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Captura de hibridación: captura de matriz frente a en solución

Captura de hibridación: captura de matriz frente a en solución


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Si quisiera utilizar la captura de hibridación para capturar ciertas regiones genómicas, podría hacerlo utilizando sondas complementarias inmovilizadas en una matriz o usar las sondas en solución y luego capturar las sondas usando la unión de biotina-estreptavidina.

¿Cómo se comparan los dos? ¿En solución de hibridación p. Ej. ¿Necesita más sondas? ¿En qué tendría que pensar al hacer mi elección?


Fronteras en microbiología

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Abstracto

El diseño y la interpretación de los ensayos de hibridación de superficie se complica por aspectos poco entendidos del entorno interfacial que provocan que los comportamientos cinéticos y termodinámicos se desvíen de los de la solución. El origen de estas diferencias radica en las interacciones adicionales experimentadas por la hibridación de hebras en la superficie. En este informe, se proporciona un análisis de los equilibrios de hibridación de superficie para "sondas" de oligonucleótidos monocatenarios unidas al extremo que hibridan con moléculas "diana" de solución monocatenaria de tamaño similar. Modelos teóricos de Vainrub y Pettitt (Phys. Rev. E2002, 66, 041905) y por Halperin, Buhot y Zhulina (Biophys. J.2004, 86, 718), y un modelo "extendido" que además incluye una dependencia de la sal similar a la solución de la dimerización de la sonda-diana, se comparan con experimentos en función de la concentración de sal y la cobertura de la sonda. Se observa una buena concordancia con el experimento cuando la fracción de volumen de ADN en la superficie permanece por debajo de ∼0,25. Sin embargo, ninguno de los modelos puede explicar una fuerte supresión de la hibridación cuando la fracción de volumen de ADN se acerca a 0,3, realizable en el límite de la alta resistencia del tampón y las películas densamente unidas. En estas condiciones, los rendimientos de la hibridación se vuelven insensibles a los aumentos en la concentración de analito, aunque muchas sondas permanecen disponibles para unir objetivos. Estas observaciones se atribuyen a la aparición de restricciones de empaquetamiento que, curiosamente, se vuelven limitantes significativamente por debajo de las coberturas máximas de ADN estimadas a partir de empaquetamiento hexagonal idealmente eficiente. Al delinear las condiciones bajo las cuales se observan comportamientos de hibridación específicos, los resultados avanzan en el conocimiento fundamental en apoyo de las aplicaciones de microarrays y biosensores de ADN.


Abstracto

La tecnología actual de análisis de microarrays utiliza predominantemente la fluorescencia como un punto final de señal detectable. Este estudio evaluó la cinética de captura de hibridación de superficie in situ en tiempo real para micropots de ADN impresos individuales en superficies de matriz sólida utilizando fluorescencia. La influencia de la posición del tinte de cianina de la sonda y la diana de ADN sobre el comportamiento de formación de dúplex de oligo-ADN se comparó en solución frente a manchas impresas de ADN único con hibridación de superficie utilizando análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Se analizaron las intensidades de fluorescencia del fluoróforo Cy3 / Cy5 tanto a través del espesor de la mancha de ADN hibridado impreso como radialmente a través de superficies de una sola mancha. Las imágenes confocales de un solo punto muestran que la cinética de hibridación in situ en tiempo real con concentraciones diana constantes cambia en función de la densidad de la sonda impresa. Las imágenes específicas del objetivo en puntos individuales exhiben una densidad radial de sonda impresa heterogénea que influye en la hibridación espacial y temporalmente a través de la difusión hemisférica radial del objetivo marcado con colorante desde el borde exterior del punto hacia el interior. FRET del objetivo capturado en la superficie se produce independientemente de la posición de la sonda / fluoróforo objetivo, como resultado del exceso de densidad de la sonda impresa y del grosor del punto. Ambas distribuciones de densidad de sonda heterogéneas en puntos impresos y la posición del fluoróforo en oligómeros de ADN cortos influyen en la cinética de formación de dúplex, las eficiencias de hibridación y los puntos finales de intensidad de fluorescencia general en formatos de captura de superficie. Este análisis es importante para comprender, controlar y cuantificar la señal de ensayo de matriz esencial para la aplicación confiable del formato de captura de superficie.


