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Y = Formación de dímero Fx vs Mo (gráfico 2) - Biología

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Y = Formación de dímero Fx vs Mo (gráfico 2)

Energía de interacción

La energía de interacción entre las moléculas A y B (ΔE AB) se determina como la diferencia entre la energía del dímero (E A, B) y la suma de las energías del monómero (E A + E B).

La energía de interacción, ΔE ABC, de un trímero ABC se puede expresar de dos formas [42b]: como una diferencia de la energía electrónica del complejo y de los monómeros

o como una suma de contribuciones aditivas de tres pares y el término de tres cuerpos ΔE 3

El término de tres cuerpos se puede expresar como:

En consecuencia, la metodología se amplía para tetrámeros y complejos más grandes. El análisis de sistemas extendidos se puede simplificar tratando un grupo seleccionado de moléculas como un subsistema. Por ejemplo, un catión hidratado (catión más moléculas de agua) podría tratarse como un subsistema al evaluar la no aditividad de interacciones en complejos entre cationes hidratados y pares de bases y trímeros [13c].

La estabilidad de un dímero está además influenciada por la deformación de los monómeros tras la formación del complejo. Esto se puede evaluar restando la energía de los monómeros aislados optimizados (E Ai, E Ai) de las energías de los monómeros en la geometría del dímero (E A, E B). La energía de deformación (relajación) respectiva ΔE DEF es positiva (repulsiva).

La energía de complejación total ΔE T se define así como

y las ecuaciones (5) y (6) pueden extenderse de manera sencilla también a trímeros y conglomerados más grandes.

Si los cálculos se realizan con la inclusión de efectos de correlación de electrones, entonces las energías de interacción ΔE y sus componentes consisten en componentes de correlación de electrones y HF

El primer término incluye básicamente las contribuciones electrostáticas, de inducción, de transferencia de carga y de intercambio de electrones. La energía de dispersión se origina en la correlación electrónica que también influye en las otras contribuciones.


Y = Formación de dímero Fx vs Mo (gráfico 2) - Biología

Para ayudar a descartar episodios de coagulación (trombóticos) y para ayudar a diagnosticar afecciones relacionadas con la trombosis.

Cuando tiene síntomas de un coágulo de sangre o una afección que causa coágulos de sangre inapropiados, como trombosis venosa profunda (TVP), embolia pulmonar (EP) o coagulación intravascular diseminada (CID), y para controlar el tratamiento de la CID y las condiciones de coagulación excesiva.

Una muestra de sangre extraída de una vena del brazo.

Es posible que pueda encontrar los resultados de su prueba en el sitio web de su laboratorio o en el portal del paciente. Sin embargo, actualmente se encuentra en Lab Tests Online. Es posible que el sitio web de su laboratorio lo haya dirigido aquí para brindarle información básica sobre las pruebas que había realizado. Deberá volver al sitio web o al portal de su laboratorio, o ponerse en contacto con su médico para obtener los resultados de su prueba.

Lab Tests Online es un sitio web de educación para pacientes galardonado que ofrece información sobre pruebas de laboratorio. El contenido del sitio, que ha sido revisado por científicos de laboratorio y otros profesionales médicos, proporciona explicaciones generales de lo que los resultados podrían significar para cada prueba enumerada en el sitio, como lo que un valor alto o bajo podría sugerirle a su médico acerca de su salud o condición médica.

Los rangos de referencia para sus pruebas se pueden encontrar en su informe de laboratorio. Por lo general, se encuentran a la derecha de sus resultados.

Si no tiene su informe de laboratorio, consulte a su proveedor de atención médica o al laboratorio que realizó las pruebas para obtener el rango de referencia.

Los resultados de las pruebas de laboratorio no son significativos por sí mismos. Su significado proviene de la comparación con los rangos de referencia. Los rangos de referencia son los valores esperados para una persona sana. A veces se les llama valores "normales". Al comparar los resultados de su prueba con los valores de referencia, usted y su proveedor de atención médica pueden ver si alguno de los resultados de su prueba se encuentra fuera del rango de valores esperados. Los valores que están fuera de los rangos esperados pueden proporcionar pistas para ayudar a identificar posibles afecciones o enfermedades.

