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9.6: Herramientas para estudiar la evolución - Biología

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Mitos sobre la Tierra

Esta interesante imagen es una representación de la Tierra del siglo XIX basada en un antiguo mito hindú. Según el mito, la Tierra descansa sobre el lomo de los elefantes, que a su vez se colocan sobre el lomo de una tortuga gigante. Prácticamente todas las culturas y religiones humanas han desarrollado mitos sobre la Tierra y sus orígenes. Por ejemplo, hasta hace relativamente poco, muchos occidentales pensaban que la Tierra se creó en un día y que esto ocurrió hace apenas unos miles de años. Sin embargo, una diversidad de evidencia ha convencido desde entonces a la comunidad científica de que la Tierra en realidad se formó por procesos naturales a partir del polvo de estrellas hace unos alucinantes 4.5 a 4.6 mil millones de años. La evidencia también sugiere que la vida apareció por primera vez en la Tierra hace 4 mil millones de años y ha estado evolucionando desde entonces.

Tierra en un día

Puede ser difícil concentrarse en períodos de tiempo tan grandes como la edad de la Tierra y sus primeras formas de vida. Una forma útil de visualizar las cantidades relativas de tiempo que pasaron entre el origen de la Tierra y los eventos importantes en la evolución biológica es condensar el período total de tiempo en un día de 24 horas, como se muestra en la Figura ( PageIndex {2} ). En esta escala, la Tierra se habría formado a la medianoche, y la primera vida habría aparecido alrededor de las 3:00 a.m. Los humanos habrían aparecido solo durante el último minuto del día. Si somos tan recién llegados al planeta Tierra, ¿cómo sabemos sobre el vasto período de tiempo que nos precedió? ¿Cómo nos hemos enterado del pasado lejano?

El registro fósil

Gran parte de lo que sabemos sobre la historia de la vida en la Tierra se basa en el registro fósil, por lo que esta es una herramienta extremadamente importante en el estudio de la evolución. los registro fósil es el registro de la vida que se desarrolló durante cuatro mil millones de años en la Tierra reconstruido a partir del descubrimiento y análisis de fósiles. Fósiles son los restos o rastros conservados de organismos que vivieron en el pasado. Las partes blandas de los organismos casi siempre se descomponen rápidamente después de la muerte. En ocasiones, las partes duras, principalmente huesos, dientes o conchas, permanecen el tiempo suficiente para mineralizarse y formar fósiles. En la Figura ( PageIndex {3} ) se muestra un ejemplo de un esqueleto fósil completo.

Para conservarse como fósiles, los restos deben cubrirse rápidamente con sedimentos o conservarse de alguna otra manera. Por ejemplo, pueden estar congelados en glaciares o atrapados en resina de árbol o roca, como la rana que se muestra en la Figura ( PageIndex {4} ). A veces, se conservan rastros de organismos, como huellas o madrigueras. Las condiciones requeridas para que se formen los fósiles rara vez ocurren. Por lo tanto, la posibilidad de que un organismo determinado se conserve como fósil es extremadamente baja.

Para que los fósiles nos “cuenten” la historia de la vida, se debe establecer su cronología. Esto significa que los fósiles deben estar fechados. Solo entonces podrán ayudar a los científicos a reconstruir cómo cambió la vida con el tiempo. Los fósiles se pueden fechar de dos formas diferentes, denominadas datación relativa y datación absoluta.

  • Citas relativas determina cuál de dos fósiles es más viejo o más joven que el otro, pero no su edad en años. La datación relativa se basa en las posiciones de los fósiles en las capas de rocas. Las capas inferiores se colocaron antes, por lo que se supone que contienen fósiles más antiguos. Esto se ilustra en la figura siguiente.
  • Citas absolutas determina cuánto tiempo vivió un organismo fósil, dando la edad del fósil en años. La datación absoluta puede basarse en la cantidad de carbono 14 u otros elementos radiactivos que quedan en un fósil.

Relojes moleculares

Los relojes moleculares también son herramientas valiosas para estudiar la evolución. A molecular reloj utiliza secuencias de ADN (o la secuencia de aminoácidos de las proteínas que codifica el ADN) para estimar cuánto tiempo ha pasado desde que las especies relacionadas divergieron de un ancestro común. Los relojes moleculares se basan en la suposición de que las mutaciones se acumulan a lo largo del tiempo a una tasa promedio constante para una región determinada de ADN. Se supone que las especies que han acumulado mayores diferencias en sus secuencias de ADN divergieron de su ancestro común en un pasado más lejano. Los relojes moleculares basados ​​en diferentes regiones de ADN pueden usarse juntos para mayor precisión. Mire las comparaciones de ADN en la siguiente tabla. Según estos datos, ¿qué organismo crees que compartió el ancestro común más reciente con los humanos?

Tabla ( PageIndex {1} ): Las similitudes del ADN de las especies de chimpancés, ratón, pollo y mosca de la fruta son del ADN humano.
OrganismoSimilitud con el ADN humano (porcentaje)
Chimpancé98
Ratón85
Pollo60
Mosca de la fruta44

Característica: Mito vs Realidad

Mito: Las lagunas en el registro fósil refutan la evolución.

Realidad: Es de esperar que haya lagunas en el registro fósil, donde no se han encontrado fósiles de transición entre grupos ancestrales y descendientes. Las posibilidades de que los organismos se fosilicen son bajas. Algunos organismos no se conservan bien y las condiciones necesarias para la fosilización rara vez están presentes. Si la evolución ocurre rápidamente, las posibilidades de que se formen fósiles de transición son aún menores. Incluso si se forman fósiles de organismos en transición, los investigadores deben descubrirlos para agregarlos al registro fósil. No se han encontrado la gran mayoría de fósiles. Los investigadores están estudiando el proceso de fosilización para arrojar luz sobre qué parte del registro fósil aún no se ha descubierto.

Afortunadamente, al igual que las huellas dactilares en la escena de un crimen, el registro fósil es solo un tipo de evidencia de la evolución. Además de los fósiles, las secuencias moleculares y otros tipos de evidencia se utilizan todos juntos para revelar cómo evolucionó la vida en la Tierra.

Revisar

  1. Basado en un día de 24 horas, ¿a qué hora evolucionaron los mamíferos? ¿Cuánto del pasado de la Tierra ya había tenido lugar en ese momento? ¿Cuándo evolucionaron los primeros seres vivos?
  2. ¿Qué es el registro fósil?
  3. ¿Por qué el registro fósil está incompleto?
  4. Compara y contrasta la datación relativa y absoluta de los fósiles.
  5. Explica qué pueden revelar los relojes moleculares sobre la evolución de la vida.
  6. ¿Por qué es importante para el estudio de la evolución conocer la edad relativa de un fósil en comparación con otro fósil?
  7. Si el fósil A está ubicado sobre el fósil B y el fósil B está ubicado sobre el fósil C en diferentes capas de rocas, organice los tres fósiles en orden de su edad probable, del más antiguo al más joven.
  8. ¿Qué herramienta podría utilizar para estudiar las relaciones evolutivas entre especies que aún están vivas?
    1. Datación por carbono 14
    2. Relojes moleculares
    3. Posición relativa en el registro fósil
    4. Ninguna de las anteriores
  9. Utilizar el Historia de la Tierra en un día modelo anterior para responder a las siguientes preguntas.
    1. ¿Qué fue primero, el oxígeno libre en la Tierra o la evolución de los animales?
    2. ¿Durante qué período geológico evolucionó la vida multicelular?
    3. ¿Aproximadamente cuánto de la historia de la Tierra había transcurrido antes de que evolucionaran los eucariotas?
    4. ¿Cuál es el nombre de nuestra era actual?
  10. Verdadero o falso. Los fósiles siempre están compuestos de tejido real de organismos extintos.
  11. Verdadero o falso. La datación absoluta de los fósiles se suele realizar mediante un reloj molecular.

Explora más

¿Cómo sería si tomáramos los 4.500 millones de años de historia de la Tierra y los metiéramos en el marco de tiempo de 24 horas de un día normal? Compruébalo aquí:

La datación por carbono nos permite estimar las edades de

material. Aprende más aquí:


La distribución universal oculta de las redes biosintéticas de aminoácidos: una perspectiva genómica sobre sus orígenes y evolución

Veinte aminoácidos comprenden los componentes básicos universales de las proteínas. Sin embargo, sus rutas biosintéticas no parecen ser universales desde un punto de vista Escherichia coli-Perspectiva céntrica. Sin embargo, es necesario comprender su origen y evolución en un contexto global, es decir, incluir más especies 'modelo' y rutas alternativas para hacerlo. Utilizamos un enfoque de genómica comparativa para evaluar los orígenes y la evolución de las ramas alternativas de la red biosintética de aminoácidos.