Contenido

Históricamente, la microscopía fue el método principal de investigación de la organización nuclear, [6] que se remonta a 1590. [7]

  • En 1879, Walther Flemming acuñó el término cromatina. [8]
  • En 1883, August Weismann relacionó la cromatina con la herencia.
  • En 1884, Albrecht Kossel descubrió las histonas.
  • En 1888, Sutton y Boveri propusieron la teoría de la continuidad de la cromatina durante el ciclo celular [9].
  • En 1889, Wilhelm von Waldemeyer creó el término "cromosoma". [10]
  • En 1928, Emil Heitz acuñó el término heterocromatina y eucromatina. [11]
  • En 1942, Conrad Waddington postuló los paisajes epigenéticos. [12]
  • En 1948, Rollin Hotchkiss descubrió la metilación del ADN. [13]
  • En 1953, Watson y Crick descubrieron la estructura de doble hélice del ADN. [14]
  • En 1961, Mary Lyon postuló el principio de inactivación de X.
  • En 1973/1974, se descubrió la fibra de cromatina. [12]
  • En 1975, Pierre Chambon acuñó el término nucleosomas. [12]
  • En 1982, se descubrieron territorios cromosómicos. [15]
  • En 1984, John T. Lis innovó la técnica de inmunoprecipitación de cromatina.
  • En 1993, se publicó el Ensayo de ligadura nuclear, un método que podía determinar las frecuencias de circularización del ADN en solución. Este ensayo se utilizó para demostrar que el estrógeno induce una interacción entre el promotor del gen de la prolactina y un potenciador cercano. [dieciséis]
  • En 2002, Job Dekker introdujo la nueva idea de que se podían utilizar matrices densas de frecuencias de interacción entre loci para inferir la organización espacial de los genomas. Esta idea fue la base para su desarrollo del ensayo de captura de conformación cromosómica (3C), publicado en 2002 por Job Dekker y sus colegas en el laboratorio Kleckner de la Universidad de Harvard. [17] [18]
  • En 2003, se terminó el Proyecto Genoma Humano.
  • En 2006, Marieke Simonis inventó 4C, [19] Dostie, en el laboratorio Dekker, inventó 5C. [20]
  • En 2007, B. Franklin Pugh innovó la técnica ChIP-seq. [21]
  • En 2009, Lieberman-Aiden y Job Dekker inventaron Hi-C, [22] Melissa J. Fullwood y Yijun Ruan inventaron ChIA-PET. [23]
  • En 2012, el grupo The Ren y los grupos dirigidos por Edith Heard y Job Dekker descubrieron dominios de asociación topológica (TAD) en mamíferos. [24] [25]
  • En 2013, Takashi Nagano y Peter Fraser introdujeron la ligadura en el núcleo para Hi-C y Hi-C unicelular. [26]

Todos los métodos 3C comienzan con un conjunto similar de pasos, realizados en una muestra de células.

En primer lugar, los genomas celulares se entrecruzan con formaldehído, [27] que introduce enlaces que "congelan" las interacciones entre los loci genómicos. El tratamiento de las células con formaldehído al 1-3% durante 10-30 min a temperatura ambiente es el más común; sin embargo, es necesaria la estandarización para prevenir el entrecruzamiento alto de proteína-ADN, ya que esto puede afectar negativamente la eficiencia de la digestión de restricción en el paso posterior. [28] Luego, el genoma se corta en fragmentos con una endonucleasa de restricción. El tamaño de los fragmentos de restricción determina la resolución del mapeo de interacción. Las enzimas de restricción (RE) que hacen cortes en las secuencias de reconocimiento de 6 pb, como EcoR1 o HindIII, se utilizan para este propósito, ya que cortan el genoma una vez cada 4000 pb, dando