Si bien la precisión de las pruebas de laboratorio ha evolucionado significativamente en las últimas décadas, puede producirse cierta variabilidad de laboratorio a laboratorio debido a diferencias en los equipos de prueba, los reactivos químicos y las técnicas. Esta es una razón por la que se proporcionan tan pocos rangos de referencia en este sitio. Es importante saber que debe utilizar el rango proporcionado por el laboratorio que realizó su prueba para evaluar si sus resultados están "dentro de los límites normales".

Para obtener más información, lea el artículo Rangos de referencia y su significado.

El dímero D es uno de los fragmentos de proteína que se producen cuando un coágulo de sangre se disuelve en el cuerpo. Normalmente es indetectable o detectable a un nivel muy bajo, a menos que el cuerpo esté formando y descomponiendo coágulos de sangre. Entonces, su nivel en la sangre puede aumentar significativamente. Esta prueba detecta el dímero D en la sangre.

Cuando un vaso sanguíneo o tejido se lesiona y comienza a sangrar, el cuerpo inicia un proceso llamado hemostasia para crear un coágulo de sangre para limitar y eventualmente detener el sangrado. Este proceso produce hilos de una proteína llamada fibrina, que se entrecruzan para formar una red de fibrina. Esa red, junto con las plaquetas, ayuda a mantener el coágulo de sangre en formación en el lugar de la lesión hasta que sane.

Una vez que el área ha tenido tiempo de curarse y el coágulo ya no es necesario, el cuerpo usa una enzima llamada plasmina para romper el coágulo (trombo) en pedazos pequeños para que pueda ser eliminado. Los fragmentos de la fibrina que se desintegra en el coágulo se denominan productos de degradación de la fibrina (FDP), que consisten en trozos de fibrina reticulada de distintos tamaños. Uno de los productos finales de degradación de la fibrina producidos es el dímero D, que se puede medir en una muestra de sangre cuando está presente. El nivel de dímero D en la sangre puede aumentar significativamente cuando hay una formación y descomposición significativas de coágulos de fibrina en el cuerpo.

Para una persona que tiene un riesgo bajo o intermedio de coagulación sanguínea (trombosis) y / o embolia trombótica, la fuerza de la prueba del dímero D es que puede usarse en la sala de emergencias de un hospital para determinar la probabilidad de la presencia de un coágulo. . Una prueba de dímero D negativa (el nivel de dímero D está por debajo de un umbral de corte predeterminado) indica que es muy poco probable que haya un trombo. Sin embargo, una prueba de dímero D positiva no puede predecir si hay un coágulo o no. Indica que se requieren más procedimientos de diagnóstico (por ejemplo, ecografía, angiografía por TC).

Hay varios factores y condiciones asociados con la formación inadecuada de coágulos de sangre. Uno de los más comunes es la trombosis venosa profunda (TVP), que implica la formación de coágulos en las venas profundas del cuerpo, con mayor frecuencia en la parte inferior de las piernas. Estos coágulos pueden crecer mucho y bloquear el flujo sanguíneo en las piernas, causando hinchazón, dolor y daño tisular. Es posible que una parte del coágulo se desprenda y viaje a otras partes del cuerpo. Esta "embolia" puede alojarse en los pulmones, provocando una embolia pulmonar o embolia (EP). Las embolias pulmonares por TVP afectan a más de 300,000 personas en los EE. UU. Cada año.

Si bien los coágulos se forman con mayor frecuencia en las venas de las piernas, también pueden formarse en otras áreas. Las mediciones del dímero D se pueden utilizar para ayudar a detectar coágulos en cualquiera de estos sitios. Por ejemplo, los coágulos en las arterias coronarias son la causa del infarto de miocardio (ataques cardíacos). Se pueden formar coágulos en el revestimiento del corazón o sus válvulas, especialmente cuando el corazón late de forma irregular (fibrilación auricular) o cuando las válvulas están dañadas. Los coágulos también se pueden formar en las arterias grandes como resultado del estrechamiento y daño de la aterosclerosis. Los fragmentos de dichos coágulos pueden desprenderse y causar un émbolo que bloquea una arteria en otro órgano, como el cerebro (provocando un derrame cerebral) o los riñones.

