severas, con 79% y 95% de los YKO de capacitores que tienen una tasa de crecimiento superior a 0,80 del tipo salvaje en el diploide haploide y homocigoto, respectivamente. De hecho, 124 YKO de condensadores tienen una tasa de crecimiento mayor que los de tipo salvaje.

Los capacitores duplicados y únicos tienen diferentes modos de redundancia funcional

El hallazgo de que muchos de los concentradores PPI más conectados son duplicados pero no condensadores (Figura 3B) sugiere una relación entre la redundancia funcional y el almacenamiento en búfer. Investigamos esto más a fondo preguntando cómo se distribuyen los genes de los condensadores entre los 1.425 duplicados inequívocos y los 2.375 singleton inequívocos que se han identificado en el genoma de la levadura [39-41]. Descubrimos que es más probable que los genes de los condensadores sean singleton que otros genes no esenciales (Tabla 1, pag & lt 0.026, prueba G). Los condensadores únicos y los condensadores duplicados tienden a enriquecerse en diferentes categorías de proceso GO. Los condensadores únicos se enriquecen en las categorías de mantenimiento y organización del ADN, respuesta a estímulos y transcripción y localización del ARN (Tabla S3). Los duplicados de condensadores, aunque en general son más heterogéneos, tienden a enriquecerse más en las categorías de metabolismo de proteínas y endocitosis. A continuación, investigamos si los singletons del capacitor difieren de los duplicados del capacitor en cualquier red o propiedades de dispensabilidad. Tanto los genes de condensadores duplicados como los únicos tienden a tener un gran número de SLI y a provocar disminuciones en la tasa de crecimiento cuando se eliminan en el diploide haploide u homocigoto (Figura S15). Sin embargo, solo los duplicados de capacitores tienden a ser concentradores PPI (Figura 4A).

Número de singletons o duplicados en diferentes clases de genes

(A) El número promedio de interacciones de espectrometría de masas de captura por afinidad de todos los genes no esenciales (gris), todos los singleton no esenciales (verde claro), singletons de capacitor (azul claro), todos los duplicados no esenciales (verde oscuro) y duplicados de capacitor (azul oscuro) ).

(B) Ks (izquierda) y la similitud de expresión (derecha) entre pares duplicados que contienen al menos un gen esencial (gris oscuro), al menos un capacitor (azul oscuro sólido), solo genes sin condensador no esenciales (gris claro sólido), en al menos un producto génico con más de 19 PPI anotados en la red BioGRID curada por la literatura y al menos un condensador (rayas azul oscuro), y al menos un producto génico con más de 19 PPI y sin condensadores o genes esenciales (rayas gris claro).

(C) La abundancia de ARNm (izquierda), la abundancia de proteínas (centro) y el grado SLI (derecha) de los capacitores con un solo parámetro en el genoma (azul) y sus parámetros (verde).

(D) El potencial fenotípico de los condensadores con un solo parámetro en el genoma (azul), sus parálogos (verde) y todos los genes no esenciales (gris). Las barras de error representan el error estándar de la media. A menos que se indique lo contrario, pag-los valores son una comparación con condensadores duplicados, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney: *, pag & lt 0.05 **, pag & lt 0,001 ***, pag & lt 1 × 10 −5 ****, pag & lt 1 × 10 −10.

El hallazgo anterior presenta una aparente contradicción: un alto grado de PPI está fuertemente asociado con la identidad del capacitor en duplicados (Figura 4A), pero muchos duplicados altamente conectados no son capacitores (Figura 3B). La resolución de esta contradicción parece ser que los pares duplicados de capacitores son más antiguos y tienen menos redundancia funcional que otros pares duplicados de concentradores. Usando la tasa de sustitución sinónima (Ks) entre miembros de un par duplicado como una estimación aproximada de la edad del evento de duplicación [39,42], encontramos que los pares duplicados que contienen al menos un capacitor son en promedio menos antiguos que los pares duplicados que contienen al menos un gen esencial y parecen ser más antiguos que los pares duplicados que contienen solo genes sin condensadores no esenciales (Figura 4B). Debido a que las tasas de sustitución se correlacionan negativamente con el nivel de expresión de un gen [43, 44], una explicación de las diferencias en Ks es que los duplicados que contienen al menos un capacitor tienen una distribución de niveles de expresión diferente a la de otros pares duplicados. Sin embargo, encontramos que el patrón persiste incluso cuando controlamos el nivel de expresión de ARNm (Figura S16). La diferencia de edad promedio entre los pares duplicados de capacitores y los pares duplicados no esenciales parece deberse a duplicados recientes (Ks & lt 1), de los cuales hay menos pares duplicados de capacitores que pares duplicados sin capacitores no esenciales (pag & lt 0,002, prueba G, Figura S17). La misma relación se mantiene cuando se comparan solo los pares duplicados del concentrador, que definimos como pares duplicados donde al menos un parámetro tiene un grado PPI ≥ 20. Para calcular esta diferencia, separamos los pares duplicados del concentrador en aquellos que contienen al menos un capacitor y aquellos que no. El grado promedio de PPI de productos génicos en estas dos categorías es aproximadamente el mismo (pag = 0,53, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney).Al comparar estas dos categorías, encontramos que los duplicados de condensadores de concentradores parecen ser más antiguos en promedio debido a la ausencia de eventos de duplicación recientes. La mayor edad promedio de los pares de condensadores duplicados plantea la posibilidad de que sean predominantemente ohnologos, y su origen se remonta a la duplicación del genoma completo en la levadura hace unos 100 millones de años [45]. Sin embargo, no encontramos que ohnologs estuvieran sobrerrepresentados entre los duplicados de capacitores en relación con los duplicados sin capacitores (pag = 0,47, prueba G). La mayor divergencia de sitios sinónimos de pares de condensadores duplicados no parece coincidir con una mayor divergencia, medida por la tasa de sustitución no sinónima (Ka). Para esta comparación, restringimos nuestro análisis a ohnologs para controlar las diferencias en el tiempo de duplicación que podrían introducir errores en Ka / Ks. Las ohnologías de condensadores tienen valores de Ka que no son significativamente diferentes de las ohnologías no esenciales, mientras que las ohnologías esenciales muestran una divergencia marginalmente mayor (Figura S18).

Una diferencia más notable entre los pares duplicados de condensadores y otros pares duplicados fue evidente en las correlaciones en la expresión entre parálogos en muchas condiciones experimentales [39]. Los pares duplicados que contienen al menos un capacitor tienen una similitud de expresión más baja en promedio que los pares duplicados que contienen un gen esencial o pares duplicados no esenciales no capacitadores (Figura 4B). Los pares duplicados de concentradores que contienen al menos un condensador también tienen una similitud de expresión más baja que otros pares duplicados de concentradores no esenciales. Estos hallazgos sugieren que los pares duplicados de capacitores son menos funcionalmente redundantes que otros pares duplicados. Para analizar aún más esta diferencia en la expresión correlacionada, examinamos los 64 pares duplicados que contienen condensadores en los que ambos miembros del par tienen solo un parálogo en el genoma. De estos pares, excluimos dos pares donde ambas copias codifican condensadores (las proteínas ribosomales RPL8A y RPL8B y las mannotransferasas HOC1 y OCH1) y dos pares donde un gen de condensador se empareja con un gen esencial (las ciclinas CDH1 y CDC20 y la UDP- glucosa fosforilasas YHL012W y UGP1), produciendo 60 genes condensadores emparejados con un gen no condensador no esencial. Al comparar solo estos 60 condensadores con sus parámetros, encontramos que es probable que el condensador tenga una abundancia de ARNm y proteínas más alta que su duplicado sin condensador (Figura 4C).

Quizás debido a estas diferencias en el perfil de expresión, el gen del condensador tiene en promedio aproximadamente tres veces más SLI que su parálogo (Figura 4C). La expresión más alta del condensador en el par sugiere que quizás el parámetro sin condensador también tiene un efecto sobre la robustez, pero uno más pequeño que no superó nuestro umbral para la identificación del condensador. Sin embargo, los parálogos sin condensadores no tienen potenciales fenotípicos elevados en comparación con todos los genes no esenciales (Figura 4D, pag = 0,38, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney). De hecho, el análisis del ruido en la abundancia de proteínas [46] sugiere que los paralogs sin condensador podrían ser los objetivos en lugar de las fuentes de amortiguación: los duplicados no esenciales tienen en promedio una mayor variabilidad en la abundancia de proteínas que los singleton no esenciales (pag & lt 2,2 × 10 −3, prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney Figura S15). Un duplicado parcialmente redundante (el gen del condensador) podría amortiguar esta variabilidad, mientras que su eliminación podría exponer esta variabilidad al nivel del fenotipo.