1 millón de fragmentos en el genoma humano. [28] [29] Para un mapeo de interacción más preciso, también se puede usar un RE de reconocimiento de 4 pb. El siguiente paso es la ligadura por proximidad. Esto tiene lugar a bajas concentraciones de ADN o dentro de núcleos intactos y permeabilizados [26] en presencia de ADN ligasa T4, [30] de modo que se favorece la ligadura entre fragmentos que interactúan entrecruzados sobre la ligadura entre fragmentos que no están entrecruzados. Posteriormente, los loci que interactúan se cuantifican mediante la amplificación de uniones ligadas mediante métodos de PCR. [28] [30]

Métodos originales Editar

3C (uno contra uno) Editar

El experimento de captura de conformación cromosómica (3C) cuantifica las interacciones entre un solo par de loci genómicos. Por ejemplo, 3C puede usarse para probar una interacción promotor-potenciador candidata. Los fragmentos ligados se detectan mediante PCR con cebadores conocidos. [2] [17] Es por eso que esta técnica requiere el conocimiento previo de las regiones que interactúan.

4C (uno contra todos) Editar

La captura en chip de la conformación cromosómica (4C) captura las interacciones entre un locus y todos los demás loci genómicos. Se trata de un segundo paso de ligadura, para crear fragmentos de ADN autocircularizados, que se utilizan para realizar la PCR inversa. La PCR inversa permite utilizar la secuencia conocida para amplificar la secuencia desconocida ligada a ella. [31] [2] [19] En contraste con 3C y 5C, la técnica 4C no requiere el conocimiento previo de ambas regiones cromosómicas que interactúan. Los resultados obtenidos con 4C son altamente reproducibles con la mayoría de las interacciones que se detectan entre regiones próximas entre sí. En una sola micromatriz, se pueden analizar aproximadamente un millón de interacciones. [ cita necesaria ]

5C (muchos contra muchos) Editar

La copia de carbón de captura de conformación cromosómica (5C) detecta interacciones entre todos los fragmentos de restricción dentro de una región dada, con el tamaño de esta región típicamente no mayor que una megabase. [2] [20] Esto se hace ligando cebadores universales a todos los fragmentos. Sin embargo, 5C tiene una cobertura relativamente baja. La técnica 5C supera los problemas de unión en el paso de ligadura intramolecular y es útil para construir interacciones complejas de loci específicos de interés. Este enfoque no es adecuado para realizar interacciones complejas en todo el genoma, ya que para ello se necesitarán millones de cebadores 5C. [ cita necesaria ]

Hi-C (todos contra todos) Editar

Hi-C utiliza secuenciación de alto rendimiento para encontrar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos [2] [22] y utiliza secuenciación de extremos emparejados, que recupera una secuencia corta de cada extremo de cada fragmento ligado. Como tal, para un fragmento ligado dado, las dos secuencias obtenidas deberían representar dos fragmentos de restricción diferentes que se ligaron juntos en la etapa de ligación basada en la proximidad. El par de secuencias se alinean individualmente con el genoma, determinando así los fragmentos involucrados en ese evento de ligación. Por tanto, se prueban todas las posibles interacciones por pares entre fragmentos.

Métodos basados ​​en captura de secuencias Editar

Varios métodos utilizan la captura de oligonucleótidos para enriquecer bibliotecas de 3C y Hi-C para loci de interés específicos. [32] [33] Estos métodos incluyen Capture-C, [34] NG Capture-C, [35] Capture-3C, [34] HiCap, [32] [36] Capture Hi-C. [37] y Micro Capture-C. [38] Estos métodos pueden producir mayor resolución y sensibilidad que los métodos basados ​​en 4C, [39] Micro Capture-C proporciona la resolución más alta de las técnicas 3C disponibles y es posible generar datos de resolución de pares de bases. [38]