Resultados

Al rastrear la distribución taxonómica de las enzimas biosintéticas de aminoácidos, predijimos un núcleo de ramas de la red ampliamente distribuidas que biosintetizaban al menos 16 de los 20 aminoácidos estándar, lo que sugiere que este núcleo ocurrió en células antiguas, antes de la separación de los tres dominios celulares de vida. Adicionalmente, detallamos la distribución de dos tipos de ramas alternativas a este núcleo: análogos, enzimas que catalizan la misma reacción (usando los mismos metabolitos) y pertenecen a diferentes superfamilias y 'alternólogos', aquí definidos como ramas que, procediendo a través de diferentes metabolitos. , convergen en el mismo producto final. Sugerimos que el origen de las ramas alternativas está estrechamente relacionado con diferentes fuentes de metabolitos ambientales y estilos de vida entre las especies.

Conclusión

La estrategia de semillas multiorganismos empleada en este trabajo mejora la precisión de la datación y determina las relaciones evolutivas entre las ramas biosintéticas de aminoácidos. Esta estrategia podría extenderse a diversas rutas metabólicas e incluso a otros procesos biológicos. Además, introducimos el concepto de 'alternólogo', que no solo juega un papel importante en las relaciones entre estructura y función en las redes biológicas, sino que también, como se muestra aquí, tiene fuertes implicaciones para su evolución, casi iguales a la paralogía y la analogía.


9.6: Herramientas para estudiar la evolución - Biología

En el caso de las enfermedades infecciosas, la identificación rápida y precisa del patógeno es fundamental para un manejo y tratamiento efectivos, pero el diagnóstico sigue siendo un desafío, particularmente en áreas con recursos limitados. Los métodos que detectan con precisión los ácidos nucleicos de patógenos pueden proporcionar tecnologías robustas, precisas, rápidas y ultrasensibles para el diagnóstico de patógenos en el punto de atención y, por lo tanto, proporcionan información invaluable para el manejo y tratamiento de enfermedades. Se han empleado varias tecnologías, en su mayoría basadas en PCR, para la detección de patógenos, sin embargo, estas requieren reactivos y equipos costosos y personal capacitado. Los sistemas CRISPR / Cas se han utilizado para la edición del genoma, basándose en su capacidad para reconocer y escindir con precisión secuencias específicas de ADN y ARN. Además, tras el reconocimiento de la secuencia diana, ciertos sistemas CRISPR / Cas, incluidos los ortólogos de Cas13, Cas12a y Cas14, exhiben actividades catalíticas no específicas colaterales que pueden emplearse para la detección de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante la degradación de un ácido nucleico marcado para producir un fluorescente. señal. Los sistemas CRISPR / Cas son aptos para multiplexación, lo que permite que una única prueba de diagnóstico identifique múltiples objetivos hasta concentraciones attomolares (10-18 mol / L) de moléculas objetivo. El desarrollo de dispositivos que combinen CRISPR / Cas con sistemas de flujo lateral puede permitir diagnósticos desplegables en campo, precisos, altamente sensibles y económicos. Estos sensores tienen innumerables aplicaciones, desde la salud humana hasta la agricultura. En esta revisión, discutimos los avances recientes en el campo de las tecnologías de biosensores basadas en CRISPR y destacamos los conocimientos sobre su uso potencial en una miríada de aplicaciones.

Letras
Las células microbianas inteligentes combinan la catálisis y la detección para proporcionar una selección de alto rendimiento de una hidrolasa organofosforada

La ingeniería enzimática para la ganancia de función requiere navegar eficientemente por un gran espacio de secuencia combinatoria. Por lo general, se necesitan muchas mutaciones para obtener mejoras significativas, mientras que una sola mutación "mala" puede inactivar la enzima. Para establecer un cribado de alto rendimiento y lograr una resolución mejorada entre dos variantes, las bibliotecas genéticas de la enzima organofosfato hidrolasa paraoxonasa 1 (PON1) se cribaron rápidamente mediante un circuito de retroalimentación positiva diseñado: un factor de transcripción específico de p-nitrofenol (PNP) (TF ) regularon la expresión de PON1, que catalizó la degradación del paraoxón y la producción de PNP. Se caracterizaron colonias mutantes activas raras, recogidas por fluorescencia visual simple de una fusión de proteína fluorescente verde (GFP) PON1. En una única ronda de selección, el alto rendimiento (a escala de biblioteca) permitió el descubrimiento de una actividad mejorada de degradación del paraoxón en PON1, incluidas mutaciones estructuralmente inesperadas.

Síntesis microbiana de melatonina de hormonas humanas a escala de Gram
  • Hao Luo* ,
  • Konstantin Schneider,
  • Ulla Christensen,
  • Yang Lei,
  • Markus Herrgard y
  • Bernhard Ø. Palsson

La melatonina es una hormona derivada del triptófano comercialmente atractiva. Aquí describimos un bioproceso para la producción de melatonina utilizando Escherichia coli a títulos altos. La primera cepa de ingeniería produjo 0,13 g / L de melatonina a partir de triptófano en condiciones de fermentación por lotes alimentados. Se logró una mejora de 4 veces en el título de melatonina mediante (1) ingeniería de proteínas de la triptófano hidroxilasa limitante para mejorar la biosíntesis de 5-hidroxitriptófano y (2) la integración cromosómica de la descarboxilasa de aminoácidos aromáticos para limitar la formación de subproductos y minimizar la generación de genes toxicidad para la célula huésped. La optimización de la fermentación mejoró el título de melatonina en un doble adicional. La eliminación de yddG, un exportador de triptófano, mostró un efecto beneficioso aditivo. La cepa de ingeniería final produjo ~ 2,0 g / L de melatonina con triptófano suplementado externamente y ~ 1,0 g / L con glucosa como única fuente de carbono para el suministro de triptófano. Este estudio sienta las bases para el desarrollo adicional de una cepa comercial de E. coli productora de melatonina.

Identificación funcional de dos tipos de caroteno hidroxilasas del alga verde Dunaliella bardawil Rico en luteína
  • Ming-Hua Liang,
  • Hong Xie,
  • Hao-Hong Chen,
  • Zhi-Cong Liang y
  • Jian-Guo Jiang*

El alga unicelular tolerante a la sal Dunaliella bardawil FACHB-847 puede acumular grandes cantidades de luteína, pero aún se desconoce la causa subyacente de la acumulación masiva de luteína. En este estudio, los genes que codifican dos tipos de caroteno hidroxilasas, es decir, β-caroteno hidroxilasa (DbBCH) y citocromo P450 carotenoide hidroxilasa (DbCYP97s DbCYP97A, DbCYP97B y DbCYP97C), se clonaron a partir de D. bardawil. Sus especificidades de sustrato y actividades enzimáticas se probaron mediante ensayos de complementación funcional en Escherichia coli. Se demostró que el DbBCH podía catalizar la hidroxilación de los anillos β de β- y α-caroteno, y mostraba un nivel bajo de ε-hidroxilasa. A diferencia de CYP97A de plantas superiores, DbCYP97A no pudo hidroxilar el β-caroteno. DbCYP97A y DbCYP97C mostraron una alta actividad hidroxilasa hacia el anillo β y el anillo ε de α-caroteno, respectivamente. DbCYP97B mostró una actividad menor hacia el anillo β del α-caroteno. La alta acumulación de luteína en D. bardawil puede deberse a las múltiples vías de biosíntesis de luteína generadas a partir de α-caroteno con zeinoxantina o α-criptoxantina como intermediarios por DbBCH y DbCYP97s. En conjunto, este estudio proporciona información para comprender la razón subyacente de la alta producción de luteína en el alga verde halófila D. bardawil FACHB-847.

Girar el tornillo: ingeniería de resistencia extrema al pH en Escherichia coli a través de Operones sintéticos combinatorios
  • Guilherme M. V. de Siqueira,
  • Rafael Silva-Rocha, y
  • María Eugenia Guazzaroni*

La adopción de microorganismos como plataformas para la producción sustentable de base biológica requiere que las células huésped sean capaces de resistir las duras condiciones, generalmente muy distantes de aquellas en las que estos organismos están naturalmente adaptados para prosperar. Sin embargo, los nuevos mecanismos de supervivencia descubiertos por el estudio de microbiomas de hábitats extremos pueden explotarse para mejorar la robustez microbiana en las estrictas condiciones necesarias para diferentes aplicaciones industriales. En este trabajo, se utilizaron enfoques de biología sintética para diseñar una mayor resistencia a los ácidos en Escherichia coli a través de la caracterización de una colección de operones únicos compuestos por conjuntos combinatorios de tres genes nuevos de un entorno extremo y tres sitios de unión de ribosomas sintéticos. Los resultados aquí presentados ilustran la eficacia de combinar diferentes genes metagenómicos para la resistencia en operones sintéticos, ya que la expresión de estos grupos de genes aumentó cien veces el porcentaje de supervivencia de las células expuestas a un choque ácido en un medio mínimo a pH 1,9 en condiciones aeróbicas.