Si se supone que la redundancia funcional incompleta también está causando una alta variabilidad fenotípica en el caso de condensadores singleton eliminados, comprender el mecanismo de este proceso plantea un desafío mayor porque no hay genes candidatos obvios que se superpongan con la función singleton. Una hipótesis es que la redundancia no se logra al nivel del gen único como es el caso de los duplicados, sino más bien al nivel del módulo proteico. De hecho, muchos condensadores singleton forman parte de módulos que se superponen funcionalmente en la red de integridad del ADN [25]. Para probar la hipótesis de que esta es una propiedad más general de los condensadores singleton, examinamos más a fondo sus características de red. El coeficiente de agrupamiento es una medida de la interconectividad de la red local. Los condensadores singleton tienen en promedio coeficientes de agrupamiento más altos en la red PPI que todos los singleton no esenciales, lo que sugiere que están interactuando con grupos de proteínas más estrechamente unidos que podrían representar módulos funcionales (Figura 5A). A pesar de su alta conectividad local, los singletons de capacitores ocupan posiciones menos centrales en la red PPI general que otros singletons no esenciales, según lo medido por la centralidad de intermediación (Figura 5A). Esto está en marcado contraste con los duplicados de capacitores, que tienden a ser más centrales en comparación con otros duplicados no esenciales (Figura S15).


Resultados

Posición filogenética de las cepas

Usamos la secuenciación del genoma completo de cuatro cepas, que exhiben diferentes niveles de tolerancia al etanol (Arroyo-L & # x00F3pez et al., 2010), para investigar la relación entre las diferencias genómicas y la tolerancia al etanol. Nuestro proceso de ensamblaje y anotación nos permitió extraer alrededor de 6000 secuencias codificantes por genoma, de las cuales 2115 secuencias de genes concatenados en común con otras 38 cepas (Tabla complementaria S1), representativas de diferentes linajes puros descritos para S. cerevisiae (Liti et al., 2009), se utilizaron para reconstruir una filogenia ML de múltiples locus (Figura 1). Al observar la ubicación de nuestras cepas, observamos que Temohaya-MI26 no parece agruparse dentro de ninguno de los grupos que seleccionamos, y muestra una posición central en el árbol. Esta cepa puede ser de una población estadounidense diferente no considerada aquí, como la población ecuatoriana descrita recientemente (Peter et al., 2018). Las cepas de vino (T73 y las dos flor cepas) agrupadas con cepas de vino / europeas, pero dentro de dos clados hermanos. Más específicamente, el flor las cepas GBFlor-C y CECT10094 se agrupan con EC1118 y T73 en el otro clado que contiene cepas de vino. La posición de EC118 es consistente con resultados anteriores (Coi et al., 2017) que describen que la cepa EC1118 se agrupa con flor cepas que forman una subpoblación entre las cepas de vino / europeas. Como EC1118 estaba estrechamente relacionado con cepas de alta tolerancia al etanol y mostró una tolerancia intermedia, utilizamos los datos genómicos publicados de esta cepa para un análisis adicional.

Figura 1. Filogenia de S. cerevisiae cepas de diferentes orígenes. Árbol de máxima verosimilitud multilocus de 47 cepas representativas de diferentes clados. Amarillo: Asiático / Sake, Verde: Americano / Roble, Marrón: África Occidental, Naranja: Malayo, Azul: Vino / Europeo, Rojo: Laboratorio. Las referencias de cepas se pueden encontrar en la Tabla complementaria S1.

Los niveles de heterocigosidad difieren entre las cepas

La frecuencia de reproducción sexual y cruzamiento en S. cerevisiae tiene un alto impacto en los niveles de heterocigosidad, lo que puede indicar diferencias en el estilo de vida entre las cepas. Evaluamos los niveles de heterocigosidad aquí calculando el número de posiciones heterocigotas en las regiones codificantes de las cepas estudiadas. Se encuentran grandes diferencias entre las cepas (Tabla complementaria S2). Temohaya-MI26 tiene la heterocigosidad más baja con 2433 posiciones hetrocigotas en el genoma. T73 y GBFlor-C tienen 4586 y 3094 positones heterocigotos, respectivamente. Sin embargo, EC1118 y CECT10094 tienen los niveles más altos de heterocigosidad con 12983 y 13789 SNP heterocigóticos en el genoma, respectivamente, que representan una media de dos SNP por gen en sus genomas. Curiosamente, no se observa ninguna relación entre la tolerancia al etanol y las diferencias en la heterocigosidad.

En general, los SNP heterocigotos estaban presentes de manera uniforme a lo largo del genoma, aunque se observaron varios eventos de pérdida de heterocigosidad (LOH) (Figura 2 y Figura complementaria S1). Estos eventos afectaron grandes porciones de cromosomas, en su mayoría incluidos los extremos de los cromosomas.

Figura 2. Estructura del genoma de las cepas. Panel izquierdo: frecuencias de SNP a lo largo del genoma. La distribución de frecuencias muestra las diferentes ploidías y aneuploidías presentes. Panel derecho: lea la profundidad por cromosomas, suavizada por la media en ventanas de 10 kb, confirme la aneuploidía del cromosoma III en GBFlor-C y CECT10094 y la trisomía del cromosoma XII en CECT10094.

Para identificar posibles genes involucrados en la tolerancia al etanol, verificamos los SNP no sinónimos fijados solo en las cepas CECT10094 y GBFlor-C altamente tolerantes al etanol. Debido a la heterocigosidad y la relación filogénica que estas cepas tienen con EC1118, solo siete cambios de aminoácidos fueron fijados y exclusivos para ambas cepas (Tabla 1). Estos se encuentran en proteínas codificadas por seis genes: CUZ1, GCY1, RPN7, KAR3, DPB2, y ATG13. Con la excepción de CUZ1 y GCY1, estos genes se ubicaron en el brazo derecho del cromosoma XVI, que fue afectado por un evento de LOH compartido por CECT10094 y GBFlor-C. Curiosamente, CUZ1 y RPN7 son dos genes relacionados con las rutas de la ubiquitina y el proteasoma, que son procesos importantes en el mantenimiento de la homeostasis de las proteínas y la degradación de las proteínas desplegadas. Ambos procesos podrían estar relacionados con la presencia de aneuploidías en las cepas estudiadas y su tolerancia al etanol, como se comenta a continuación.

Tabla 1. Genes afectados por cambios no sinónimos exclusivos de CECT10094 y GBFlor-C.

Cepas altamente tolerantes al etanol comparten aneuploidía del cromosoma III

La mayoría de las cepas de S. cerevisiae son diploides, pero se ha demostrado que las cepas industriales, asociadas a entornos relacionados con el ser humano, presentan diferentes niveles de ploidía (Gallone et al., 2016 Peter et al., 2018). Evaluamos nuestras cepas y ploidía por citometría de flujo y descubrimos que T73, CECT10094, EC1118 y Temohaya-MI26 eran diploides. El promedio de citometría de triplicados en comparación con un diploide conocido fue respectivamente: 2.117 & # x00B1 0.029, 2.200 & # x00B1 0.030, 2.196 & # x00B1 0.029, 2.218 & # x00B1 0.027 (Tabla complementaria S3). Por el contrario, se encontró que GBFlor-C era una cepa triploide (3.510 & # x00B1 0.055) (Tabla complementaria S3).

Otro método para confirmar el estado de ploidía es utilizar la distribución de frecuencias de SNP heterocigóticos a lo largo del genoma (Figura 2, panel izquierdo). Las cepas diploides y heterocigóticas mostraron una distribución de frecuencia de SNP alrededor de 0.5, lo que confirma su estado diploide. De la misma manera, GBFlor-C, que es triploide, mostró una distribución de frecuencia SNP típica alrededor de 0.33 y 0.66. Como Temohaya-MI26 es completamente homocigoto, no fue posible confirmar su estado de ploidía con este método.