También se pueden solicitar mediciones del dímero D, junto con otras pruebas, para ayudar a diagnosticar la coagulación intravascular diseminada (CID). La CID es una afección en la que los factores de coagulación se activan y luego se consumen en todo el cuerpo. Esto crea numerosos coágulos de sangre diminutos y al mismo tiempo deja a la persona afectada vulnerable a un sangrado excesivo. Es una afección compleja, a veces potencialmente mortal, que puede surgir de una variedad de situaciones, incluidos algunos procedimientos quirúrgicos, sepsis, mordeduras de serpientes venenosas, enfermedad hepática y después del parto. Se toman medidas para ayudar a la persona afectada mientras se resuelve la afección subyacente. El nivel de dímero D será típicamente muy elevado en DIC.


Martinize2 (para el que se está preparando el manuscrito) y los códigos Martinate utilizados en este trabajo están disponibles públicamente en https://github.com/marrink-lab/. Para obtener información más detallada, consulte Códigos suplementarios.

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Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH (HL114453, AI156924, AI156923, CA165065, CA243142, AI145406, NS076511, NS061817, P41GM103712, R21NS094854, PA30DA035778 y P01DK096990), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (8162382173509), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (8190382120509) Centro, Polonia (subvención 2019/35 / D / ST4 / 02203), Proyecto 111 del Ministerio de Educación de China (B13038), Proyecto de equipos de investigación e innovadores locales del Programa de talentos de Guangdong Pearl River (2017BT01Y036), GDUPS (2019) y la Marcha de Dimes Prematurity Research Center de la Universidad de Pennsylvania. Agradecemos a J. Guererro-Santoro la asistencia técnica con el PNPLA9 Células KO BeWo.


MATERIALES Y MÉTODOS

Construcciones de ADN

Se generaron Capu-NT (aa 1 & # x02013466) y truncamientos de Capu-NT mediante amplificación por PCR a partir de una plantilla de Capu de longitud completa (CG3399, Capu-PA). Los truncamientos de Capu-NT se subclonaron en pGEX-6P-2 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) entre BamHola y NoYo sitios. Se introdujeron mutaciones puntuales en Capu-CT usando mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene, Santa Clara, CA).

Expresión y purificación de proteínas

Acanthamoeba castellani Las construcciones de actina, cola de Capu y Capu-CT se purificaron de acuerdo con los protocolos publicados (MacLean-Fletcher y Pollard, 1980 Vizcarra et & # x000a0al., 2011). En resumen, la cola de Capu se expresó como una fusión de GST y luego se separó de la etiqueta (a menos que se indique lo contrario). Capu-CT se expresó como una construcción etiquetada con histidina. Expresamos Capu-NT :: pGEX-6P-2 en células Rosetta (DE3) pLysS-competentes. Las células se cultivaron en Caldo Terrific a 37 ° C hasta que alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de 0,6 ° C 020130,8, momento en el que la temperatura se redujo a 20 ° C durante 1 h. Luego, las células se indujeron con isopropil - & # x003b2 - d - tiogalactósido 0,25 mM y se recogieron después de 13 & # x0201316 h. Los sedimentos celulares se congelaron instantáneamente con nitrógeno líquido y se almacenaron a & # x0221280 & # x000b0C.

Los sedimentos celulares descongelados se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 7, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,2%, ditiotreitol [DTT] 1 mM) suplementado con fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1,7 mM y 1 & # x003bcg / ml DNaseI. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a 4 & # x000b0C o en hielo. Las células se lisaron mediante dos pases a través de un microfluidizador (Microfluidics, Newton, MA). El lisado se centrifugó a 20.000 & # x000d7 gramo durante 20 min, y el sobrenadante se nutó con 1,5 ml de perlas de glutatión & # x02013Sepharose 4b (GE Healthcare) durante 1 h. Capu-NT se escindió de la GST unida incubando con PreScission Protease (GE Healthcare) durante la noche a 4 ° C. El eluato se concentró en una unidad de filtro centrífugo de corte de peso molecular Amicon de 10 kDa y luego se filtró en gel usando una columna Superdex 200 10/300 GL (tampón de columna GE Healthcare: Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM, 0,5 M l -arginina, DTT 1 mM). Las fracciones se agruparon basándose en el análisis SDS & # x02013PAGE, se dializaron en tampón de almacenamiento (Tris 10 mM, pH 7, DTT 1 mM) y luego se colocaron en glicerol: tampón de almacenamiento 1: 1 durante la noche. Se congelaron instantáneamente alícuotas de proteína en nitrógeno líquido y se almacenaron a & # x0221280 & # x000b0C. Las muestras de Capu-NT resultantes eran & # x0003e98% puras (Figura 1B).