Métodos de celda única Editar

Las adaptaciones unicelulares de estos métodos, como ChIP-seq y Hi-C, pueden usarse para investigar las interacciones que ocurren en células individuales. [40] [41]

Métodos basados ​​en inmunoprecipitación Editar

Editar ChIP-loop

ChIP-loop combina 3C con ChIP-seq para detectar interacciones entre dos loci de interés mediadas por una proteína de interés. [2] [42] El ChIP-loop puede resultar útil para identificar cis-interacciones y trans interacción mediada a través de proteínas ya que no se producirán frecuentes colisiones de ADN. [ cita necesaria ]

Métodos amplios del genoma Editar

ChIA-PET combina Hi-C con ChIP-seq para detectar todas las interacciones mediadas por una proteína de interés. [2] [23] HiChIP fue diseñado para permitir un análisis similar al ChIA-PET con menos material de entrada. [43]

Los métodos 3C han dado lugar a una serie de conocimientos biológicos, incluido el descubrimiento de nuevas características estructurales de los cromosomas, la catalogación de los bucles de cromatina y una mayor comprensión de los mecanismos de regulación transcripcional (cuya interrupción puede conducir a una enfermedad). [6]

Los métodos 3C han demostrado la importancia de la proximidad espacial de los elementos reguladores a los genes que regulan. Por ejemplo, en tejidos que expresan genes de globina, la región de control del locus de β-globina forma un bucle con estos genes. Este bucle no se encuentra en tejidos donde no se expresa el gen. [44] Esta tecnología ha ayudado aún más al estudio genético y epigenético de los cromosomas tanto en organismos modelo como en humanos. [ no verificado en el cuerpo ]

Estos métodos han revelado una organización a gran escala del genoma en dominios de asociación topológica (TAD), que se correlacionan con marcadores epigenéticos. Algunos TAD son transcripcionalmente activos, mientras que otros están reprimidos. [45] Se han encontrado muchos TAD en D. melanogaster, ratón y humanos. [46] Además, el CTCF y la cohesina juegan un papel importante en la determinación de los TAD y las interacciones potenciador-promotor. El resultado muestra que la orientación de los motivos de unión de CTCF en un bucle potenciador-promotor debe estar enfrentada entre sí para que el potenciador encuentre su objetivo correcto. [47]

Enfermedad humana Editar

Existen varias enfermedades causadas por defectos en las interacciones promotor-potenciador, que se revisan en este artículo. [48]

La beta talasemia es un cierto tipo de trastornos sanguíneos causados ​​por una deleción del elemento potenciador de LCR. [49] [50]

La holoprosencefalia es un trastorno cefálico causado por una mutación en el elemento potenciador SBE2, que a su vez debilitó la producción del gen SHH. [51]

La PPD2 (polidactilia de un pulgar trifalángico) es causada por una mutación del potenciador de ZRS, que a su vez fortaleció la producción del gen SHH. [52] [53]

El adenocarcinoma de pulmón puede ser causado por una duplicación del elemento potenciador del gen MYC. [54]

La leucemia linfoblástica aguda de células T es causada por la introducción de un nuevo potenciador. [55]

Los diferentes experimentos de estilo 3C producen datos con estructuras y propiedades estadísticas muy diferentes. Como tal, existen paquetes de análisis específicos para cada tipo de experimento. [33]

Los datos de Hi-C se utilizan a menudo para analizar la organización de la cromatina en todo el genoma, como los dominios de asociación topológica (TAD), regiones linealmente contiguas del genoma que están asociadas en el espacio 3-D. [45] Se han desarrollado varios algoritmos para identificar TAD a partir de datos Hi-C. [4] [60]

Hi-C y sus análisis posteriores están evolucionando. Fit-Hi-C [3] es un método basado en un enfoque de agrupamiento discreto con modificaciones para agregar distancia de interacción (ajuste de spline inicial, también conocido como spline-1) y refinar el modelo nulo (spline-2). El resultado de Fit-Hi-C es una lista de interacciones intracromosómicas por pares con sus valores p y valores q. [59]