La rápida adaptación a un entorno estresante puede ser impulsada por reordenamientos genómicos a gran escala. Entre estos, las aneuploidías están recibiendo mucha atención como un motor potencial de adaptación de relevancia industrial en S. cerevisiae (Gorter de Vries et al., 2017). Verificamos la presencia de aneuploidías de dos maneras: cambios en la profundidad de lectura entre cromosomas y cambios en la frecuencia de SNP heterocigotos en comparación con la distribución general de frecuencias del genoma (Figura 2). Curiosamente, las cepas más tolerantes al etanol, CECT10094 y GBFlor-C, eran aneuploides. CECT10094 tenía una copia adicional de los cromosomas XII y III, y GBFlor-C también mostró una copia adicional del cromosoma III. Como la polisomía del cromosoma III se compartió entre estas dos cepas en diferentes antecedentes de ploidía, investigamos más a fondo si esto podría ser importante para explicar su mayor tolerancia al etanol.

La expresión del cromosoma III aumenta con el estrés por etanol

Un mayor número de copias de un cromosoma se relaciona con una mayor expresión de los genes en este cromosoma (Torres et al., 2007). Preguntamos si en este caso la mayor expresión del cromosoma III podría estar relacionada con la tolerancia al etanol. Utilizamos datos transcriptómicos de un estudio anterior (Navarro-Tapia et al., 2016) para arrojar luz sobre la importancia de la expresión de los cromosomas en la tolerancia al etanol. En resumen, se seleccionó la cepa con menor y mayor tolerancia al etanol de un conjunto de cepas de diversas fuentes de aislamiento (Temohaya-MI26 y CECT10094, respectivamente) y se extrajo su ARN después de 1 o 10 h de crecimiento en dos condiciones: después de una Choque de etanol al 10% o sin estrés. Los genes se agruparon por cromosomas para mostrar la contribución global de estos en el perfil de expresión de las diferentes condiciones (Figura 3). La contribución de cada cromosoma en el transcriptoma completo de cada cepa fue diferente, pero aquí nos centramos en el cromosoma III debido a su aneuploidía en las cepas altamente tolerantes al etanol. Sin estrés por etanol, el cromosoma III mostró una expresión significativamente mayor a 1 h de crecimiento en comparación con otros cromosomas en CECT10094 pero no en Temohaya-MI26. A las 10 h de crecimiento, la expresión global del cromosoma III se regula al alza en ambas cepas y en ambas condiciones de crecimiento. Sin embargo, una hora después del estrés por etanol, el cromosoma III se regula significativamente al alza tanto en Temohaya-MI26 como en CECT10094. En Temohaya-MI26, el cromosoma III es el cromosoma sobreexpresado más significativamente en el genoma después de una breve exposición al etanol. Por tanto, el patrón de expresión observado aquí podría estar relacionado con una mayor expresión en CECT10094 debido a la aneuploidía. Además, el cambio en la contribución a la expresión del cromosoma III en Temohaya-MI26 después del choque por etanol es consistente con la presencia de varios genes en el cromosoma que contribuyen a la respuesta al estrés por etanol, incluso en la cepa poco tolerante al etanol.

Figura 3. Respuesta transcripcional al etanol a nivel cromosómico. (A) la expresión multiplicada por el cambio de CECT10094 en comparación con el grupo a 1 y 10 h de crecimiento con 0 y 10% de estrés por etanol. (B) cambio de pliegue de expresión para Temohaya-MI26. Estadística de la prueba de Wilcoxon entre todos los grupos: ns: pag > 0.05, & # x2217 pag & # x003C 0,05, & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0.01, & # x2217 & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0,001, & # x2217 & # x2217 & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0,0001. Los símbolos de significado se colorean en rojo si el cromosoma está regulado al alza y en azul si está regulado a la baja.

Las aneuploidías del cromosoma III afectan el crecimiento del etanol en diferentes orígenes

Varios estudios mostraron que las aneuploidías podrían ser importantes en determinadas condiciones (Gorter de Vries et al., 2017). En particular, la variación del número de copias del cromosoma III se relacionó con una mayor tolerancia al calor (Yona et al., 2012) y se duplicó en experimentos de adaptación al etanol (Voordeckers et al., 2015). En un estudio reciente (Peter et al., 2018), más de 1000 S. cerevisiae las cepas fueron secuenciadas y fenotipadas en varias condiciones. Aquí utilizamos el fenotipo de estrés por etanol al 15% y la información de ploidía y aneuploidía, y agrupamos las cepas para buscar diferencias en la tolerancia al estrés por etanol en un conjunto de antecedentes genéticos más amplio (Figura 4 y Figura complementaria S2). La mayoría de las ploidías y el número de copias de cromosomas no mostraron muchas diferencias en comparación con las cepas diploides que exhibían una euploidía perfecta. Como los grupos son de diferentes tamaños y muchos factores están involucrados en la tolerancia al etanol, las diferencias son difíciles de ver. Sin embargo, en diploides el número de copias del cromosoma III mostró una tendencia específica (Figura 4). Las cepas que carecen de una de las copias cromosómicas fueron significativamente peores que los diploides que crecen en etanol al 15% con respecto a la condición de control. A medida que aumenta el número de copias del cromosoma III, mayor es la tasa de crecimiento relativo exhibida. Las cepas con una copia extra fueron mejores que las euploides con dos copias, y estas mejores que las cepas monosómicas, con un solo cromosoma III.

Figura 4. Tasa de crecimiento relativa de 1011 cepas en etanol al 15%. La tasa de crecimiento relativa es la relación entre el crecimiento de la cepa en YPD a 30 ° C y el crecimiento en etanol al 15%. Las cepas se agrupan por su ploidía y presencia de diferentes aneuploidías. En esta figura solo se presentan diploides, todas las demás ploidías se muestran en la Figura complementaria 2. Las etiquetas Chr III +1, Chr III +2 y Chr III-1 contienen una copia adicional, dos copias adicionales y una copia menos del cromosoma III. respectivamente, y pueden presentar otras aneuploidías. El grupo & # x201COther aneuploidies & # x201D son cepas que tienen diferentes tipos de aneuploidías pero no en el cromosoma III, y los & # x201CEuploids & # x201D no tienen aneuploidía. La importancia es Wilcoxon emparejado con cepas euploides diploides como referencia (ns: pag > 0.05, & # x2217 pag & # x003C 0,05, & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0.01, & # x2217 & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0,001, & # x2217 & # x2217 & # x2217 & # x2217 pag & # x003C 0,0001). Los datos originales se obtuvieron de Peter et al. (2018).

La eliminación de la copia adicional del cromosoma III afecta en gran medida la tolerancia al etanol

Para confirmar que la aneuploidía en el cromosoma III influyó directamente en la tolerancia al etanol de las cepas, eliminamos la copia extra del genoma (ver sección Materiales y métodos), devolviendo las cepas al estado euploide. Desafortunadamente, no pudimos obtener ninguna cepa modificada de CECT10094 y GBFlor-C con el enfoque experimental utilizado. Por lo tanto, utilizamos una cepa desarrollada en laboratorio (2-200-2) obtenida por Voordeckers et al. (2015). Estos autores desarrollaron seis prototróficos, isogénicos S. cerevisiae cepas de diferentes ploidías (1n, 2n y 4n), todas ellas generadas a partir de las cepas haploides FY5 derivado de S288C, en quimiostatos con concentraciones crecientes de etanol (hasta 12%) durante 200 generaciones. Las líneas haploides y tetraploides mostraron una rápida convergencia hacia un estado diploide, y al final del experimento, todos los clones evolucionados fueron altamente tolerantes al etanol, y la mayoría de ellos compartieron la adquisición de una copia extra del cromosoma III, aunque otras aneuploidías específicas. también estaban presentes en algunos clones. El clon evolucionado 2-200-2 es un diploide derivado de haploide con una trisomía del cromosoma III. Como este clon de laboratorio evolucionado compartió esta característica genómica con nuestro flor cepas, se usó en un experimento para probar si su tolerancia al etanol se revertía después de la eliminación de su copia adicional del cromosoma III, mediante el uso de la integración de un marcador de selección / contra-selección.

Primero determinamos el número de copias del cromosoma III en la cepa 2-200-2 y la cepa modificada 2-200-2-S4 por qPCR para confirmar la eliminación de la copia adicional. Usamos cebadores para tres genes diseminados a lo largo del cromosoma y comparamos la dosis cromosómica usando genes de referencia. ACTO 1 e YFR057W del cromosoma VI. Los resultados mostraron que 2-200-2-S4 había perdido una copia adicional del cromosoma III para cada uno de los genes probados, lo que resultó en un número de copias de genes cercano a 2 (1.99 & # x00B1 0.31 para ARE1, 2.14 & # x00B1 0.28 para YCL001W-A y 2.06 & # x00B1 0.20 para POF1).