Mientras se purificaba Capu-NT, surgieron dos problemas: 1) la degradación de las proteínas, lo que resultó en un doblete en los geles, y 2) la contaminación de la chaperona con DnaK. El primero se solucionó utilizando el tampón de lisis descrito anteriormente en lugar de la solución salina tamponada con fosfato estándar recomendada para la resina de glutatión. Antes de la escisión de la proteasa, un paso de lavado adicional con tampón de lisis suplementado con ATP 5 mM y MgCl 10 mM2 eliminó la mayor parte del DnaK (Pastorino et & # x000a0al., 2008). Los truncamientos de Capu-NT se purificaron por el mismo método.

Las concentraciones de todas las proteínas se informan en términos de sus concentraciones de monómero (subunidad) para simplificar el análisis de interacciones. Por tanto, Capu-CT 20 nM es igual a 10 nM de unidad de nucleación funcional. De manera similar, los nuevos coeficientes de extinción que se informan aquí se expresan en términos de concentraciones de monómeros. Para determinar el coeficiente de extinción de Capu-NT (204,855 cm & # x022121 M & # x022121), medimos la concentración de una muestra purificada mediante análisis de aminoácidos (AAA) en el Laboratorio de Biopolímeros de la Universidad de California en Los Ángeles. El coeficiente de extinción se calculó mediante la ley de Beer (Abs = C* & # x003b5 *B), dónde C es la concentración de la proteína medida por AAA, Abs es la absorbancia a 280 nm medida para la muestra analizada por AAA, y B es la longitud del camino (1 cm). El coeficiente de extinción de Capu (50 & # x02013321) (41,758 cm & # x022121 M & # x022121) se determinó de forma similar. Para determinar el coeficiente de extinción de Capu (1 & # x02013321) (99,582 cm & # x022121 M & # x022121), cuantificamos bandas de cinco concentraciones diferentes de Capu (1 & # x02013321) en un gel SDS & # x02013PAGE teñido con SyproRed (Invitrogen) . Se obtuvieron imágenes de los geles en un Pharos FX (Bio-Rad, Hercules, CA). La concentración de Capu (1 & # x02013321) se midió usando Capu (50 & # x02013321) como estándar. Debido a que Capu (1 & # x02013222) carece de residuos de triptófano y tirosina, determinamos su concentración usando tinción SyproRed cuantitativa con Capu (1 & # x02013321) como estándar.

CarboneroDrosophila profilina) se expresó sin una etiqueta de afinidad en el plásmido pET17b en células BL21 (DE3) pLysS-competentes (durante la noche a 18 ° C). Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de extracción (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM) y se lisaron con un microfluidizador. El lisado se centrifugó a 20.000 & # x000d7 gramo durante 20 min, y el sobrenadante se incubó con resina DE52 durante 30 min a 4 ° C. Se recogieron tanto el flujo continuo como el lavado con tampón de extracción. Se añadió sulfato de amonio hasta una saturación del 35% con agitación a 4 ° C durante 15 min. La muestra se centrifugó a 30.000 & # x000d7 gramo durante 30 min. El sobrenadante se llevó a una saturación de sulfato de amonio al 61% y se centrifugó de nuevo, y el sedimento se dializó durante la noche con fosfato de potasio 5 mM, pH 7,5, DTT 1 mM. La muestra se filtró a través de una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad) y luego se purificó adicionalmente mediante filtración en gel en una columna HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare) en NaCl 150 mM, 4- (2-hidroxietil) -1- 10 mM ácido piperazinetanosulfónico (HEPES), pH 7, y Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 0,5 mM. La proteína purificada se congeló instantáneamente en glicerol al 50%, HEPES 10 mM al 50%, pH 7 y TCEP 0,5 mM y se almacenó a & # x0221280 & # x000b0ºC. La concentración de Chic se calculó mediante tinción cuantitativa SyproRed utilizando Schizosaccharomyces pombe profilina (1,63 OD / mg / ml) como estándar (Lu y Pollard, 2001).