Análisis completo de puertos seguros genómicos como sitios objetivo para la expresión estable del gen heterólogo en células HEK293
  • Seunghyeon Shin,
  • Su Hyun Kim,
  • Sung Wook Shin,
  • Lise Marie Grav,
  • Lasse Ebdrup Pedersen,
  • Jae Seong Lee* , y
  • Gyun Min Lee*

Las líneas celulares humanas se utilizan cada vez más como células huésped para producir glicoproteínas terapéuticas, debido a su maquinaria de glicosilación humana. En un intento por desarrollar una plataforma para generar líneas de células humanas isogénicas que produzcan proteínas terapéuticas basadas en la integración dirigida, se evaluaron tres puertos seguros genómicos humanos (GSH) bien conocidos —AAVS1, CCR5 y loci ROSA26 humano— con respecto a la expresión del transgén. nivel y estabilidad en células de riñón embrionario humano (HEK293). Entre los tres GSH, el locus AAVS1 mostró la mayor expresión de eGFP con la mayor homogeneidad. La expresión del transgén en el locus AAVS1 se mantuvo sin selección durante aproximadamente 3 meses. Además, el promotor CMV mostró la expresión más alta, seguido por los promotores EF1α, SV40 y TK en el locus AAVS1. Las líneas celulares maestras se crearon usando la integración mediada por CRISPR / Cas9 de la plataforma de aterrizaje en el locus AAVS1 y se usaron para una generación más rápida de líneas celulares recombinantes que producen proteínas terapéuticas con intercambio de casetes mediado por recombinasa.

Evolución continua automatizada de proteínas en vivo
  • Ziwei Zhong,
  • Brandon G. Wong,
  • Arjun Ravikumar,
  • Garri A. Arzumanyan,
  • Ahmad S. Khalil* , y
  • Chang C. Liu*

Presentamos la evolución continua automatizada (ACE), una plataforma para la evolución dirigida de manos libres de biomoléculas. ACE empareja OrthoRep, un sistema genético para la mutagénesis dirigida continua de genes seleccionados por el usuario in vivo, con eVOLVER, un dispositivo de cultivo continuo escalable y automatizado para una regulación precisa y multiparamétrica de las condiciones de crecimiento. Al implementar el ajuste controlado por retroalimentación en tiempo real de la rigurosidad de la selección con eVOLVER, los genes de interés codificados en OrthoRep atravesaron de forma autónoma las vías adaptativas de multimutación para alcanzar las funciones deseadas, incluida la resistencia a los fármacos y la actividad enzimática mejorada. La durabilidad, escalabilidad y velocidad de la evolución biomolecular con ACE deberían ser ampliamente aplicables a la ingeniería de proteínas, así como a los estudios prospectivos sobre cómo los parámetros de selección y los programas dan forma a la adaptación.

Ingeniería de patrones de colonias bacterianas vivas utilizando canales fluídicos impulsados ​​por meniscos
  • Vasily Kantsler* ,
  • Elena Ontañón-McDonald,
  • Cansu Kuey,
  • Manjari J. Ghanshyam,
  • Maria Chiara Roffin, y
  • Munehiro Asally*

La creación de biomateriales adaptables, sostenibles y dinámicos es una futura misión de la biología sintética. La ingeniería de comunidades bacterianas organizadas espacialmente tiene el potencial de desarrollar tales bio-metamateriales. Sin embargo, generar patrones de vida con precisión, robustez y una barrera técnica baja sigue siendo un desafío. Aquí presentamos una técnica fácilmente implementable para modelar poblaciones de bacterias vivas utilizando un sistema de fluidos controlado por menisco, denominado MeniFluidics. Demostramos patrones multiescala de colonias y enjambres de biopelículas con resolución submilimétrica. Utilizando la propagación bacteriana más rápida en los canales líquidos, MeniFluidics permite que las colonias bacterianas controladas tanto en el espacio como en el tiempo organicen cepas de Bacillus subtilis marcadas con fluorescencia en un patrón convergente y formen patrones de vórtice dinámicos en enjambres bacterianos confinados. La robustez, la precisión y la baja barrera técnica de MeniFluidics ofrecen una herramienta para avanzar e inventar nuevos materiales vivos que se pueden combinar con sistemas genéticamente modificados y contribuir a la investigación fundamental sobre las interacciones ecológicas, evolutivas y físicas entre microbios.

Programación dinámica de celdas con circuito CRISPRi controlado por detección de quórum
  • Yilan Liu,
  • Jinjin Chen,
  • David Crisante,
  • Jhoselyn Marisol Jaramillo Lopez, y
  • Radhakrishnan Mahadevan*

La biología sintética está permitiendo avances rápidos en las áreas de biofabricación y terapias vivas. Los circuitos dinámicos que pueden usarse para regular los recursos celulares y el comportamiento de la comunidad microbiana representan un enfoque definitorio de la biología sintética y han atraído un gran interés. Sin embargo, los circuitos dinámicos existentes son en su mayoría dependientes de la edición de genes o basados ​​en lisis celular, lo que limita su amplia y conveniente aplicación y, en algunos casos, dichos circuitos basados ​​en lisis pueden sufrir inestabilidad genética debido a la evolución. Existe una investigación limitada en CRISPRi asistido por detección de quórum, que puede funcionar de manera independiente de la edición de genes. Aquí, construimos una serie de sistemas CRISPRi controlados por detección de quórum (Q-CRISPRi), que pueden programar bacterias dinámicamente mediante el uso de sgRNA personalizado sin introducir lisis celular. Aplicamos con éxito circuitos Q-CRISPRi para programar dinámicamente la expresión génica, la densidad de población, el fenotipo, la propiedad física y la composición de la comunidad de consorcios microbianos. Las estrategias informadas aquí representan métodos para la programación celular dinámica y podrían ser efectivas en la programación de microorganismos de importancia médica e industrial para ofrecer un mejor control de su metabolismo y comportamiento.

Artículos
Un riboswitch sensible a moléculas pequeñas permite la inducción condicional de la expresión genética mediada por vectores virales en ratones
  • Benjamín Strobel,
  • Matthias J. Düchs,
  • Dragica Blazevic,
  • Philipp Rechtsteiner,
  • Clemens Braun,
  • Katja S. Baum-Kroker,
  • Bernhard Schmid,
  • Thomas Ciossek,
  • Dirk Gottschling,
  • Jörg S. Hartig y
  • Sebastián Kreuz*

La terapia génica mediada por vectores virales adenoasociados (AAV) tiene un gran potencial para futuras aplicaciones médicas. Sin embargo, para facilitar una aplicabilidad más segura y más amplia y para permitir una atención centrada en el paciente, la expresión de proteínas terapéuticas debería ser controlable, idealmente mediante un fármaco administrado por vía oral. El uso de sistemas basados ​​en proteínas se considera bastante indeseable, debido a la potencial inmunogenicidad y al espacio de codificación limitado de AAV. Los ribosconmutadores dependientes de ligandos, por el contrario, son pequeños y se caracterizan por un modo de acción atractivo basado en la autoescisión del ARNm, independiente de la proteína extraña coexpresada. Si bien es un enfoque prometedor, los interruptores disponibles hasta la fecha solo han mostrado una potencia moderada en animales. En particular, los conmutadores ON que inducen la expresión del transgén tras la administración del ligando han logrado hasta ahora resultados bastante decepcionantes. Aquí presentamos la utilización de la ribozima K19 dependiente de tetraciclina descrita anteriormente para controlar la expresión del transgén mediada por AAV en ratones. Con este interruptor de herramienta, proporcionamos la primera prueba de la viabilidad de las características clave clínicamente deseadas, incluida la funcionalidad multiorgánica, la regulación potente (hasta 15 veces la inducción), la reversibilidad y la posibilidad de ajustar e inducir repetidamente la expresión. La evaluación sistemática de los niveles plasmáticos de ligando y proteína informadora permitió además la caracterización de las relaciones farmacocinético-farmacodinámicas. Por lo tanto, nuestros resultados respaldan enérgicamente los esfuerzos futuros para desarrollar riboswitches diseñados para aplicaciones en terapia génica clínica.