Después de eliminar la copia extra del cromosoma III, probamos el crecimiento de las cepas 2-200-2 y 2-200-2-S4 en GPY con diferentes concentraciones de etanol (Figura 5). La cepa 2-200-2, que tiene tres copias del cromosoma III, pudo crecer incluso con una concentración de etanol del 14%. 2-200-2-S4, al que se le eliminó la copia extra del cromosoma III, no pudo crecer en medio de etanol al 10%.

Figura 5. La eliminación de la aneuploidía en el cromosoma III disminuye la tolerancia al etanol. Ensayos de prueba de caída de las cepas 2-200-2 y 2-200-2-S4 en placas de etanol.Las placas se incubaron durante 10 días a 28 ° C. 2-200-2 tenía tres copias del cromosoma III y 2-200-2-S4 tenía dos copias. La eliminación de la aneuploidía afecta la tolerancia al etanol.


Agradecimientos

Agradecemos a Stefania Kapsetaki, Guy Cooper, Jacobus Boomsma y dos revisores anónimos por sus comentarios.

Glosario

Cuando varias células individuales están en contacto. Esto incluye células que se unen transitoriamente a través de la producción de una sustancia pegajosa, grupos coordinados de células que muestran comportamientos cooperativos como la producción de bienes públicos y grupos obligados de células que forman organismos multicelulares como vemos en animales y plantas.

Cuando las células individuales forman parte obligatoriamente de un cuerpo multicelular y no pueden sobrevivir y reproducirse fuera del cuerpo multicelular. La multicelularidad obligatoria está determinada por el desarrollo y no es una respuesta a las condiciones ambientales.

Cuando las células individuales pueden convertirse en parte de un cuerpo multicelular en respuesta a las condiciones ambientales, y luego pueden volver a ser unicelulares nuevamente. No dependen de ser multicelulares para sobrevivir y reproducirse. La multicelularidad facultativa incluye ambas formas simples, donde las células se adhieren entre sí para formar un grupo (por ejemplo, algunas biopelículas bacterianas) a formas más complejas con células diferenciadas (por ejemplo, mohos de limo y ciliados).

Una importante transición evolutiva en la individualidad ocurre cuando las unidades individuales (por ejemplo, genes, células o individuos) cooperan y forman un individuo nuevo y más complejo, que posteriormente solo puede reproducirse como un todo.

Una especie obligatoriamente multicelular que ha experimentado una importante transición evolutiva en la individualidad.


Regulación del metabolismo secundario

Alcoholes fusel

Los alcoholes fusel son los componentes volátiles más abundantes producidos durante la fermentación y contribuyen a los aromas y sabores esenciales en bebidas y alimentos fermentados (Hazelwood et al. 2008). Los alcoholes fusel incluyen propanol, alcohol isoamílico, isobutanol, alcohol amílico activo, 2-feniletanol y tirosol (Swiegers y Pretorius 2005). Los alcoholes fusel se forman a través de la vía de Ehrlich o mediante el metabolismo del carbono central (Figura 2A). El primer paso en la vía de Ehrlich es una reacción de transaminación entre un aminoácido y 2-oxoglutarato (Sentheshanmuganathan 1960). El paso de transaminación convierte el aminoácido en un α-cetoácido, que también puede ser suministrado por el metabolismo del carbono central (Sentheshanmuganathan 1960). Posteriormente, múltiples piruvato descarboxilasas catalizan la conversión del α-cetoácido en un aldehído de cadena ramificada (Sentheshanmuganathan 1960). Por último, una alcohol deshidrogenasa cataliza el paso final dependiente de NADH que reduce el aldehído a un alcohol fusel (Figura 2A) (Hazelwood et al. 2008). No se conocen todas las enzimas implicadas en la catálisis de esta vía. Una de las dificultades para dilucidar las proteínas específicas necesarias para la producción de alcohol fusel es un alto grado de redundancia en el genoma de la levadura. La presencia de múltiples genes de aminotransferasa, descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa plantea desafíos en los enfoques genéticos tradicionales para estudiar la producción de fusel.

Vías metabólicas que conducen a la formación de compuestos aromáticos (Carrau et al.2005) producidos por Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación. (A) La vía del alcohol fusel (a través de la vía de Ehrlich) transforma un aminoácido en un alcohol en varios pasos. Los aminoácidos en esta vía incluyen leucina (L), valina (V), isoleucina (I), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). (B, C) La formación de ésteres requiere un alcohol. El alcohol puede ser etanol o un alcohol fusel. (B) La ruta del éster de acetato. (C) La vía de síntesis del éster etílico. (D) Síntesis in vivo de monoterpenos a través de la vía del mevalonato. Cajas rojas: compuestos aromáticos volátiles.

Los alcoholes fusel pueden tener impactos sensoriales positivos o negativos, dependiendo de su concentración. Las concentraciones de alcohol fusel de 400 mg / L o más pueden dar como resultado un aroma picante similar a un solvente en el vino, mientras que las concentraciones de menos de 300 mg / L a menudo se describen como que imparten una característica afrutada deseable (Swiegers y Pretorius 2005). En las sidras, las altas concentraciones de alcoholes fusel, particularmente 2-feniletanol, contribuyen de manera importante al sabor típico de la sidra (Beech 1972). Se describe que el propanol, el butanol y el isobutanol tienen un olor alcohólico, mientras que el alcohol amílico activo y el alcohol isoamílico se describen con un aroma similar al de mazapán o de plátano (Lambrechts y Pretorius 2000). El tirosol y el 2-feniletanol imparten aromas florales y similares a la miel, respectivamente (Lambrechts y Pretorius 2000). En concentraciones apropiadas, los alcoholes fusel imparten una complejidad beneficiosa y también sirven como precursores para la formación de ésteres de acetato.

Acetato y ésteres etílicos

Los ésteres contribuyen a las características florales y afrutadas asociadas con los vinos y la cerveza y se generan por la esterificación de alcohol y ácidos a pH bajo (Saerens et al. 2010). La reacción requiere una molécula de alcohol, acetil-CoA, una enzima sintetizadora de ésteres y trifosfato de adenosina (ATP Figura 2B y 2C) (Saerens et al. 2010). Tanto la producción como la degradación de ésteres están estrictamente reguladas.

Los dos tipos de ésteres que se producen durante la fermentación son el acetato y los ésteres etílicos. Los ésteres de acetato resultan de la esterificación de acetil-CoA y un alcohol (Figura 2B). Estos acetatos incluyen acetato de etilo, acetato de isoamilo, acetato de 2-metilbutilo y acetato de feniletilo, y se describe que tienen dulzor de plátano, manzana, fruta y aromático, respectivamente (Saerens et al. 2010). El acetato de etilo es el éster de acetato más común en las fermentaciones, principalmente debido a las grandes cantidades de etanol en estos procesos metabólicos y la naturaleza más reactiva de los alcoholes primarios (Saerens et al. 2010).

La regulación de la producción de éster de acetato está controlada principalmente por la expresión de dos alcohol acetiltransferasas (AATasa), Atf1p y Atf2p (Figura 2B) (Yoshimoto et al. 1998). Atf1p tiene la mayor actividad de AATase introduciendo múltiples copias de ATF1 en cepas de laboratorio da como resultado una mayor producción de ésteres de acetato (Verstrepen et al. 2003). En contraste, la deleción de Atf1p disminuye significativamente la concentración de éster de acetato (Verstrepen et al. 2003). La producción de ésteres de acetato también depende del sustrato, dependiendo de la disponibilidad de alcoholes fusel (Lilly et al. 2006).

El segundo grupo, los ésteres etílicos, está compuesto por etanol y un ácido graso de cadena media (AGCM) (Figura 2C) (Saerens et al. 2010). Los ésteres etílicos incluyen butanoato de etilo, hexanoato de etilo, octanoato de etilo y decanoato de etilo (Saerens et al. 2010). Estos ésteres etílicos varían en sus atributos sensoriales, pero las descripciones incluyen manzana, fruta, fresa, pera y anís (Saerens et al. 2010). Durante la fase de crecimiento exponencial tardío, los intermedios de MCFA se liberan prematuramente del complejo citoplasmático de ácidos grasos sintasa (FAS), y esta liberación desencadena la síntesis de ésteres (Taylor y Kirsop 1977). Los MCFA son activados por la coenzima A y esterificados junto con ATP, etanol y enzimas (Figura 2C) (Saerens et al. 2010).