Purificado Acanthamoeba castellani La actina se marcó con yodoacetamida 488 verde de Oregon (Life Technologies, Carlsbad, CA) en cisteína 374. La actina filamentosa se dializó durante 3 & # x020134 h con KCl 100 mM, MgCl 2 mM2, Imidazol 25 mM, pH 7,5 y ATP 0,2 mM para eliminar los reactivos reductores. La actina se agitó a 4 ° C durante la noche con un exceso molar de colorante de 5 a 10 veces. La reacción se inactivó con DTT 10 mM y se centrifugó a 195.000 & # x000d7 gramo. El sedimento se resuspendió en tampón de actina G (Tris 2 mM, CaCl 0,1 mM2, ATP 0,2 mM, TCEP 0,5 mM, azida sódica al 0,04%) y se dializó durante 3 & # x020134 d antes de la filtración en gel en una columna Superdex 200 10/300 GL. La concentración de actina y el porcentaje de marcaje del tinte se calcularon de acuerdo con Kovar et & # x000a0al. (2003) .

Ensayos de polimerización de pireno-actina

Los ensayos de ensamblaje de pireno-actina se llevaron a cabo esencialmente como se describe (Zalevsky et & # x000a0al., 2001). Brevemente, 4 & # x003bcM A. castellani La actina (marcada con pireno al 5%) se incubó durante 2 min a 25 ° C con tampón ME (concentración final, ácido etilenglicol tetraacético [EGTA] 200 & # x003bcM y MgCl 50 & # x003bcM2) para convertir Ca-G-actina en Mg-G-actina. La polimerización se inició añadiendo tampón de polimerización KMEH (concentración final, Na-HEPES 10 mM, pH 7,0, EGTA 1 mM, KCl 50 mM, MgCl 1 mM2) a la Mg-G-actina. Se combinaron componentes adicionales, como Capu-CT, Capu-tail y Capu-NT, en el tampón de polimerización antes de la adición a Mg-G-actina. La fluorescencia se controló en un espectrofluorómetro (Photon Technology, Birmingham, NJ) o un TECAN F200 con & # x003bbexcitación = 365 nm y & # x003bbemisión = 407 nm.

Concentraciones de extremos de púas en t1/2 se calcularon para los ensayos de pireno a granel utilizando la siguiente ecuación: [extremo con púas] = tasa de alargamiento / (k+ & # x000d7 [monómeros de actina] & # x02212 k& # x02212), dónde k+ = 11.6 & # x003bcM & # x022121 s & # x022121 y k& # x02212 = 1,4 s & # x022121 (Pollard, 1986). La tasa de alargamiento se determinó mediante la pendiente de una línea de mejor ajuste a los datos brutos a la mitad de la polimerización máxima. Supusimos que la concentración de monómero de actina era 2 & # x003bcM al analizar los datos cerca t1/2. El cálculo de las tasas de nucleación de Capu-CT en presencia de Capu-NT se realizó como se describió anteriormente (Quinlan et & # x000a0al., 2007). En resumen, utilizando un análisis de ondículas personalizado y un algoritmo basado en # x02013, suavizamos los datos de intensidad de fluorescencia. Los datos de los primeros 30 s se representaron en función del tiempo y las pendientes de estas líneas se tomaron como la tasa de formación de extremos de púas (es decir, la tasa de nucleación).

Los experimentos de polimerización de pireno competitivo se analizaron utilizando un modelo de unión competitiva como se describe en Vinson et & # x000a0al. (1998). Calcular KD Para la interacción Capu-tail / Capu-NT, usamos la siguiente ecuación:

dónde L = [Capu-tail], R0 = [Capu-NT], KD es la afinidad de Capu-CT por Capu-NT, y Kd2 es la afinidad de Capu-tail por Capu-NT. En EC50 = 3 & # x003bcM, F = 0,5 y L = 3 & # x003bcM. En estas condiciones y cuando KD se supone que es 10 nM (KI de Capu-CT / Capu-NT), Kd2 es 333 nM.