Activadores enjaulados de biosensores de proteínas alostéricas artificiales
  • Selvakumar Edwardraja,
  • Zhong Guo,
  • Jason Whitfield,
  • Ignacio Retamal Lantadilla,
  • Wayne A. Johnston,
  • Patricia Walden,
  • Claudia E. Vickers y
  • Kirill Alexandrov*

La capacidad de las proteínas para interconvertir entradas y salidas bioquímicas no relacionadas es la base de la mayor parte del procesamiento de energía e información en biología. Un mecanismo de conversión común implica un cambio conformacional de un receptor de proteína en respuesta a la unión de un ligando o una modificación covalente, que conduce a la modulación de la actividad alostérica del dominio efector. Diseñar tales sistemas de manera racional es un objetivo central de la biología sintética y la ingeniería de proteínas. Un sistema sensorial de dos componentes basado en el andamiaje de módulos en presencia de un analito es una de las arquitecturas de biosensores más generalizables. Un problema inherente de tales sistemas es la dependencia de la respuesta de las concentraciones absolutas y relativas de los componentes. Aquí usamos el ejemplo de sistemas sensoriales de dos componentes basados ​​en interruptores sintéticos operados por calmodulina para analizar y abordar este problema. Construimos versiones "enjauladas" del dominio de activación, creando así una barrera termodinámica para la activación espontánea del sistema. Demostramos que las arquitecturas de biosensores enjauladas podrían operar a concentraciones que abarcan 3 órdenes de magnitud y son aplicables a biosensores de dos componentes electroquímicos, luminiscentes y fluorescentes. Analizamos la cinética de activación de los biosensores enjaulados y determinamos que es probable que el interruptor alostérico central sea el componente limitante de la velocidad del sistema. Estos hallazgos proporcionan una guía para la ingeniería predecible de sistemas sensoriales robustos con entradas y salidas de elección.

Superar los desafíos de la construcción de plásmidos del tamaño de una megabase en Escherichia coli
  • Takahito Mukai* ,
  • Tatsuya Yoneji,
  • Kayoko Yamada,
  • Hironobu Fujita,
  • Seia Nara y
  • Masayuki Su’etsugu*

Aunque Escherichia coli ha sido una herramienta popular para la construcción de plásmidos, se creía que esta bacteria era "inadecuada" para construir un plásmido grande cuyo tamaño supere las 500 kilobases. Supusimos que los vectores de plásmidos tradicionales pueden carecer de algunos elementos de ADN reguladores necesarios para la replicación y segregación estables de un plásmido tan grande. Además, el uso de algunos sistemas de recombinación específicos de sitio puede facilitar la clonación de grandes segmentos de ADN. Aquí mostramos dos estrategias para construir cromosomas secundarios de 1 megabase (1-Mb) mediante el uso de nuevos vectores de cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Primero, el genoma de 3 Mb de una cepa de E. coli con genoma reducido se dividió en dos cromosomas (2-Mb y 1-Mb), de los cuales el más pequeño tiene el origen de replicación y el locus de partición del Vibrio tubiashii secundario. cromosoma. Este método de fisión cromosómica (clonación de Flp-POP) funciona mediante la escisión mediada por flippasa, que coincide con el reensamblaje de un gen de resistencia al cloranfenicol dividido, lo que permite la selección del cloranfenicol. A continuación, desarrollamos un nuevo método de clonación (clonación oriT-POP) y un vector BAC totalmente equipado (pMegaBAC1H) para desarrollar un plásmido de 1 Mb. Se transfirieron secuencialmente dos regiones genómicas de 0,5 Mb de dos cepas donantes a una cepa receptora mediante conjugación y se capturaron mediante pMegaBAC1H en la cepa receptora para producir un plásmido de 1 Mb. Este plásmido de 1 Mb era transmisible a otra cepa de E. coli mediante conjugación. Además, estos cromosomas secundarios de 1 Mb fueron amplificables in vitro mediante el uso de la reacción del ciclo de replicación cromosómica (RCR) de E. coli reconstituida. Estas estrategias y tecnologías convertirían a las populares células de E. coli en una fábrica productiva para la ingeniería cromosómica de diseño.

Biosensores de dos componentes: revelando los mecanismos de sintonización predecible

Se han dedicado muchos estudios a la ingeniería de biosensores celulares mediante la explotación de sensores naturales intrínsecos. Sin embargo, los biosensores se basan no solo en la detección de entrada, sino también en un rango de respuesta adecuado. Por lo tanto, a menudo es necesario ajustar los sistemas naturales para satisfacer las demandas de aplicaciones específicas de una manera predecible. En este estudio, exploramos la personalización de biosensores bacterianos de dos componentes modulando el componente biosensor principal, es decir, la proteína receptora. Desarrollamos un modelo matemático que describe la relación funcional entre la abundancia de receptores y el umbral de activación, la sensibilidad, el rango dinámico y el rango operativo. El marco matemático definido permite el diseño de la arquitectura genética de un biosensor de dos componentes que puede funcionar según sea necesario con una mínima ingeniería genética. Para validar experimentalmente el modelo y sus predicciones, se construyó una biblioteca de biosensores. La buena concordancia entre los diseños teóricos y los resultados experimentales indica que la modulación de la abundancia de proteínas receptoras permite optimizar los diseños de biosensores con una mínima ingeniería genética.

Producción de proteína recombinante desacoplada por crecimiento inspirada en bacteriófagos en Escherichia coli
  • Patrick Stargardt,
  • Lukas Feuchtenhofer,
  • Monika Cserjan-Puschmann,
  • Gerald Striedner y
  • Juergen Mairhofer*

Modular la asignación de recursos en las bacterias para redirigir los componentes básicos del metabolismo hacia la formación de proteínas recombinantes en lugar de la formación de biomasa sigue siendo un gran desafío en biotecnología. Aquí, presentamos un enfoque novedoso para mejorar la producción de proteínas recombinantes (RPP) utilizando Escherichia coli (E. coli) mediante el desacoplamiento de la síntesis de proteínas recombinantes del crecimiento celular. Demostramos que la división celular y la transcripción del ARNm del hospedador se pueden inhibir con éxito mediante la coexpresión de un péptido inhibidor de la ARN polimerasa (RNAP) de E. coli derivado de bacteriófagos y que los genes sobretranscritos por la T7 RNAP ortogonal pueden finalmente representar & gt55% de la masa celular seca ( CDM). Este péptido inhibidor de RNAP se une al RNAP de E. coli y por lo tanto previene la formación mediada por el factor σ 70 de complejos promotores abiertos calificados para la transcripción. De este modo, se inhibe la transcripción de genes del huésped impulsados ​​por el factor σ 70, y los recursos metabólicos pueden utilizarse exclusivamente para la síntesis de la proteína de interés (POI). Aquí, imitamos la fase tardía de la infección por bacteriófagos mediante la coexpresión de un regulador xenogénico derivado de fagos que reprograma la célula huésped y, por lo tanto, es capaz de mejorar significativamente la RPP en condiciones de proceso de lotes alimentados relevantes para la industria a escala de biorreactor. Hemos evaluado la producción de varias proteínas recombinantes diferentes a diferentes escalas (desde microescala hasta escala de lotes de alimentación de 20 L) y hemos podido mejorar los rendimientos de proteínas totales y solubles hasta 3.4 veces en comparación con el sistema de expresión de referencia E. coli BL21. (DE3). Este enfoque novedoso para el RPP desacoplado del crecimiento tiene profundas implicaciones para la biotecnología y la bioingeniería y ayuda a establecer procesos de fabricación genéricos y más rentables para productos biológicos y biomateriales.

Biosíntesis multicomponente a microescala de alcaloides indol de cianobacterias no naturales
  • Yogan Khatri,
  • Robert M. Hohlman,
  • Johnny Mendoza,
  • Shasha Li,
  • Andrew N. Lowell,
  • Haruichi Asahara y
  • David H. Sherman*

Las herramientas de secuenciación del genoma y bioinformática han facilitado la identificación y expresión de un número creciente de agrupaciones de genes biosintéticos crípticos (BGC). Sin embargo, el análisis funcional de todos los componentes de una vía metabólica para determinar con precisión las propiedades biocatalíticas sigue siendo lento y laborioso. Una forma de acelerar este proceso implica la síntesis de proteínas libres de células (CFPS) a microescala para el análisis directo de genes a funciones bioquímicas, que rara vez se ha aplicado para estudiar sistemas enzimáticos multicomponente en el metabolismo especializado. Buscamos establecer un ensayo de transcripción / traducción (TT) in vitro para evaluar el ensamblaje de productos naturales de tipo hapalindol derivados de cianobacterias (cNP) debido a sus diversos perfiles de bioactividad y diversidad estructural compleja. Usando un sistema CFPS que incluye un plásmido que lleva famD2 preniltransferasa de Fischerella ambigua UTEX 1903, mostramos la producción del intermedio prenilado central (3GC) en presencia de geranilpirofosfato exógeno (GPP) y cis-indol isonitrilo. Further addition of a plasmid bearing the famC1 Stig cyclase resulted in synthesis of both FamD2 and FamC1 enzymes, which was confirmed by proteomics analysis, and catalyzed assembly of 12-epi-hapalindole U. Further combinations of Stig cyclases (FamC1–C4) produced hapalindole U and hapalindole H, while FisC identified from Fischerella sp. SAG46.79 generated 12-epi-fischerindole U. The CFPS system was further employed to screen six unnatural halogenated cis-indole isonitrile substrates using FamC1 and FisC, and the reactions were scaled-up using chemoenzymatic synthesis and identified as 5- and 6-fluoro-12-epi-hapalindole U, and 5- and 6-fluoro-12-epi-fischerindole U, respectively. This approach represents an effective, high throughput strategy to determine the functional role of biosynthetic enzymes from diverse natural product BGCs.