La evidencia experimental apunta a tres vías reguladoras responsables de la liberación de MCFA y la posterior producción de ésteres etílicos: (1) disminución de la actividad de la acetil-CoA carboxilasa (2) regulación positiva de los genes de biosíntesis de ácidos grasos FAS1, FAS2, EEB1, y EHT1 y (3) concentraciones de MCFA (Saerens et al. 2006, Dufour et al. 2008). La inhibición de la acetil-CoA carboxilasa inicia la liberación de MCFA del complejo FAS (Dufour et al. 2008). Supresión de EEB1 y EHT1 disminuye la producción de ésteres etílicos sin embargo, la sobreexpresión de ambas enzimas no da como resultado un aumento de estos ésteres (Saerens et al. 2006). Se han implicado varios genes en la producción y degradación de ésteres; sin embargo, todavía no se han identificado los vínculos directos entre precursores, actividad enzimática, concentración de sustrato y producción de ésteres, particularmente no para los ésteres etílicos.

Carbonilos: diacetilo

Se describe que el diacetilo tiene un aroma tostado, a caramelo y a nuez, pero en altas concentraciones huele a mantequilla rancia (Swiegers y Pretorius 2005). Las células de levadura pueden sintetizar diacetilo durante la fermentación en el vino, sin embargo, el diacetilo es producido predominantemente por bacterias del ácido láctico (Laurent et al. 1994). El diacetilo se forma extracelularmente por descarboxilación impulsada químicamente del α-acetolactato. El α-acetolactato se sintetiza como un intermedio en la ruta del 2-cetoisovalerato o se produce a partir de acetaldehído por Ilv2p (Figura 1) (Suomalainen y Ronkainen 1968). Posteriormente, el diacetilo se convierte en acetoína, seguida de la conversión de acetoína en 2,3-butanodiol, los cuales tienen un umbral sensorial más alto y, por lo tanto, un impacto sensorial menor (Swiegers y Pretorius 2005).

Compuestos de azufre

Los compuestos que contienen azufre tienen un umbral de detección sensorial muy bajo y, a menudo, se describen con un aroma a repollo, huevo podrido o cebolla (Rauhut 1993). Hay cinco categorías de compuestos de azufre: sulfuros, polisulfuros, tioles, tioésteres y compuestos heterocíclicos (Rauhut 1993). Los compuestos aromáticos de azufre se originan a partir de fungicidas que contienen azufre o de la degradación de aminoácidos que contienen azufre durante la fermentación, sin embargo, las vías responsables de estos procesos no se han aclarado completamente (Rauhut 1993).

Sulfuro de hidrógeno (H2S) contribuye a una de las notas de azufre primarias que se produce durante la fermentación por la vía de la secuencia de reducción de sulfato. En esta vía, el sulfato se absorbe del medio externo a través de una permeasa de sulfato (Sul1p o Sul2p) y se reduce a sulfito y luego a sulfuro a través de Met5p y Met10p, respectivamente (Rauhut 1993, Spiropoulos y Bisson 2000). En presencia de concentraciones no limitantes de cisteína o metionina, el sulfuro se combina con O-acetilserina o O-acetilhomoserina para formar homocisteína (Swiegers y Pretorius 2005). En condiciones limitadas por metionina y cisteína, O-acetilserina y O-acetilhomoserina también son limitadas, lo que resulta en un exceso de sulfuro que se convierte en H2S (Thomas y Surdin-Kerjan 1997).

El uso agrícola de azufre elemental, deficiencia de pantotenato y altas concentraciones de treonina también puede afectar el H2Producción de S durante la fermentación (Spiropoulos y Bisson 2000). El sulfuro de hidrógeno es muy reactivo, lo que a menudo produce notas extrañas adicionales en el vino. Una de las notas apagadas más comunes producidas como resultado de H2La reactividad S es el etanotiol, que se forma cuando H2S reacciona con el etanol (Spiropoulos y Bisson 2000). El sulfuro de hidrógeno se puede eliminar del vino mediante extracción de cobre o aireación con nitrógeno, pero estos tratamientos también pueden eliminar valiosos compuestos aromáticos (Swiegers y Pretorius 2005).

A diferencia de otros compuestos de azufre, los tioles volátiles tienen características aromáticas beneficiosas. Los aromas de los tioles volátiles se describen como boj, maracuyá, grosella negra o pomelo (Tominaga et al. 1998). Estos compuestos son a menudo S-cisteína- o glutatión unidos a la uva o al lúpulo y se liberan durante la fermentación (Tominaga et al. 1998). Irc7p y Str3p rompen el enlace carbono-azufre entre la cisteína y el tiol para liberar el aroma (Figura 1) (Tominaga et al. 1998).

Los tres tioles volátiles más impactantes son 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP), 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) y acetato de 3-mercaptohexilo (3MHA). Harsch y col. (2013) identificaron (E) -2-hexenal y su alcohol correspondiente, (E) -2-hexen-1-ol, como precursores de la formación de 3MH (Harsch et al. 2013). Este trabajo estableció el potencial para mejorar 3MH y 3MHA en presencia de un donante de azufre y (E) -2-hexenal y (E) -2-hexen-1-ol, abriendo la puerta a la posibilidad de usar levadura para mejorar la producción. de tioles aromáticos positivos (Figura 3) (Harsch et al. 2013).

La vía predicha que conduce a la producción de tioles aromáticos 3-mercaptohexan-1-ol (3-MH) y acetato de 3-mercaptohexilo (3-MHA) (adaptado de Harsch et al. 2013). Cuando los precursores de seis carbonos (C6), (E) -trans-2-hexen-1-ol y (E) -trans-2-hexanal tiene una relación relativa mayor que uno y un donante de azufre está presente, la reacción se impulsa para producir 3-MH y 3-MHA. Cuando comienza la fermentación, las células de levadura liberan el aroma tiol 3-MH La acetilación de 3-MH da como resultado 3-MHA.

Terpenoides

Los terpenoides son una clase de compuestos aromáticos que definen las características varietales en frutas y lúpulos, produciendo aromas descritos como rosa, geranio y floral (Swiegers y Pretorius 2005). Los terpenoides son componentes esenciales del sabor en muchos productos comerciales, incluidos el vino, la cerveza, los aditivos alimentarios, los perfumes y los cosméticos. Optimizar la producción de terpenos volátiles durante la fermentación de la levadura es un objetivo importante en la fermentación industrial.

Los monoterpenoides son producidos por el precursor pirofosfato de geraniol (GPP) en plantas y algunos hongos (King y Richard Dickinson 2000). Vitis vinifera (vides) y Humulus lupulus (lúpulo) sintetizan monoterpenoides como geraniol, linalol, nerol y citronelol (Swiegers y Pretorius 2005). Los terpenoides se encuentran tanto en forma libre como enlazada, siendo la forma enlazada más prevalente (Swiegers y Pretorius 2005). Las enzimas glucosidasas de levadura liberan y volatilizan estos compuestos aromáticos durante la fermentación (Figura 1) (Gunata et al. 1988).

La liberación enzimática de monoterpenos es un proceso de una o dos etapas, dependiendo del azúcar unido al glucósido precursor (es decir, un mono o disacárido) (Gunata et al. 1988). Para los glucósidos disacáridos, el primer paso implica la liberación del azúcar terminal a través de una arabinofuranosidasa, ramnopiranosidasa o apiofuranosidasa, seguida de la escisión de la β-glucosidasa que libera el terpenoide (Gunata et al. 1988). Las cepas de vino que sobreexpresan la proteína de la pared celular Exg1p producen niveles elevados de terpenos tanto en los medios sintéticos como en el mosto de uva (Gil et al. 2005).

La producción de terpenoides se ha atribuido principalmente a la hidrólisis de enlaces glicosídicos, sin embargo, S. cerevisiae es capaz de producir monoterpenos a través de la vía del ácido mevalónico (Figura 2D). Carrau y col. (2005) mostró que S. cerevisiae y Hanseniaspora uvarum puede producir terpenos en un medio químicamente definido que carece de jugo de uva, terpenos y glicoconjugados. Este trabajo reveló que el linalol y el α-terpineol fueron producidos por S. cerevisiae en condiciones microaeróbicas y de alto contenido de nitrógeno asimilable en medios sintéticos. Carrau y col. (2005) han predicho una vía alternativa para la síntesis de monoterpenos (Figura 2D) en esta vía, los monoterpenos se forman de novo en las mitocondrias y se vinculan al catabolismo de la leucina y una nueva GPP sintasa. Se ha estudiado y establecido en el hongo un vínculo entre el catabolismo de la leucina y el metabolismo isoprenoide. Aspergillus nidulans, dando prioridad a esta vía alternativa (Rodríguez et al. 2004).