Proteólisis

Se dializó Capu-NT en Tris 10 mM, KCl 50 mM y DTT 1 mM y se diluyó hasta una concentración final de 3 & # x003bcM. En el tiempo 0 min, se añadió tripsina 6 nM al Capu-NT. En los puntos de tiempo 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 90 y 120 min, se tomaron muestras de la reacción y se añadieron a PMSF 4 mM para detener la proteólisis. Las muestras se hirvieron y se procesaron en un gel SDS & # x02013PAGE para su visualización. En la segunda condición, se añadió 50 & # x003bcM Capu-tail a Capu-NT antes de añadir tripsina.

Para determinar los límites de las bandas estables después de la digestión tríptica, se procesó Capu-NT proteolizado en un gel SDS & # x02013PAGE y se transfirió a una membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). Las bandas se visualizaron mediante tinción de Coomassie y se cortaron de la membrana. El Centro de Proteómica de Nevada (Reno, NV) realizó la secuenciación de proteínas de Edman para identificar el extremo N-terminal. Para determinar los pesos moleculares de las bandas digeridas, tanto la Capu-NT no tratada como la digerida (5 min) se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI (Figura suplementaria S3B). Se mezcló Capu-NT (0,5 & # x003bcl de 3,2 & # x003bcM) con 0,5 & # x003bcl de ácido sinapínico saturado y se analizó en un espectrómetro de masas Voyager-DE STR MALDI-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Anisotropía de fluorescencia

Se midió la anisotropía de polarización de fluorescencia de 20 nM Capu-tail & # x02013 Alexa Fluor 488 (40% marcado), con cantidades crecientes de Capu-NT, Capu (1 & # x02013321) o Capu (1 & # x02013222), con un espectrofluorómetro. Todos los ensayos se llevaron a cabo a 25 ° C en HEPES 10 mM, pH 7,0, EGTA 1 mM, TCEP 1 mM, Thesit 0,5 mM, KCl 50 mM y MgCl 1 mM2. El fluoróforo se excitó con luz polarizada en plano a 488 nm y la emisión se midió a 520 nm en ángulos paralelos y perpendiculares al ángulo de incidencia. Se colocó un filtro de paso de banda a 520 & # x000b1 5 nm en la ruta de emisión. Los datos se analizaron como se describió anteriormente (Vizcarra et & # x000a0al., 2011 ).

Ensayos de microscopía TIRF

Los cubreobjetos para ensayos de elongación TIRF se prepararon esencialmente como se describe (Hansen et & # x000a0al., 2010). Brevemente, los cubreobjetos se lavaron mediante sonicación con etanol, hidróxido de potasio 1 M y etanol, lavando con agua Milli-Q después de cada paso. The coverslips were then sonicated with isopropanol (15 min), followed by 5% 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in isopropanol (30 min). Silanized coverslips were baked at 90ଌ and stored in 100% ethanol for up to 1 mo. Before PEGylation, coverslips were washed with Milli-Q water. A drop of 30 mg/ml norte-hydroxylsuccinimide𠄿unctionalized polyethylene glycol (PEG-NHS 97% methoxy-PEG-NHS and 3% biotin-PEG-NHS JenKem Technology, Allen, TX) in norte,norte-dimethyl formamide was placed on half of the silanized coverslips. Another coverslip was placed over each drop to create a sandwich. The PEGylation reaction was carried out by incubating the sandwiches at 75ଌ for at least 2 h, followed by multiple washes with Milli-Q water. PEGylated coverslips were stored in a sealed container at 4ଌ for up to 1 mo before use.

Heavy meromyosin (HMM a gift of the Reisler lab, University of California at Los Angeles) was biotinylated using maleimide-PEG11-biotin (Thermo Scientific, Waltham, MA). HMM (0.5 mg/ml) was incubated with 0.5 mM TCEP for 30 min at room temperature. TCEP was removed using a PD10 column (GE Healthcare), and HMM was eluted in 50 mM sodium phosphate, pH 7, and 100 mM sodium chloride. A 40-fold molar excess of maleimide-PEG11-biotin was incubated with the HMM for 2 h at room temperature, followed by dialysis with 25 mM Tris, pH 8, 30 mM KCl, and 1 mM DTT, and then the same buffer was mixed with equal volume of glycerol. The biotinylated-HMM was flash frozen and stored at �ଌ. Streptavidin (VWR, Radnor, PA) was diluted to 30 μM tetramer in Milli-Q water, flash frozen, and stored at �ଌ.