La organización tridimensional del genoma también se puede analizar mediante la descomposición propia de la matriz de contacto. Cada vector propio corresponde a un conjunto de loci, que no son necesariamente contiguos linealmente, que comparten características estructurales. [61]

Un factor de confusión significativo en las tecnologías 3C son las frecuentes interacciones no específicas entre los loci genómicos que se producen debido al comportamiento aleatorio de los polímeros. Una interacción entre dos loci debe confirmarse como específica mediante pruebas de significación estadística. [3]

Normalización del mapa de contactos de Hi-C Editar

Hay dos formas principales de normalizar los mapas de calor de contacto Hi-C sin procesar. La primera forma es asumir la misma visibilidad, lo que significa que existe la misma posibilidad de que cada posición cromosómica tenga una interacción. Por lo tanto, la verdadera señal de un mapa de contacto Hi-C debe ser una matriz balanceada (la matriz balanceada tiene sumas de filas y columnas constantes). Un ejemplo de algoritmos que asume la misma visibilidad es el algoritmo Sinkhorn-Knopp, que escala el mapa de contacto Hi-C sin procesar en una matriz equilibrada.

La otra forma es asumir que existe un sesgo asociado con cada posición cromosómica. El valor del mapa de contacto en cada coordenada será la verdadera señal en esa posición por el sesgo asociado con las dos posiciones de contacto. Un ejemplo de algoritmos que tienen como objetivo resolver este modelo de sesgo es la corrección iterativa, que retrocedió iterativamente el sesgo de fila y columna del mapa de contacto de Hi-C sin procesar. Hay una serie de herramientas de software disponibles para el análisis de datos de Hi-C. [62]

Análisis de motivos de ADN Editar

Los motivos de ADN son secuencias de ADN cortas específicas, a menudo de 8 a 20 nucleótidos de longitud [63], que están sobrerrepresentadas estadísticamente en un conjunto de secuencias con una función biológica común. Actualmente, los motivos reguladores de las interacciones de cromatina de largo alcance no se han estudiado de forma exhaustiva. Varios estudios se han centrado en dilucidar el impacto de los motivos de ADN en las interacciones promotor-potenciador.

Bailey y col. ha identificado que el motivo ZNF143 en las regiones promotoras proporciona especificidad de secuencia para interacciones promotor-potenciador. [64] La mutación del motivo ZNF143 disminuyó la frecuencia de interacciones promotor-potenciador, lo que sugiere que ZNF143 es un nuevo factor de bucle de cromatina.

Para el análisis de motivos a escala del genoma, en 2016, Wong et al. informó una lista de 19491 pares de motivos de ADN para la línea celular K562 en las interacciones promotor-potenciador. [65] Como resultado, propusieron que la multiplicidad de emparejamiento de motivos (número de motivos que se emparejan con un motivo dado) está vinculada a la distancia de interacción y al tipo de región reguladora. Al año siguiente, Wong publicó otro artículo que informaba de 18.879 pares de motivos en 6 líneas celulares humanas. [66] Una contribución novedosa de este trabajo es MotifHyades, una herramienta de descubrimiento de motivos que se puede aplicar directamente a secuencias emparejadas.

Análisis del genoma del cáncer Editar

Las técnicas basadas en 3C pueden proporcionar información sobre los reordenamientos cromosómicos en los genomas del cáncer. [67] Además, pueden mostrar cambios en la proximidad espacial de los elementos reguladores y sus genes diana, lo que aporta una comprensión más profunda de la base estructural y funcional del genoma. [68]


Condiciones de hibridación y temperatura de fusión

El rigor es un término con el que muchos tecnólogos moleculares están muy familiarizados. Es un término que describe la combinación de condiciones bajo las cuales un objetivo está expuesto a la sonda. Típicamente, las condiciones que exhiben un alto grado de rigurosidad exigen más la complementariedad y la longitud de la sonda a la diana. Las condiciones de baja rigurosidad son mucho más indulgentes.