Resultados y discusión

Construcción de una vía de utilización de xilosa en una cepa productora de alcohol graso

Para producir el 1-hexadecanol basado en xilosa, primero introdujimos la vía de utilización de la xilosa fúngica [29] en una vía de producción de 1-hexadecanol. S. cerevisiae cepa, XF3 [10] (Fig. 1). La vía de utilización de la xilosa se seleccionó de nuestro estudio anterior [29], que incluyó una XR de Candida shehatae, un XDH de Candida tropicalis y un XKS de Pichia pastoris. La cepa XF3 produjo 1-hexadecanol a más de 1,1 g / L a partir de glucosa en S. cerevisiae como se informó en nuestro estudio anterior [10]. La producción de 1-hexadecanol en XF3 se logró expresando heterólogamente un FAR de lechuzas comunes, sobreexpresando acetil-CoA carboxilasa (ACC1 gen), anulando un regulador negativo, RPD3 gen, en la síntesis de fosfolípidos, y sobreexpresión de ATP-citrato liasas (ACL1 gen y ACL2 gen) de Yarrowia lipolytica para mejorar el suministro de acetil-CoA citosólico (Fig. 1a). Al introducir la vía de utilización de la xilosa fúngica en la cepa XF3, generamos con éxito una S. cerevisiae cepa (XF3XP) para producir el 1-hexadecanol a partir de xilosa como única fuente de carbono a 0,4 g / L (Tabla 2). El título de alcohol graso a base de xilosa fue más bajo que el título de 1-hexadecanol basado en glucosa [10] y solo se consumieron 15 g / L de xilosa para producir 1-hexadecanol, lo que indica que la utilización de xilosa podría ser un paso limitante para el alcohol graso producción. También introdujimos otra vía de xilosa fúngica en la que las fuerzas promotoras de XR, XDH y XKS se optimizaron previamente para aumentar la producción de etanol a base de xilosa (XF3XPi, Tabla 2). Descubrimos que, aunque la producción de 1-hexadecanol podía aumentarse a 0,48 g / L, la utilización de xilosa era incluso peor que la vía de tipo salvaje con menos de 5 g / L de xilosa consumida. Esto posiblemente se deba al hecho de que el mecanismo regulador adoptado por S. cerevisiae controlar la producción de alcohol graso a base de xilosa era diferente de controlar la producción de etanol a base de xilosa. Por lo tanto, la ingeniería metabólica de S. cerevisiae para la producción de biocombustibles es un objetivo específico.

Ingeniería promotora para mejorar la producción de 1-hexadecanol a partir de xilosa

Para mejorar aún más la producción de 1-hexadecanol, implementamos un enfoque de biología sintética llamado Optimización personalizada de vías metabólicas por ingeniería transcripcional combinatoria (COMPACTER) [28] para controlar con precisión los niveles de expresión génica de XR, XDH y XKS. Básicamente, elegimos tres promotores constitutivos, PPDC1, PAGTEF1, y PENO2 para expresar los genes XR, XDH y XKS, respectivamente. Para cada uno de los promotores constitutivos, mutamos los promotores originales para crear una biblioteca de promotores con diferentes fuerzas. Luego seleccionamos promotores con fuerzas altas, medias y bajas (archivo adicional 1: Figura S2) para PPDC1, PAGTEF1, y PENO2, respectivamente, y construyó un total de 27 vías de xilosa sintética (3 × 3 × 3 = 27) en S. cerevisiae con todas las combinaciones de promotores de PPDC1, PAGTEF1, y PENO2 con diferentes fortalezas (Fig. 1b Tabla 1). A continuación, comparamos las tasas de crecimiento y los títulos de 1-hexadecanol de todos los compuestos recombinantes. S. cerevisiae cepas a la de las cepas de control, XF3XP (Fig. 2). Vale la pena señalar que el propósito de la selección combinatoria de promotores era encontrar la cepa con la mayor producción de alcohol graso a partir de xilosa en lugar de la cepa de mejor utilización de xilosa. Por lo tanto, no medimos aquí las tasas de utilización de xilosa. Descubrimos que las tasas de crecimiento de la mayoría de las cepas modificadas por promotores se redujeron hasta cierto punto y que la producción de 1-hexadecanol para la mayoría de las cepas recombinantes no mejoró significativamente. Sin embargo, las cepas XF3X07 y XF3X25 produjeron 1-hexadecanol a 171 y 140% más que las cepas de control con tasas de crecimiento ligeramente inferiores (0.073 h −1 y 0.080 h −1) en comparación con la tasa de crecimiento de la cepa de control (0.093 h −1). Tanto XF3X07 como XF3X25 utilizaron un promotor TEF1 de alto nivel para expresar XDH y un promotor ENO2 de bajo nivel para expresar XKS.Sin embargo, XF3X07 usó un promotor PDC1 de bajo nivel para expresar XR mientras que XF3X25 usó un promotor PDC1 de alto nivel. Este descubrimiento es consistente con estudios previos que muestran que las enzimas XDH eran pasos limitantes en la conversión de xilosa en biomasa y etanol [30, 31]. Curiosamente, a pesar del título más alto de 1-hexadecanol en XF3X07 en comparación con XF3XPi, los rendimientos de 1-hexadecanol basado en xilosa fueron similares en XF3XP07 y XF3XPi (pag & gt 0,1). Esto indicó que la ingeniería combinatoria del promotor mejoró principalmente la tasa de absorción de xilosa en lugar de optimizar las vías del huésped para mejorar la conversión de xilosa en 1-hexadecanol.

1-hexadecanol producido y tasas de crecimiento de ingeniería S. cerevisiae cepas mediante ingeniería de promotores. Todas las cepas se cultivaron en medio SC-xilosa (4%) durante 48 h. los barras con color más claro fueron los valores para la cepa de control (es decir, XF3XP) con la vía de utilización de xilosa utilizando los promotores nativos

Correlacionamos las fortalezas de los promotores de XR, XDH y XKS con los dos parámetros medidos, las concentraciones de 1-hexadecanol y las tasas de crecimiento (archivo adicional 1: Figura S3). No se observó correlación entre la fuerza del promotor y las concentraciones de 1-hexadecanol. Tampoco encontramos la correlación entre las fortalezas de los promotores y las tasas de crecimiento. También correlacionamos las concentraciones de 1-hexadecanol y las tasas de crecimiento, pero tampoco encontramos ninguna correlación entre ellas (archivo adicional 1: Figura S4). Por lo tanto, no es factible utilizar únicamente los resultados del cribado de promotores para realizar predicciones sobre la elección de los promotores que deberían utilizarse para la producción de 1-hexadecanol basada en xilosa. Esto se debe a que la introducción de vías de xilosa desencadenaría el recableado metabólico global, como descubrimos anteriormente al investigar las respuestas metabólicas a diferentes vías de utilización de xilosa a través del análisis de flujo metabólico de 13 C [32]. Este recableado metabólico global implica la reprogramación no solo de la vía de la xilosa en sí, sino también de las vías posteriores, lo que hizo que el metabolismo de la xilosa fuera demasiado complejo para correlacionarlo con la actividad de la vía de utilización de la xilosa en sí.

Ingeniería evolutiva para mejorar la producción de 1-hexadecanol a partir de xilosa

A continuación, elegimos XF3X07 y XF3X25 como nuestras cepas objetivo para una mayor ingeniería evolutiva para mejorar la producción de 1-hexadecanol. La ingeniería evolutiva se ha utilizado ampliamente para mejorar la utilización de pentosa y la producción de etanol a base de xilosa en S. cerevisiae con éxito [33–35]. Teniendo en cuenta la escasa absorción de xilosa en nuestras cepas diseñadas, implementamos la ingeniería evolutiva para investigar si la producción de alcohol graso está asociada al crecimiento y, de ser así, para mejorar aún más la producción de alcohol graso a base de xilosa. De manera similar al estudio de selección de promotores combinatorios, nuestro objetivo de la ingeniería evolutiva es buscar una cepa de levadura que pueda producir alcoholes grasos a partir de xilosa tanto como sea posible. Por lo tanto, no medimos las tasas de utilización de xilosa. En general, transferimos en serie la cepa XF3X07 y XF3X25 a un medio sintético con 40 g / L de xilosa dos veces. Es decir, la cepa optimizada fue la segunda generación desarrollada a partir de la cepa de tipo salvaje. Descubrimos que las tasas de crecimiento de dos cepas aumentaron gradualmente (