Design and Experimental Evaluation of a Minimal, Innocuous Watermarking Strategy to Distinguish Near-Identical DNA and RNA Sequences
  • Francine J. Boonekamp ,
  • Sofia Dashko ,
  • Donna Duiker ,
  • Thies Gehrmann ,
  • Marcel van den Broek ,
  • Maxime den Ridder ,
  • Martin Pabst ,
  • Vincent Robert ,
  • Thomas Abeel ,
  • Eline D. Postma ,
  • Jean-Marc Daran , and
  • Pascale Daran-Lapujade*

The construction of powerful cell factories requires intensive and extensive remodelling of microbial genomes. Considering the rapidly increasing number of these synthetic biology endeavors, there is an increasing need for DNA watermarking strategies that enable the discrimination between synthetic and native gene copies. While it is well documented that codon usage can affect translation, and most likely mRNA stability in eukaryotes, remarkably few quantitative studies explore the impact of watermarking on transcription, protein expression, and physiology in the popular model and industrial yeast Saccharomyces cerevisiae. The present study, using S. cerevisiae as eukaryotic paradigm, designed, implemented, and experimentally validated a systematic strategy to watermark DNA with minimal alteration of yeast physiology. The 13 genes encoding proteins involved in the major pathway for sugar utilization (i.e., glycolysis and alcoholic fermentation) were simultaneously watermarked in a yeast strain using the previously published pathway swapping strategy. Carefully swapping codons of these naturally codon optimized, highly expressed genes, did not affect yeast physiology and did not alter transcript abundance, protein abundance, and protein activity besides a mild effect on Gpm1. The markerQuant bioinformatics method could reliably discriminate native from watermarked genes and transcripts. Furthermore, presence of watermarks enabled selective CRISPR/Cas genome editing, specifically targeting the native gene copy while leaving the synthetic, watermarked variant intact. This study offers a validated strategy to simply watermark genes in S. cerevisiae.

Cell-Free Bacteriophage Genome Synthesis Using Low-Cost Sequence-Verified Array-Synthesized Oligonucleotides
  • Huiran Yeom ,
  • Taehoon Ryu ,
  • Amos Chungwon Lee ,
  • Jinsung Noh ,
  • Hansaem Lee ,
  • Yeongjae Choi ,
  • Namphil Kim , and
  • Sunghoon Kwon*

Synthesizing engineered bacteriophages (phages) for human use has potential in various applications ranging from drug screening using a phage display to clinical use using phage therapy. However, the engineering of phages conventionally involves the use of an in vivo system that has low production efficiency because of high virulence against the host and low transformation efficiency. To circumvent these issues, de novo phage genome synthesis using chemically synthesized oligonucleotides (oligos) has increased the potential for engineering phages in a cell-free system. Here, we present a cell-free, low-cost, de novo gene synthesis technology called Sniper assembly for phage genome construction. With massively parallel sequencing of microarray-synthesized oligos, we generated and identified approximately 100 000 clonal DNA clusters in vitro and 5000 error-free ones in a cell-free environment. To demonstrate its practical application, we synthesized the Acinetobacter phage AP205 genome (4268 bp) using 65 sequence-verified DNA clones. Compared to previous reports, Sniper assembly lowered the genome synthesis cost (.0137/bp) by producing low-cost sequence-verified DNA.

SRNA-Based Screening Chromosomal Gene Targets and Modular Designing Escherichia coli for High-Titer Production of Aglycosylated Immunoglobulin G
  • Jinhua Zhang ,
  • Yanshu Zhao ,
  • Yingxiu Cao ,
  • Zhenpeng Yu ,
  • Guoping Wang ,
  • Yiqun Li ,
  • Xiaoqiong Ye ,
  • Congfa Li ,
  • Xue Lin , and
  • Hao Song*

The production of the aglycosylated immunoglobulin G (IgG) in Escherichia coli has received wide interest for its analytical and therapeutic applications. To enhance the production titer of IgG, we first used synthetic sRNAs to perform a systematical analysis of the gene expression in the translational level in the glycolytic pathway (module 1) and the tricarboxylic acid (TCA) cycle (module 2) to reveal the critical genes for the efficient IgG production. Second, to provide sufficient amino acid precursors for the protein biosynthesis, amino acid biosynthesis pathways (module 3) were enhanced to facilitate the IgG production. Upon integrated engineering of these genes in the three modules (module 1, aceF module 2, gltA and acnA module 3, serB) and optimization of fermentation conditions, the recombinant E. coli enabled a titer of the full-assembled IgG of 4.5 ± 0.6 mg/L in flask cultures and 184 ± 9.2 mg/L in the 5 L high cell density fed-batch fermenter, which is, as far as we know, the highest reported titer of IgG production in recombinant E. coli.

Efficient Biosynthesis of Low-Molecular-Weight Poly-γ-glutamic Acid Based on Stereochemistry Regulation in Bacillus amyloliquefaciens
  • Yuanyuan Sha ,
  • Yueyuan Huang ,
  • Yifan Zhu ,
  • Tao Sun ,
  • Zhengshan Luo ,
  • Yibin Qiu ,
  • Yijing Zhan ,
  • Peng Lei ,
  • Sha Li , and
  • Hong Xu*

Low-molecular-weight poly-γ-glutamic acid (LMW-γ-PGA) has attracted much attention because of its many potential applications in food, agriculture, medicine, and cosmetics. Enzymatic degradation is an efficient way for the synthesis of LMW-γ-PGA. However, the stereochemistry of γ-PGA limits the degradation of γ-PGA. This study identifies the role of γ-PGA synthase (pgsA) and glutamate racemase (racE) in the regulation of γ-PGA stereochemistry and demonstrates their combinational use for LMW-γ-PGA synthesis. First, the expression of pgsA and racE was enhanced, leading to improvements both in the molecular weight (Mw) and the d-glutamate proportion of γ-PGA. Then, an optimal combination of pgsA, racE, and γ-PGA hydrolase pgdS was constructed by exchanging the gene origins for the synthesis of LMW-γ-PGA. Finally, the Mw of γ-PGA was decreased to 6–8 kDa, which was much lower compared with the case without stereochemistry switching (20–30 kDa). This study provides a novel strategy to control the Mw of γ-PGA based on stereochemistry regulation and lays a solid foundation for synthesis of LMW-γ-PGA.

Development of Novel Riboswitches for Synthetic Biology in the Green Alga Chlamydomonas
  • Payam Mehrshahi ,
  • Ginnie Trinh D. T. Nguyen ,
  • Aleix Gorchs Rovira ,
  • Andrew Sayer ,
  • Marcel Llavero-Pasquina ,
  • Michelle Lim Huei Sin ,
  • Elliot J. Medcalf ,
  • Gonzalo I. Mendoza-Ochoa ,
  • Mark A. Scaife , and
  • Alison G. Smith*

Riboswitches are RNA regulatory elements that bind specific ligands to control gene expression. Because of their modular composition, where a ligand-sensing aptamer domain is combined with an expression platform, riboswitches offer unique tools for synthetic biology applications. Here we took a mutational approach to determine functionally important nucleotide residues in the thiamine pyrophosphate (TPP) riboswitch in the THI4 gene of the model alga Chlamydomonas reinhardtii, allowing us to carry out aptamer swap using THIC aptamers from Chlamydomonas and Arabidopsis thaliana. These chimeric riboswitches displayed a distinct specificity and dynamic range of responses to different ligands. Our studies demonstrate ease of assembly as 5′UTR DNA parts, predictability of output, and utility for controlled production of a high-value compound in Chlamydomonas. The simplicity of riboswitch incorporation in current design platforms will facilitate the generation of genetic circuits to advance synthetic biology and metabolic engineering of microalgae.