  • Si las condiciones de rigurosidad son demasiado ALTAS → La sonda no se une al objetivo
  • Si las condiciones de rigurosidad son demasiado BAJAS → La sonda se une a objetivos no relacionados

Factores importantes que afectan la rigurosidad y la hibridación

  • Temperatura de hibridación y concentración de sal.
    • El aumento de la temperatura de hibridación o la disminución de la cantidad de sal en el tampón aumenta la especificidad de la sonda y disminuye la hibridación de la sonda con secuencias que no son 100% iguales.
    • Por ejemplo: la formamida desionizada y el SDS se pueden utilizar para reducir la unión no específica de la sonda.

    & # 8211 La sonda ha aumentado el número de bases G y C

    & # 8211 La sonda ha aumentado el número de bases A y T

    Temperatura de fusión (Tmetro) Sondas largas

    • Las condiciones ideales de hibridación se estiman a partir del cálculo de la Tmetro.
    • La tmetro de la secuencia de la sonda es una forma de expresar la cantidad de energía requerida para separar las hebras hibridadas de una secuencia dada.
    • En la Tmetro: La mitad de la secuencia es bicatenaria y la mitad de la secuencia es monocatenaria.
    • Tm = 81.5 ° C + 16.6logM + 0.41 (% G + C) - 0.61 (% formamida) - (600 / n)

    Donde M = concentración de sodio en mol / L

    n = número de pares de bases en el dúplex más pequeño

    • Si tenemos en cuenta que el ARN es monocatenario (ss) y el ADN es bicatenario (ds), lo siguiente debe ser cierto:

    ARN: Híbridos de ADN más estables

    ADN: híbridos de ADN menos estables

    Calculando la Tmetro para sondas cortas (14-20 pares de bases)

    • Tm = 4 ° C x número de pares G / C + 2 ° C x número de pares A / T
    • La temperatura de hibridación (temp. De hibridación) de las sondas de oligonucleótidos es aproximadamente 5 ° C por debajo de la temperatura de fusión.

    Complejidad de secuencia (Cot)

    • La complejidad de la secuencia se refiere a la longitud de secuencias de nucleótidos no repetitivas únicas.
    • Cot = Concentración inicial de ADN (Co) x tiempo necesario para reanimarlo (t)
    • Cot1/2 = Tiempo requerido para que la mitad de la secuencia bicatenaria se recoja en un conjunto dado de condiciones.
    • Las sondas cortas pueden hibridar en 1 a 2 horas, mientras que las sondas largas requieren más tiempo.

    Prueba tus conocimientos

    Respuesta
    Si el número de pares G / C = 11 y el número de pares A / T = 9. El cálculo es el siguiente:
    4 (11) + 2 (9) = X
    X = 62 ° C

    -LeAnne Noll, BS, MB (ASCP) CM es una tecnóloga molecular en Wisconsin y fue reconocida como una de las cinco mejores de ASCP del programa 40 Under Forty en 2015.

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    Sensores de contaminantes: nanosensores, una alarma eficaz para la detección de patógenos alimentarios

    Cheunjit Prakitchaiwattana, Rachatida Det-udom, en Nanobiosensores, 2017

    3.2.2 Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en nanotecnología y nanomateriales

    El ensayo de hibridación de sondas de ácidos nucleicos no es el único método basado en ácidos nucleicos que se utiliza en la detección e identificación de patógenos transmitidos por los alimentos, pero la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se emplea ampliamente. Los ensayos de PCR pueden amplificar un solo ADN objetivo y múltiples objetivos (PCR multiplex) para la detección específica de patógenos. Para la detección de células viables, se desarrolló además la PCR con transcriptasa inversa para detectar transcripciones de ARNm de genes específicos de bacterias diana (Klein y Juneja, 1997 Hill et al., 1998). Se puede aplicar tanto la PCR convencional como en tiempo real para detectar e identificar patógenos bacterianos. Además, la variación en los objetivos genómicos que pueden seleccionarse para su uso se destaca por varias referencias clave como se resume en Byrne et al. (2015). La ventaja clave de los ensayos basados ​​en PCR es la capacidad de detectar simultáneamente múltiples patógenos en una sola muestra utilizando PCR multiplex. Además, se pueden construir ensayos de PCR para diferenciar entre células viables y no viables mediante modificación por nanotecnología.