35%) para cada ronda como se esperaba. Sin embargo, tal aumento se asoció con una producción reducida de 1-hexadecanol. Por ejemplo, la tasa de crecimiento más alta se alcanzó tanto para XF3X07 como para XF3X25 con el título más bajo de 1-hexadecanol en la segunda ronda (Fig. 3). Las tasas de crecimiento de las cepas evolucionadas en la última ronda aumentaron significativamente para XF3XP07 y XF3XP25 (pag & lt 0,05). Sin embargo, las producciones de 1-hexadecanol no cambiaron significativamente (pag & gt 0,05). Tal discrepancia indicó que el 1-hexadecanol, a diferencia del etanol, no era un producto asociado al crecimiento. Dado que la ingeniería evolutiva selecciona la cepa mutante con mayor tasa de crecimiento, la producción de 1-hexadecanol no pudo mejorarse más a través de la evolución adaptativa debido al desacoplamiento entre la tasa de crecimiento celular y la producción de alcohol graso. Además, aplicamos análisis de balance de flujo para calcular la síntesis de ATP, NADH y NADPH en diferentes producciones de 1-hexadecanol (archivo adicional 1: Figura S5). Encontramos que la síntesis de NADPH y ATP se correlacionó positivamente con la producción de 1-hexadecanol, mientras que la síntesis de NADH no cambió demasiado con la síntesis de 1-hexadecanol. En general, el enfoque de ingeniería evolutiva sería útil para mejorar el crecimiento celular y los productos asociados al crecimiento, como el etanol, pero no para los productos no asociados al crecimiento, como los productos químicos derivados de ácidos grasos.

Ingeniería evolutiva de XF3X07 y XF3X25. Producción de 1-hexadecanol (a) y tasas de crecimiento (B) de XF3X07 y XF3X25 en cada ronda se normalizaron con el título de 1-hexadecanol y las tasas de crecimiento de XF3X07 y XF3X25 en la ronda cero, respectivamente

Fermentación por lotes y por lotes para la producción de 1-hexadecanol

Con XF3XP07 como nuestra mejor cepa para producir 1-hexadecanol a base de xilosa, a continuación caracterizamos su producción de 1-hexadecanol mediante fermentación por lotes y por lotes alimentados. En la fermentación por lotes, encontramos que se produjo 0,79 g / L de 1-hexadecanol a partir de 7,8 g / L de xilosa, con una tasa de crecimiento celular de 0,073 h -1 (Tabla 2). Este título de 1-hexadecanol de XF3XP07 es significativamente más alto que el de la cepa XF3XP y XF3XPi (pag & lt 0,05). Más interesante aún, al comparar las captaciones de xilosa de XF3XP y XF3XPi, encontramos que la cepa XF3XP consumía tres veces más xilosa que la cepa XF3XPi. Esta xilosa adicional se utilizó principalmente para producir más etanol en las cepas XF3XP (Tabla 2). Además, hemos medido la acumulación de 1-hexadecanol intracelular, que era menos del 5% de la concentración extracelular de 1-hexadecanol de la capa orgánica. Esta baja acumulación concuerda con varios estudios previos en los que la levadura se cultivó con una capa orgánica [36], aunque también se informó que S. cerevisiae las cepas pueden acumular una gran cantidad de alcoholes grasos intracelularmente cuando se cultivan sin la capa orgánica [37].

En la fermentación por lotes alimentados, usamos células en reposo para la fermentación, es decir, la densidad celular se mantuvo en un nivel alto para evitar el uso de xilosa para producir biomasa. Aunque la fermentación a una densidad celular alta podría limitar el suministro de oxígeno para la fermentación, que es un factor importante para la expresión óptima de los genes de la vía de la xilosa [38], la tasa de crecimiento neto marginal de las células de levadura podría ser más importante en los lotes de alimentación. fermentación porque se encontró en este estudio que la producción de alcohol graso no estaba asociada con el crecimiento y, por lo tanto, al eliminar la producción de biomasa, las células de levadura podrían servir como biocatalizadores para convertir la xilosa en 1-hexadecanol con alta eficiencia. Descubrimos que una fase de retraso prolongada que dura alrededor de 40 h en la fermentación por lotes alimentados, que podría deberse a la represión del residuo de glucosa del inóculo, ya que cultivamos XF3XP y XF3XP07 con 20 g / L de glucosa antes de transferir las células al medio. con xilosa y, por tanto, las células necesitaban mucho tiempo para acostumbrarse a la xilosa de la glucosa (Fig. 4). Para la cepa XF3XP, el 1-hexadecanol se ha producido rápidamente con un bajo consumo de xilosa y se ha logrado

0,6 g / L de 1-hexadecanol a las 48 h (Fig. 4a). Para la cepa XP3XP07, después de la fase de retardo larga, se produjo 1-hexadecanol rápidamente con la captación aumentada de xilosa y alcanzó el título más alto de 1-hexadecanol a 1,2 g / L a las 69 h (Fig. 4b). Sin embargo, al continuar la fermentación por lotes alimentados para ambas cepas, disminuyeron tanto las concentraciones de 1-hexadecanol como las tasas de absorción de xilosa. La baja tasa de consumo de xilosa observada acompañada de la disminución de la DO600 sugirió una inanición debido a la incapacidad de absorber más el sustrato de carbono y la probable limitación por otros nutrientes como el nitrógeno y el fosfato después de las 50 h de fermentación. En nuestro estudio anterior [10], encontramos que los alcoholes grasos podrían ser absorbidos por S. cerevisiae, lo que podría ser la razón de la disminución de la producción de alcohol graso cuando la utilización de xilosa se volvió limitada.

Fermentación por lotes alimentados de la producción de 1-hexadecanol a base de xilosa por a XF3XP y B XF3XP07. Se detectó etanol como el único subproducto distinto del 1-hexadecanol. Cuadrado negro la concentración de 1-hexadecanol triangulo azul la xilosa consumida punto rojo sobredosis600

Comparando la producción de alcohol graso a base de xilosa con la basada en glucosa en el estudio anterior, se ha observado un título similar de alcohol graso de la fermentación por lotes, lo que demuestra la integración exitosa de la vía de utilización de xilosa y la vía de producción de alcohol graso. Sin embargo, los rendimientos de los alcoholes grasos a base de xilosa tanto en la fermentación por lotes (0,10 ± 0,02 g / g) como en la fermentación por lotes (0,08 ± 0,01 g / g) fueron mucho más altos que los de los basados ​​en glucosa (

0,03 y & lt0,01 g / g), respectivamente. Los rendimientos máximos teóricos a través de esta vía de producción de xilosa y glucosa fueron

0,35 (g / g), respectivamente. En este caso, el rendimiento de la xilosa alcanzó casi un tercio del rendimiento teórico, mientras que el rendimiento de la glucosa sólo alcanzó menos del 10% del rendimiento teórico. La derivación de la producción de etanol cuando se alimenta con xilosa en lugar de glucosa probablemente se atribuye al alto rendimiento de 1-hexadecanol a base de xilosa, que podría desviar más carbonos para utilizarlos en la producción de alcohol graso en lugar de en la producción de etanol.


Introducción a Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (comúnmente conocida como levadura de panadería y rsquos) es un eucariota unicelular que se utiliza con frecuencia en la investigación científica. S. cerevisiae es un organismo modelo atractivo debido al hecho de que su genoma ha sido secuenciado, su genética se manipula fácilmente y es muy fácil de mantener en el laboratorio. Debido a que muchas proteínas de levadura son similares en secuencia y función a las que se encuentran en otros organismos, los estudios realizados en levadura pueden ayudarnos a determinar cómo funciona un gen o proteína en particular en eucariotas superiores (incluidos los humanos).

Este video proporciona una introducción a la biología de este organismo modelo, cómo se descubrió y por qué los laboratorios de todo el mundo lo han seleccionado como su modelo de elección. También se comentan estudios previos realizados en S. cerevisiae que han contribuido a nuestra comprensión de procesos celulares importantes como el ciclo celular, el envejecimiento y la muerte celular. Finalmente, el video describe algunas de las muchas formas en que las células de levadura se ponen a trabajar en la investigación científica moderna, incluida la purificación de proteínas y el estudio de los mecanismos de reparación del ADN y otros procesos celulares relacionados con las enfermedades de Alzheimer & rsquos y Parkinson & rsquos.