Improved Production of Malic Acid in Aspergillus niger by Abolishing Citric Acid Accumulation and Enhancing Glycolytic Flux

Microbial fermentation was widely explored to produce malic acid. Previously, Aspergillus niger has been successfully engineered, and a high titer of malic acid was achieved with strain S575, but it also produced a high level of byproduct citric acid. Here, the capability of A. niger in malic acid biosynthesis was further improved by eliminating the accumulation of citric acid and enhancing glycolytic flux. Characterization of variant mutants suggested that disruption of cexA, a gene encoding citric acid transporter located on cell membrane, abolished citric acid accumulation. However, cexA-deficient strain S895 showed significantly decreased malic acid production. Further analysis of S895 indicated that the transcription level of genes involved in glucose transportation and glycolytic pathway was significantly reduced, and the corresponding enzyme activity was also lower than those of S575. Individual overexpression of genes encoding glucose transporter MstC and key enzymes (hexokinase HxkA, 6-phosphofructo-2-kinase PfkA, and pyruvate kinase PkiA) involved in irreversible reactions of glycolic pathway increased malic acid production. Accordingly, genes of mstC, hxkA, pfkA, and pkiA were overexpressed altogether in S895, and the resultant strain S1149 was constructed. The titer of malic acid in fed-batch fermentation with S1149 reached 201.13 g/L. Compared with S575, the byproduct of citric acid was completely abolished in S1149, and the ratio of malic acid/glucose was increased from 1.27 to 1.64 mol/mol, the highest yield reported so far, and the fermentation period was shortened from 9 to 8 days. Thus, a strain with great industrial application potential was developed by engineering nine genes in A. niger, and a pilot fermentation technology was exploited.

Genetic Engineering of Oligotropha carboxidovorans Strain OM5—A Promising Candidate for the Aerobic Utilization of Synthesis Gas
  • Daniel Siebert* ,
  • Tobias Busche ,
  • Aline Y. Metz ,
  • Medina Smaili ,
  • Bastian A. W. Queck ,
  • Jörn Kalinowski , and
  • Bernhard J. Eikmanns

Due to climate change and worldwide pollution, development of highly sustainable routes for industrial production of basic and specialty chemicals is critical nowadays. One possible approach is the use of CO2- and CO-utilizing microorganisms in biotechnological processes to produce value-added compounds from synthesis gas (mixtures of CO2, CO, and H2) or from C1-containing industrial waste gases. Such syngas fermentation processes have already been established, e.g., biofuel production using strictly anaerobic acetogenic bacteria. However, aerobic processes may be favorable for the formation of more costly (ATP-intensive) products. Oligotropha carboxidovorans strain OM5 is an aerobic carboxidotrophic bacterium and potentially a promising candidate for such processes. We here performed RNA-Seq analysis comparing cells of this organism grown heterotrophically with acetate or autotrophically with CO2, CO, and H2 as carbon and energy source and found a variety of chromosomally and of native plasmid-encoded genes to be highly differentially expressed. In particular, genes and gene clusters encoding proteins required for autotrophic growth (CO2 fixation via Calvin–Benson–Bassham cycle), for CO metabolism (CO dehydrogenase), and for H2 utilization (hydrogenase), all located on megaplasmid pHCG3, were much higher expressed during autotrophic growth with synthesis gas. Furthermore, we successfully established reproducible transformation of O. carboxidovorans via electroporation and developed gene deletion and gene exchange protocols via two-step recombination, enabling inducible and stable expression of heterologous genes as well as construction of defined mutants of this organism. Thus, this study marks an important step toward metabolic engineering of O. carboxidovorans and effective utilization of C1-containing gases with this organism.

A Reversibly Induced CRISPRi System Targeting Photosystem II in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803

The cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is used as a model organism to study photosynthesis, as it can utilize glucose as the sole carbon source to support its growth under heterotrophic conditions. CRISPR interference (CRISPRi) has been widely applied to repress the transcription of genes in a targeted manner in cyanobacteria. However, a robust and reversible induced CRISPRi system has not been explored in Synechocystis 6803 to knock down and recover the expression of a targeted gene. In this study, we built a tightly controlled chimeric promoter, PrhaBAD-RSW, in which a theophylline responsive riboswitch was integrated into a rhamnose-inducible promoter system. We applied this promoter to drive the expression of ddCpf1 (DNase-dead Cpf1 nuclease) in a CRISPRi system and chose the PSII reaction center gene psbD (D2 protein) to target for repression. psbD was specifically knocked down by over 95% of its native expression, leading to severely inhibited photosystem II activity and growth of Synechocystis 6803 under photoautotrophic conditions. Significantly, removal of the inducers rhamnose and theophylline reversed repression by CRISPRi. Expression of PsbD recovered following release of repression, coupled with increased photosystem II content and activity. This reversibly induced CRISPRi system in Synechocystis 6803 represents a new strategy for study of the biogenesis of photosynthetic complexes in cyanobacteria.

Bottom-Up Construction of a Minimal System for Cellular Respiration and Energy Regeneration
  • Olivier Biner* ,
  • Justin G. Fedor ,
  • Zhan Yin , and
  • Judy Hirst*

Adenosine triphosphate (ATP), the cellular energy currency, is essential for life. The ability to provide a constant supply of ATP is therefore crucial for the construction of artificial cells in synthetic biology. Here, we describe the bottom-up assembly and characterization of a minimal respiratory system that uses NADH as a fuel to produce ATP from ADP and inorganic phosphate, and is thus capable of sustaining both upstream metabolic processes that rely on NAD+, and downstream energy-demanding processes that are powered by ATP hydrolysis. A detergent-mediated approach was used to co-reconstitute respiratory mitochondrial complex I and an F-type ATP synthase into nanosized liposomes. Addition of the alternative oxidase to the resulting proteoliposomes produced a minimal artificial “organelle” that reproduces the energy-converting catalytic reactions of the mitochondrial respiratory chain: NADH oxidation, ubiquinone cycling, oxygen reduction, proton pumping, and ATP synthesis. As a proof-of-principle, we demonstrate that our nanovesicles are capable of using an NAD+-linked substrate to drive cell-free protein expression. Our nanovesicles are both efficient and durable and may be applied to sustain artificial cells in future work.

Construction of Inducible Genetic Switch for the Global Regulator WblA To Sustain Both Overproduction of Tiancimycins and On-Demand Sporulation in Streptomyces sp. CB03234
  • Fan Zhang ,
  • Die Gao ,
  • Jing Lin ,
  • Manxiang Zhu ,
  • Zhoukang Zhuang ,
  • Yanwen Duan* , y
  • Xiangcheng Zhu*

The complex life cycle of streptomycetes is closely related to their secondary metabolisms, all controlled by cascade regulations. Tiancimycins (TNMs) are ten-membered enediynes possessing great potential for antitumor drug development. However, their low yields in Streptomyces sp. CB03234 have greatly limited subsequent studies. Through transcriptome analysis and genetic characterization, we proved that WblA is one pivotal global regulator to repress the biosynthesis of TNMs. The deletion of wblA could significantly enhance the production of TNMs, but also abolish the sporulation in CB03234. By constructing the NitR-ε-caprolactam inducible genetic switch, the expression of wblA was governed in CB03234-NRW, thereby sustaining the overproduction of TNMs and recovering the normal sporulation upon induction, which were practical for the scaled-up production of TNMs. Considering the prevalence and conserved regulatory roles of WblA in streptomycetes, our developed strategy shall provide an effective and practical approach to facilitate titer improvement and discovery of natural products.

High-Throughput Screening for Substrate Specificity-Adapted Mutants of the Nisin Dehydratase NisB
  • Xinghong Zhao ,
  • Rubén Cebrián ,
  • Yuxin Fu ,
  • Rick Rink ,
  • Tjibbe Bosma ,
  • Gert N. Moll , and
  • Oscar P. Kuipers*

Microbial lanthipeptides are formed by a two-step enzymatic introduction of (methyl)lanthionine rings. A dehydratase catalyzes the dehydration of serine and threonine residues, yielding dehydroalanine and dehydrobutyrine, respectively. Cyclase-catalyzed coupling of the formed dehydroresidues to cysteines forms (methyl)lanthionine rings in a peptide. Lanthipeptide biosynthetic systems allow discovery of target-specific, lanthionine-stabilized therapeutic peptides. However, the substrate specificity of existing modification enzymes impose limitations on installing lanthionines in non-natural substrates. The goal of the present study was to obtain a lanthipeptide dehydratase with the capacity to dehydrate substrates that are unsuitable for the nisin dehydratase NisB. We report high-throughput screening for tailored specificity of intracellular, genetically encoded NisB dehydratases. The principle is based on the screening of bacterially displayed lanthionine-constrained streptavidin ligands, which have a much higher affinity for streptavidin than linear ligands. The designed NisC-cyclizable high-affinity ligands can be formed via mutant NisB-catalyzed dehydration but less effectively via wild-type NisB activity. In Lactococcus lactis, a cell surface display precursor was designed comprising DSHPQFC. The Asp residue preceding the serine in this sequence disfavors its dehydration by wild-type NisB. The cell surface display vector was coexpressed with a mutant NisB library and NisTC. Subsequently, mutant NisB-containing bacteria that display cyclized strep ligands on the cell surface were selected via panning rounds with streptavidin-coupled magnetic beads. In this way, a NisB variant with a tailored capacity of dehydration was obtained, which was further evaluated with respect to its capacity to dehydrate nisin mutants. These results demonstrate a powerful method for selecting lanthipeptide modification enzymes with adapted substrate specificity.