    Las perlas nanomagnéticas como cebadores magnéticos se han utilizado en nuevas estrategias para que los sensores electroquímicos de ADN mejoren la sensibilidad y la selectividad. Por ejemplo, Lermo et al. (2007) utilizaron cebadores magnéticos para la amplificación in situ de Salmonela genoma en perlas magnéticas y luego se separó el producto amplificado con electrodos magneto basados ​​en compuesto de grafito-epoxi. El ensayo de PCR se realizó mediante la inmovilización de la sonda de captura biotinilada en la perla magnética modificada, junto con la hibridación de la secuencia IS200 específica para Salmonela y la sonda de digoxigenina. Posteriormente se realizó el marcaje enzimático utilizando el anticuerpo anti-digoxigenina peroxidasa de rábano picante. Después de la amplificación in situ de la plantilla de ADN en perlas magnéticas, el producto de PCR doblemente marcado se detectó así rápidamente mediante la estrategia electroquímica de magnetobiosección. A continuación, se evaluó el cambio amperométrico debido al dúplex doblemente marcado. Los resultados mostraron que la amplificación directa de ADN se realizó con éxito en perlas magnéticas utilizando el cebador magnético. Además, el electrodo magneto pudo detectar cambios en el polimorfismo de un solo nucleótido, cuando se utilizaron condiciones de hibridación estrictas. En conclusión, esta estrategia podría utilizarse para la detección rápida y sensible de muestras amplificadas por PCR.

    Yang et al. (2013). La técnica fue propuesta para la detección simultánea de Salmonela Typhimurium, E. coli O157: H7 y Listeria monocytogenes, y también probado en productos alimenticios. La separación inmunomagnética basada en nanoperlas magnéticas se utilizó para separar las células bacterianas diana, mientras que se utilizó PCR multiplex para amplificar los genes diana. Inicialmente, las bacterias diana también se trataron con propidio monoazida antes de la extracción de ADN para eliminar la interferencia de las células no viables. El resultado mostró que el límite de detección del ensayo fue de aproximadamente 100 ufc / ml para las tres cepas bacterianas en cultivo puro y alrededor de 1000 ufc / g para todas las cepas enriquecidas en muestras de alimentos de lechuga, tomate y carne molida. Aunque este ensayo es muy innovador en comparación con los otros métodos basados ​​en ácidos nucleicos, requiere aislamiento bacteriano, lisis y / o aislamiento de ADN bacteriano, lo que limita la aplicación en circunstancias reales durante el trabajo de campo.


    Discusión

    Presentamos lo que, según nuestro conocimiento, es el primer intento de capturar ADN antiguo con dos métodos independientes de captura en solución. Aunque se basa en un conjunto de datos limitado, creemos que los datos presentados contienen información útil para ayudar a guiar estudios futuros. Nuestros datos sugieren que varias de las variables probadas parecen tener una importancia limitada. Por ejemplo, en general, no observamos ninguna ventaja abrumadora de un kit sobre el otro. Aunque los experimentos de SureSelect contenían proporciones más altas de secuencias en el objetivo, también contenían niveles más altos de datos clonales, reduciendo así los niveles generales de post-filtrado de secuencias útiles. Además, mientras que el uso de diferentes diseños de mosaico en los experimentos de MySelect permitió una estimación directa de la ventaja de usar diseños más ajustados (mayor densidad de mosaico) a expensas de una menor secuencia objetivo, observamos que el uso de diseños más ajustados no se traducía consistentemente en mejores valores de enriquecimiento.