Procedimiento

Saccharomyces cerevisiae, también conocida como levadura baker & rsquos, es uno de los muchos organismos modelo estudiados en laboratorios de todo el mundo. Debido a que su genoma ha sido secuenciado, su genética se manipula fácilmente y es fácil de mantener en el laboratorio, esta especie de levadura ha sido un recurso invaluable en la comprensión de procesos celulares fundamentales como la división celular y la muerte celular. Este video le dará una descripción general de este organismo modelo y su amplia gama de aplicaciones en la investigación biológica y biomédica.

La levadura pertenece al dominio Eukaryota, que se compone de organismos con núcleos unidos a la membrana, denominados eucariotas. Junto con hongos y mohos, S. cerevisiae Pertenece al Reino de los Hongos debido a la presencia de una pared celular hecha de quitina, un polímero polisacárido que se encuentra no solo en los hongos, sino también en los exoesqueletos de insectos y crustáceos.

Curiosamente, muchas proteínas que se encuentran en la levadura comparten secuencias similares con proteínas de sus compañeros eucariotas. Estas proteínas son a menudo homólogas y sus secuencias similares indican que los organismos comparten un ancestro común. Al investigar la función de una proteína determinada en la levadura, los investigadores obtienen información sobre la función de las proteínas y los rsquos en eucariotas superiores, como nosotros, los humanos.

En naturaleza, S. cerevisiae se encuentra en ambientes cálidos y húmedos, con una fuente de azúcar al alcance de la mano. Uno de sus lugares favoritos para pasar el rato es el viñedo, donde habita sobre piel de uva.

S. cerevisiae tiene una forma ovoide de redondo a elipsoidal y típicamente tiene un diámetro de 5-10 micrómetros cuando se visualiza con un microscopio de campo brillante.

Cuando la mayoría de las células eucariotas se dividen mediante mitosis y citocinesis, existe una segregación igual de material genético y citoplasma en las células hijas. Por otra parte, S. cerevisiae sufre la división celular a través de un proceso llamado gemación.

Esta forma de reproducción asexual implica la formación de un brote recién sintetizado a partir de la célula madre, que crece en tamaño a lo largo del ciclo celular hasta la citocinesis. A diferencia de la división de células eucariotas típica, las dos células no tienen el mismo tamaño después de la mitosis.

Ahora que hemos aprendido un poco sobre S. cerevisiae como organismo, vamos a discutir lo que lo convierte en un gran sistema modelo para la investigación.

Primero, las células de levadura crecen rápidamente y se dividen aproximadamente cada 90 minutos. En segundo lugar, son fáciles de cultivar y solo necesitan una técnica e instrumentación simples para su propagación. En tercer lugar, siendo el primer organismo eucariota en tener secuenciado todo su genoma, S. cerevisiae tiene todas sus secuencias de genes a disposición del público a través de la base de datos del genoma de levadura.

La manipulación genética de la levadura también es extremadamente práctica. La mayoría S. cerevisiae los vectores, portadores de una secuencia de ADN de interés, son vectores lanzadera. Los vectores lanzadera suelen ser plásmidos que pueden propagarse en dos especies diferentes, como E. coli y S. cerevisiae. Esto permite realizar la clonación molecular en E. coli, por ejemplo para incorporar el gen de la proteína verde fluorescente de las medusas en un vector lanzadera, que puede introducirse en la levadura para hacerlas brillar.

El plásmido integrador de levadura es un tipo de vector lanzadera que permite la incorporación de ADN extraño en el genoma de la levadura a través de un proceso llamado recombinación homóloga. La recombinación homóloga es un intercambio de ADN entre secuencias coincidentes o similares que da como resultado un cruce genético entre el vector y el ADN genómico del huésped. Esto puede provocar la desactivación de un gen o el intercambio de un gen por otro. Además, dado que la recombinación homóloga da como resultado la integración en el genoma del huésped, el cambio genético persiste después de que la célula de levadura se divide.

Ahora que sabe qué hace que la levadura sea tan conveniente para el estudio, echemos un vistazo a por qué estas pequeñas criaturas han sido tan importantes científicamente. Hace mucho, mucho tiempo, a principios del sexto milenio a.C., la levadura estaba involucrada en la fermentación de las uvas para hacer vino. Más tarde, la levadura jugó un papel en la cocción del pan en el antiguo Egipto.

No fue hasta 1856 que Luis Pasteur identificó S. cerevisiae como microbio clave para la elaboración de vino y pan. Clasificó la levadura como anaerobia facultativa que, en ausencia de oxígeno, cambia a fermentación, un proceso que permite que la levadura metabolice los azúcares y produzca alcohol como subproducto. En este proceso, el piruvato, que se produce por glucólisis, se reduce a acetilaldehído, que luego, gracias a la conversión de NADH en NAD +, se reduce a etanol, el ingrediente definitorio del vino.

Saltando al siglo XX, Hartwell y Nurse encontraron en la levadura el descubrimiento de proteínas que regulan el ciclo celular.

El ciclo celular es una serie de eventos celulares que incluye la replicación y segregación adecuadas del ADN nuclear antes de que una célula se divida. La identificación de la proteína ciclina y quinasa dependiente de ciclina, junto con el cambio en su abundancia relativa a través de la interfase y la mitosis, sugirió que estas proteínas son reguladores clave de la división celular. La naturaleza altamente conservada de estas proteínas hace que su estudio en levadura sea valioso para comprender el papel de las quinasas dependientes de ciclina en organismos multicelulares, como la desregulación del ciclo celular, que puede conducir a una división celular descontrolada o cáncer.

Pasando a 15 años después, Blackburn, Greider y Szostak realizaron estudios revolucionarios en la comprensión de los telómeros, así como en el descubrimiento de las telomerasas. Los telómeros son secuencias repetitivas de ADN al final de un cromosoma que evitan que el ADN genómico se degenere. La adición de estas secuencias repetitivas se lleva a cabo mediante telomerasas en el extremo flanqueante 3 & rsquo del cromosoma, y ​​la complementación de nucleótidos es seguida por la ADN polimerasa en la hebra rezagada. Los telómeros tienen implicaciones en el envejecimiento, ya que estos segmentos de ADN se acortan a lo largo de la vida de un organismo.

Incluso más recientemente, en 1992, Ohsumi y sus colegas descubrieron genes que regulan la autofagia, una especie de reciclaje celular. Durante la falta de nutrientes, los orgánulos prescindibles son engullidos por un autofagosoma. El autofagosoma luego se fusionará con un lisosoma, con el fin de descomponer aún más las proteínas organelares en aminoácidos esenciales para producir nuevas proteínas. La autofagia está involucrada en los importantes mecanismos celulares que protegen contra los patógenos invasores y el crecimiento tumoral.

Existe una amplia gama de aplicaciones para el estudio de la levadura. La levadura se puede utilizar, por ejemplo, para estudiar la mitofagia, que es la eliminación de las mitocondrias dañadas por los autofagosomas. Este proceso tiene implicaciones en enfermedades como Alzheimer & rsquos y Parkinson & rsquos. En este video, se induce la autofagia en células de levadura con la adición de medio de privación de nitrógeno. A continuación, las células se preparan para microscopía de fluorescencia, con el fin de observar mitofagia en células privadas de nitrógeno.

S. cerevisiae se usa para expresar y purificar grandes cantidades de proteínas, por ejemplo, la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de fibrosis quística. En este video, las células de levadura que llevan el plásmido CFTR se cultivan en cultivos grandes. A continuación, se lleva a cabo la centrifugación de las células para separar los microsomas. Los microsomas son vasos artefactos que se forman a partir del retículo endoplásmico cuando las células se rompen. El aislamiento y purificación de CFTR de microsomas permitirá a los científicos estudiar la estructura de la proteína mediante el uso de métodos como la cristalografía de rayos X.

La levadura también se puede utilizar como sistema modelo para estudios genéticos de proteínas de reparación del ADN humano. Estas proteínas detectan y reparan el ADN dañado para prevenir la proliferación de células que portan un genoma defectuoso, como las células cancerosas. Aquí puede ver a los autores colocando células de levadura con la proteína de reparación del ADN transformada, WRN, en placas de medios selectivos. La morfología celular de los mutantes para WRN se puede visualizar usando microscopía de fluorescencia, y la detección de esta proteína en el lisado celular se lleva a cabo ejecutando un gel de proteína para el análisis de Western Blot.

Usted y rsquove acaba de ver la introducción de JoVE & rsquos a S. cereviae. En este video revisamos: la historia, la biología celular y molecular y las aplicaciones biomédicas de S. cerevisiae. Esperamos que hayas disfrutado de nuestro video y te animamos a que lo compartas con un amigo.


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