Studying human and nonhuman primate evolutionary biology with powerful in vitro and in vivo functional genomics tools

In recent years, tools for functional genomic studies have become increasingly feasible for use by evolutionary anthropologists. In this review, we provide brief overviews of several exciting in vitro techniques that can be paired with "-omics" approaches (e.g., genomics, epigenomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics) for potentially powerful evolutionary insights. These in vitro techniques include ancestral protein resurrection, cell line experiments using primary, immortalized, and induced pluripotent stem cells, and CRISPR-Cas9 genetic manipulation. We also discuss how several of these methods can be used in vivo, for transgenic organism studies of human and nonhuman primate evolution. Throughout this review, we highlight example studies in which these approaches have already been used to inform our understanding of the evolutionary biology of modern and archaic humans and other primates while simultaneously identifying future opportunities for anthropologists to use this toolkit to help answer additional outstanding questions in evolutionary anthropology.

Palabras clave: CRISPR-Cas9 ancestral protein reconstruction cell lines evolutionary genomics iPSCs in vitro assays transgenic organisms.


Techniques used in Molecular Biology

Some of the most important techniques used in molecular biology are as follows:

Molecular Biology techniques include characterization, isolation and manipulation of the molecular components of cells and organisms.

These components include DNA, the repository of genetic information RNA, functional and structural part of the translational apparatus and proteins, the major structural and enzymatic type of molecule in cells.

One of the most basic techniques of molecular biology to study protein function is expression cloning.

In this technique, DNA coding for a protein of interest is cloned (using PGR and/or restriction enzymes) into a plasmid (known as an expression vector).

This plasmid may have special promoter elements to drive production of the protein of interest, and may also have antibiotic resistance markers to help follow the plasmid.

( ii ) Polymerase chain reaction:

The polymerase chain reaction is an extremely versatile technique for copying DNA. PCR allows a single DNA sequence to be copied (millions of times), or altered in predetermined ways. PGR has many variations, like reverse transcription PGR (RT-PGR) for amplification of RNA, and, more recently, real-time PGR (QPGR) which allow for quantitative measurement of j DNA or RNA molecules.

(iii) Gel electrophoresis:

Gel electrophoresis is one of the principal tools of molecular biology. The basic principle is that DNA, RNA, and proteins can all be separated by means of an electric field. In agarose gel electrophoresis, DNA and RNA can be separated on the basis of size by running the DNA through an agarose gel. Proteins can be separated on the basis of size by using SDS-PAGE (polyacrylamide ) gel.

(iv) Macromolecule blotting and probing Southern Blots:

The Southern blot is a method for probing for the presence of a specific DNA sequence within a DNA sample. These tools are widely used in forensic laboratories to identify individuals who have left blood or other DNA-containing material at the scene of crimes. The number of bands that hybridize to a short probe gives an estimate of the number of closely related genes in an organism.

The Northern blot is used to study the expression patterns of a specific type of RNA molecule as relative comparison among a set of different samples of RNA. The RNAs on the blot can be detected by hybridizing them to a labeled probe. The intensities of the band reveal the relative amounts of specific RNA in each sample.

Immunoblots (Western Blots):

Proteins can be detected and quantified in complex mixtures using immunoblots (or Western blots). Proteins are electrophoresed, then blotted on a membrane and the proteins on the blot are probed with specific antibodies that can be detected with labeled secondary antibodies or protein.

(v) DNA microarray:

A DNA array is a collection of spots attached to a solid support such as a microscope slide where each spot contains one or more single-stranded DNA oligonucleotide fragment. Arrays make it possible to put down a large quantity of very small (100 micrometre diameter) spots on a single slide. Each spot has a DNA fragment molecule that is complementary to a single DNA sequence (similar to Southern blotting).

A variation of this technique allows the gene expression of an organism at a particular stage in development to be qualified (expression profiling).

(vi) Antiquated technologies:

In molecular biology, procedures and technologies are continually being developed and older technologies abandoned. For example, before the advent of DNA gel electrophoresis (agarose or polyacrylainide), the size of DNA molecules was typically determined by rate sedimentation in sucrose gradients, a slow and labour-intensive technique requiring expensive instrumentation prior to sucrose gradients, viscometry was used.


Graham Hatfull

Tuberculosis micobacteriana kills more people than any other single infectious agent. Since antibiotics are available and the BCG vaccine is in widespread use, why do two million people die each year from TB? The answer, in part, is that we really don't understand this curious bacterium or what parts of its genetic instructions make this such a deadly pathogen. At the heart of our strategies to understand mycobacterial genetics is the mycobacteriophages - viruses that infect the mycobacteria. These are easy to grow and manipulate and offer advantages over working with the slow-growing mycobacteria (such as M. tuberculosis) that can take up to a month to produce a colony on an agar plate. Phages are also rich sources of potential genetic and molecular tools that can be used to study - and to modify - their bacterial hosts.

Here's just a flavor of some of the current studies going on in the lab:

Exploring bacteriophage genomics. In collaboration with Dr. Hendrix we have spearheaded an initiative to understand viral diversity and evolution. Our specific focus is on the genomic characterization of mycobactriophages, and a collection of about 250 complete genome sequences have been determined. Many of these phages were isolated and sequenced through three programs in which phage discovery and genomics is a platform for integrating our science and educational missions. These are the Pittsburgh Phage Hunters Integrating Research and Education (PHIRE) program, the Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (HHMI SEA-PHAGES) program, and a Univiersity of KwaZulu-Natal and KwaZulu-Nalat Research in TB and HIV (UKZN/K-RITH) workshop. These studies have not only provided valuable insights into phage diveristy and evolution, but present a rich and easily-accessible reservoir of genetic and mechanistic novelty for further study. A database of mycobaectriophage genomic infomration is available at http://www.phagesdb.org.

Exploiting mycobacteriophages. We are dissecting the mycobacteriophages to understand the functional roles of the thousands of genes we have identified, and to deternine if and when they are expressed, and how this expression is regulated. We are exploiting this information to develop tools and approaches that not only generate new tools for genetic manipulation for tuberculosis, but also to gain advances in diagnosis, prevention and treatment of the disease.

Site-specific recombination. Many if not most of the mycobacteriophages we have sequenced integrate their DNA into the host chromosome (and can excise them too). We are studying the mechanism of integrase-mediated site-specific recombination with a primary current focus on the serine-integrases. We are partiualrly interested in understanding how recomibnational directionality is determine in phage integration systems.

Tools - Genetic and Clinical. Studying the mycobacteria and their phages has great potential for the development of novel tools for their genetics but also for a more direct clinical involvement. Two systems we have been involved in developing are multivalent recombinant BCG vaccines and Luciferase Reporter Phages, but there are numerous additional strategies awaiting further development!


9.6: Tools for Studying Evolution - Biology

A caricature of Charles Darwin from the London Sketchbook (1874).

We study evolution for the same reasons that we study any subject — the thirst for knowledge, to understand the past and predict the future, and to organize our world. But the subject of evolution also has huge relevance to our world and current issues that concern all of us. Evolution was happening 150 million years ago when dinosaurs dominated the Earth, was happening in the 1830s when Charles Darwin landed on the Galapagos Islands during the voyage of the HMS Beagle, and it is happening today. It is occurring in every living species on the planet, right now.

Evolution is not just about fossils. It is also about molecules, genes, mutations, populations, and sex in living organisms. All of these things are primary sources of data about evolutionary processes that occur when organisms try to survive and reproduce. Evolution also is about rigorous analyses — what we must do with the data to say something that is scientifically defendable. So if you thought that evolutionary biology was limited to dusty old curators in dusty old museums, think again. Scientists at universities, research centers, and museums are conducting some of the most sophistocated analyses of any kind today, using some of the best prepared specimens, most advanced techniques, and fastest computers available. Nothing in biology can be truly understood without first understanding evolution.