    Por el contrario, creemos que hay dos observaciones principales que serán importantes para los futuros estudios de secuenciación de objetivos de ADNa. En primer lugar, una gran proporción de las secuencias derivadas de la amplificación clonal y, por tanto, serían de uso limitado en los análisis posteriores. Debido a que los experimentos de enriquecimiento y captura de ADN antiguos aún se encuentran en su etapa más temprana, nos resultó difícil comparar nuestras observaciones con los otros pocos informes sobre el tema, ya que no se ha realizado una estandarización para informar las tasas de enriquecimiento y no estaba claro a primera vista si estos incluían clonalidad o no en sus estimaciones. Por lo tanto, creemos que la clonalidad debe discutirse sin ambigüedades en las publicaciones relevantes y que dichos datos deben excluirse de los cálculos de enriquecimiento al menos creemos que nuestra disciplina debe participar en una discusión destacada sobre el tema para finalmente alcanzar una convención estandarizada de tasas de enriquecimiento.

    En segundo lugar, la inclusión de objetivos presentes en diferentes niveles del genoma en la misma matriz de captura parece tener un efecto negativo en los resultados. Específicamente, especulamos que las regiones repetidas se capturan y amplifican preferentemente. Esto resalta la relevancia de diseñar sondas para apuntar exclusivamente a loci de copia única, así como para mantener el número de ciclos al mínimo, lo que también tendría un efecto positivo en los resultados al reducir el número de clones.

    Aunque demostramos la plausibilidad de capturar un ADNa de granos de maíz, queda por explorar la eficiencia en otros tejidos antiguos. Aunque el único informe adicional sobre el enriquecimiento de la captura de ADNa nuclear se limita al hueso neandertal, el futuro parece bastante prometedor para la investigación de ADNa con la secuenciación dirigida cada vez más accesible y las plataformas de secuenciación más nuevas que ingresan al mercado.


    Ensayos de captura de ácidos nucleicos

    Las Dynabeads acopladas a estreptavidina son ideales para la captura de secuencias de ADN / ARN de baja abundancia de muestras clínicas (sangre, heces, líquido cefalorraquídeo, etc.). El método ofrece varias ventajas, incluida la eliminación de ADN / ARN extraños y sustancias inhibidoras, así como la concentración de su preciado y diluido objetivo en un pequeño volumen para su posterior análisis. Dependiendo de la sonda, el objetivo y la aplicación específica, el enfoque de captura puede ser directo o indirecto.

    El ARN viral, el ADN de bacterias exigentes, las secuencias mutadas y los microsatélites y muchos otros objetivos específicos se capturan a partir de muestras complejas utilizando Dynabeads acopladas a estreptavidina y una sonda biotinilada.

    Las Dynabeads muestran una excelente cinética de reacción comparable a la cinética de la fase líquida y son particularmente adecuadas para la preparación y manipulación automatizadas de muestras. Su alta movilidad magnética y su baja tasa de sedimentación los hacen ideales para la manipulación robótica.

    ¿Captura directa o indirecta de ácidos nucleicos?

    Dependiendo de su molécula objetivo y la aplicación específica, se puede aplicar el método de captura directa o indirecta.

    Para algunas aplicaciones, el uso de un ligando acoplado previamente para la captura directa le permite reutilizar las Dynabeads y así reducir aún más los costos de preparación de muestras.

    Un enfoque indirecto puede ser beneficioso cuando la concentración de su objetivo es baja, la afinidad específica es débil o la cinética de unión es lenta. En el enfoque indirecto, se permite que la sonda / ligando se una a la diana en suspensión antes de la adición de las perlas.

    Una monocapa de estreptavidina se acopla covalentemente a las Dynabeads, lo que garantiza una fuga insignificante que, de otro modo, podría perturbar su ensayo.


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