Flow cells with volumes of �� μl were assembled using double-stick tape. Immediately before imaging, 25 μl of 40 nM streptavidin was applied to the flow cell for 30 s, followed by a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer (50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7, 0.2 mM ATP, 50 mM DTT, 0.2% methylcellulose), 30 s of incubation with 25 μl of 20 nM biotinylated-HMM, and a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer. Profilin/actin (final concentration, 1 μM actin, 16% Oregon green labeled, and 5 μM Drosophila profilin) was incubated with ME buffer for 2 min at room temperature. A solution containing 2× TIRF buffer, glucose oxidase (final concentration 0.25 mg/ml), catalase (final concentration 0.05 mg/ml), and any additional proteins (1 nM Capu-CT and/or 100 nM Capu(1�) final concentrations) was mixed with the Mg-G-actin solution. Filament elongation was visualized on a DMI6000 TIRF microscope (Leica, Wetzlar, Germany) for at least 10 min, capturing images at 10-s intervals. Filament lengths and elongation rates were analyzed with JFilament incorporated in FIJI ( Smith etਊl., 2010 ).

Bulk elongation assay

Actin (5 μM) was polymerized in 1× KMEH buffer at 25ଌ for 1 h and aliquoted into 5-μl volumes of 5 μM 1 d before an experiment. To initiate polymerization at the barbed end, we added 20% labeled 0.5 μM Mg-G-actin to the seeds. Filament assembly was tracked for 700 s. Elongation rates were calculated from the slopes between 200 and 700 s. Final concentrations of proteins were 0.25 μM actin seeds, 0.5 μM Mg-G-actin, 100 nM Capu-CT, 500 nM Capu(1�), and 0.375 nM recombinant mouse capping protein 㬑㬢. Capu-CT was mixed with buffer or Capu(1�) and incubated for 60 s at 25ଌ. Subsequently, this mix was added to the seeds and incubated for another 30 s. At this time, Mg-G-actin was added to the ME buffer (see earlier description) and incubated for 2 min at 25ଌ. After 2 min, seeds, Mg-G-actin, and 1× KMEH buffer containing either buffer blank or CP were combined and analyzed in the fluorometer. To minimize filament shearing, cut pipette tips were used to transfer the polymerization reaction to the cuvette. For the “mid-assay” addition of protein, instead of adding Capu(1�) or Spir-KIND in the beginning of the assay, we added one or the other after recording elongation for 200 s. Each condition was repeated three times.

Circular dichroism

Proteins were dialyzed into 50 mM potassium phosphate, 1 mM DTT (pH 7). Circular dichroism spectra were measured on a J-715 spectropolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) by averaging three wavelength scans from 195 to 280 nm. The data were analyzed using a previously described method within the Jasco and Sofsec1 software packages ( Sreerama and Woody, 1993 ). The latter compares the input data with a database of spectra from proteins with known secondary structure.

Analytical ultracentrifugation

Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation was performed on Capu-NT and Capu(1�) essentially as described ( Chen etਊl., 2012). Both proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP (pH 7.5) and diluted to a final concentration of 2.4 μM Capu-NT or 5.0 μM Capu(1�). Proteins were spun at 50,000 rpm at 4ଌ for 3 h in an Optima XL-A Analytical Ultracentrifugation system (Beckman Coulter, Brea, CA). Data were acquired every 3 min for 50 scans. Data were analyzed with Beckman Origin-based software, version 3.01. Capu(1�) was unstable over the course of an experiment at 20ଌ. This breakdown is apparent in the analysis (Supplemental Figure S6A), where we see a clear peak at 2.7S and then trailing shoulders from that peak. Data acquired at 4ଌ were corrected for the viscosity change.

Sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation was performed at two speeds (11,000 and 13,000 rpm) with three different concentrations of Capu-NT (0.6, 1.8, and 2.8 μM). Scans collected between 24 and 28 h after speed was attained were analyzed. The same buffer conditions, centrifuge, and analysis software were used as in the velocity sedimentation experiments.