La Institución de Investigaciones Paleontológicas y su Museo de la Tierra
1259 Trumansburg Road y bull Ithaca, NY 14850 EE. UU.
teléfono: 607-273-6623 & bull fax: 607-273-6620


Teaching an Online Introductory Biology Lab Using Evolution and Ecology Resources

This playlist can be used in an online, undergraduate (majors-level) introductory biology lab to incorporate core topics in evolution, diversity of life, and ecology. Using case studies, multimedia, and interactive resources, it engages students in data analysis and critical thinking. The topics covered include phylogeny, natural selection, speciation, viruses, bacteria, population ecology, community ecology, ecosystem ecology, and climate change.

This playlist can be used to teach six 3-hour (180-minute) labs in a lab course for a total of 1080 minutes of instruction over a semester.

Lab 1: Evolution

By completing the resources in this lab (resources 1–2 in this playlist), students will be able to:

  • Explain how molecular sequences, such as DNA, can be used to study evolutionary relationships.
  • Summarize the process and goals of DNA sequence alignment.
  • Interpret a phylogenetic tree.
  • Collect and analyze data to quantify phenotypic diversity among populations.
  • Explain how similarities or differences in traits can evolve as adaptations to similar or different environmental conditions.
  • Perform statistical calculations, including calculations for the mean, standard deviation, standard error of the mean (SEM), and the 95% confidence interval.

Lab 2: Viruses

By completing the resources in this lab (resources 3–5 in this playlist), students will be able to:

  • List the ways in which viruses can differ from each other.
  • Identify different components and characteristics of viruses and their role in infection.
  • Calculate the size of a virus relative to a human cell.
  • Use information collected in case studies to distill complex, real-world data, and perform basic calculations to make decisions on the spread of an infectious disease.
  • Analyze and interpret data from a scientific figure.
  • Explain the term zoonotic disease and discuss some of the global patterns in mammals that carry these diseases.
  • Use appropriate scientific terms, including “reservoir” and “spill over,” in describing a disease outbreak.

Lab 3: Microbes

By completing the resources in this lab (resources 6–8 in this playlist), students will be able to:

  • Make observations on an ongoing experiment.
  • Make inferences based on observations.
  • Describe variation in microbes and their role in the environment.

Lab 4: Population Ecology

By completing the resources in this lab (resources 9–11 in this playlist), students will be able to:

  • Develop scientific explanations and justify claims using evidence.
  • Calculate elephant density with sample aerial survey data using the strip transect sampling method.
  • Identify the advantages and disadvantages of different survey methods.
  • Analyze and interpret gel electrophoresis results to determine relationships between individuals and populations.
  • Use allele frequencies to calculate the probability of two individuals sharing the same genetic profile.
  • Explain how the geographic and genetic distances between two populations are related.
  • Explain how genetic data helps law enforcement officers and conservationists decide where to target their efforts.

Lab 5: Community and Ecosystem Ecology

By completing the resources in this lab (resources 12–14 in this playlist), students will be able to:

  • Make connections between climate, vegetation, and biodiversity to describe biome characteristics.
  • Identify the types of data needed to test different niche partitioning mechanisms.
  • Make claims and offer explanations based on authentic field data.
  • Identify limitations of traditional forms of data collection.
  • Use DNA sequence data to identify animal and plant species.
  • Analyze data using statistical methods.
  • Predict whether different organisms in an ecosystem have positive or negative effects on other organisms in that ecosystem.
  • Predict how an ecosystem may change when a particular organism is introduced or removed, based on the evidence provided.

Lab 6: Human Impacts

By completing the resources in this lab (resources 15–20 in this playlist), students will be able to:

  • Describe recent patterns and trends in atmospheric carbon dioxide concentrations.
  • Explain the role of atmospheric CO 2 in ocean acidification.
  • Explain the role of atmospheric CO 2 in global warming.
  • Explain how similarities or differences in traits can evolve as adaptations to similar or different environmental conditions.
  • Use scientific observations to explain how a population changes over time due to human impacts.
  • Explain how the selective pressures on a population may impact the frequencies of phenotypes in a population.
  • Analyze quantitative data in order to make predictions based on evidence.

Lab 5: Biotechnology

By completing the resources in this lab (resources 11–14 in this playlist), students will be able to:


Evolution of monogamous marriage by maximization of inclusive fitness

The majority of human societies allow polygynous marriage, and the prevalence of this practice is readily understood in evolutionary terms. Why some societies prescribe monogamous marriage is however not clear: current evolutionary explanations—that social monogamy increases within-group co-operation, giving societies an advantage in competition with other groups—conflict with the historical and ethnographic evidence. We show that, within the framework of inclusive fitness theory, monogamous marriage can be viewed as the outcome of the strategic behaviour of males and females in the allocation of resources to the next generation. Where resources are transferred across generations, social monogamy can be advantageous if partitioning of resources among the offspring of multiple wives causes a depletion of their fitness value, and/or if females grant husbands higher fidelity in exchange for exclusive investment of resources in their offspring. This may explain why monogamous marriage prevailed among the historical societies of Eurasia: here, intensive agriculture led to scarcity of land, with depletion in the value of estates through partitioning among multiple heirs. Norms promoting high paternity were common among ancient societies in the region, and may have further facilitated the establishment of social monogamy. In line with the historical and ethnographic evidence, this suggests that monogamous marriage emerged in Eurasia following the adoption of intensive agriculture, as ownership of land became critical to productive and reproductive success.

Data S1 Theoretical framework.

Cuadro S1 Summary of the possible strategies.

Cuadro S2 Symbols used in the model.

Figure S1 Stability of ‘‘suspicious’’ monogamous males for pagH = 0.5.

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9.6: Tools for Studying Evolution - Biology

Methodologies for studying protein co-evolution

Co-evolution, which can be defined as interdependence of evolutionary histories, is a fundamental part of evolutionary theories from the times of C. Darwin himself. Inter-species co-evolution and co-adaptation is known to have a large effect on the evolutionary paths and characteristics of the involved organisms. More recently, co-evolutionary concepts have been brought to the molecular level. The evolution of many genes/proteins is not independent but entangled to that of others. The same happens at a lower level for individual residues within proteins. Molecular co-evolution can be due to specific co-adaptation between the two co-evolving elements, where changes in one of them are compensated by changes in the other, or by a less specific external force affecting the evolutionary rates of both elements in a similar magnitude. In both cases, independently of the underlying cause, co-evolutionary signatures between genes/proteins serve as markers of physical interactions and/or functional relationships. For this reason, a plethora of computational methods emerged for studying co-evolution at the protein or residue level so as to predict features such as protein-protein interactions, residue contacts within protein structures and protein functional sites. Co-evolution allows proteins to change while maintaining their interactions and, consequently, it plays a very important role in key biological systems. For this reason, the application of those co-evolution inspired methodologies allowed to gain insight into de functioning of these systems.

Available co-evolution related methods

Software Availability

Servers and Databases

Simple inter-position co-evolution

Protein contacts (model selection for homology modeling)

Mutual information corrected (Mip)

Inter-position co-evolution without phylogenetic contribution

Protein contacts (model selection for homology modeling)

Simple inter-position co-evolution

Protein contacts (model selection for homology modeling)

One small alignment [optional: second alignment or pdb]

Inter-position co-evolution without phylogenetic contribution

Protein contacts (model selection for homology modeling)

Pair specific Inter-position co-evolution

Protein contacts (ab initio protein structure prediction)

Pair specific Inter-position co-evolution

Protein contacts (ab initio protein structure prediction)

One family alignment [optional pdb and/or tree]

Ligand and protein interaction specificity

One family alignment and a tree

Ligand and protein interaction specificity

Ligand and protein interaction specificity

Ligand and protein interaction specificity

Binary files for every OS (*)

Ligand and protein interaction specificity

Intra-protein pathways (allostery)

Subfamily -specific conservation

Intra-protein pathways (allostery)

Two alignments of orhtologous sequences

Simple Inter-protein co-evolution

Phyiscal and Functional Interactions

Binary files for every OS (*)

Two alignments of orhtologous sequences

Simple Inter-protein co-evolution

Phyiscal and Functional Interactions

Binary files for every OS (*)

Sequence distance matrixes for two sets of orthologous and for the species tree (16S rRNA tree)

Inter-protein co-evolution without phylogenetic contribution

Phyiscal and Functional Interactions

Binary files for every OS (*)

Evolutionary distances of a big set of groups of orthologs

Pair specific inter-protein co-evolution

Phyiscal and Functional Interactions

Binary files for every OS (*)

Sequence distance matrixes for two sets of homologs

Inter-protein co-evolution of the strngest co-evolving sequence in the alignments


Ver el vídeo: Biología - EVOLUCIÓN DE LAS ESPECIES conceptos básicos (Agosto 2022).