Size-exclusion column with multiangle light scattering

To analyze Capu(1�), Capu(1�), and Capu-NT with SEC-MALS, the proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP overnight and spin concentrated using an Amicon 10-kDa–molecular weight cutoff centrifugal filter unit. An analytical size-exclusion column (5 μm, 300 Å, 7.8 × 300 mm Wyatt Technology, Goleta, CA) was equilibrated with phosphate-buffered saline (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2correos4). In each case a 100-μl sample was loaded: 43.5 μM Capu(1�), 18.3 μM Capu(1�), or 5.8 μM Capu-NT. The smaller the size of the protein, the more protein was needed to detect light scattering signals. During elution, light scattering was measured with a miniDAWN TREOS and the refractive index (norte) was measured with an Optilab T-rEX system (Wyatt Technology). The data were analyzed by ASTRA 6 software to obtain average molecular weights ( Table 1 ). los dn/dc (dónde C is concentration) for the calculation was set to 0.185 ml/g, a typical value for proteins.


Prominent Changes in Hematology and Coagulation

Since a hyperinflammatory profile consistent with cytokine storm has been robustly associated with COVID-19 severity and suggested as the predominant cause of patient mortality, most initial literature has focused on the dysregulation of immune response in COVID-19 patients and the potential value of immune modulating treatments. However, evidence of alarming coagulation abnormalities and high incidence of thrombotic events in COVID-19 patients is prevalent (70). Early reports from Wuhan, China demonstrated prolonged activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time, and elevated D-dimer as well as thrombocytopenia (20, 139, 155). In a more in-depth study of 183 patients by Tang et al., 71.4% of non-survivors and 0.6% of recovered cases met the criteria for disseminated intravascular coagulation during hospitalization (128). In addition to prolonged prothrombin time, studies in other cohorts have reported high prevalence of lupus anticoagulant in the circulation (13). Recent autopsy data from Italy also observed fibrin thrombi in pulmonary small arterial vessels in 87% of fatal cases examined, suggesting the contribution of coagulation in diffuse alveolar and endothelial damage (15). These data clearly suggest a state of hypercoagulability in severe COVID-19.

Although prominent changes in blood coagulation may be a contributing mechanism to COVID-19 mortality, its pathogenesis is estimated to be tightly linked to inflammation and cytokine release. Specifically, immunothrombosis is a phenomenon known to occur as a result of host defense against various pathogens, including viral infection (30). For example, the activation of complement pathways can lead to initiation of the coagulation cascade (30, 127). Complement-mediated pulmonary tissue damage and microvascular injury have been observed in small cohorts with severe COVID-19 (85). Procoagulant response is also associated with the inflammatory effects of cytokines in the vascular endothelium, including increased vascular permeability and damage as a result of immune-cell infiltration (62). Given the correlation of IL-6 levels with increased fibrinogen and D-dimer in severe COVID-19 patients, it is likely that cytokine-mediated procoagulant changes are partially responsible for the specific thrombosis profile observed in critically ill patients (41, 110). Presence of neutrophil extracellular traps (NETs) are also possibly linked to COVID-19 thrombosis via activation of intrinsic coagulation (8, 50, 162). Overall, the predominant mechanism seems that encompassing SARS-CoV-2-induced endothelial damage fosters monocyte recruitment and activation, along with tissue factor exposure, which then activates blood coagulation. Recruitment of neutrophils by activated endothelial cells can also synthesize and release multiple cytokines into the circulation, further accelerating this process (93). In addition to the coagulopathy observed in COVID-19, severe bleeding in patients is rare in comparison to other RNA-type viruses with hemorrhagic manifestations (30). However, a recent report in Sangre characterized bleeding as a significant cause of morbidity in COVID-19 patients, emphasizing the need for randomized trials on the benefit of escalated prophylaxis (1). By taking these data into consideration, a close connection between the inflammatory and coagulation response of COVID-19 patients appears to exist, wherein treatment options for both contributing factors should be explored.


Información adicional

Conflicto de intereses

No competing interests declared.

Contribuciones de autor

Conceptualization, Resources, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Writing - review and editing.

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Conceptualization, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft.


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