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En un ser humano, ¿qué células que no pertenecen a la línea germinal tienen la masa más alta / más baja?

En un ser humano, ¿qué células que no pertenecen a la línea germinal tienen la masa más alta / más baja?


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Solo tengo curiosidad por saber qué células son más grandes / más pequeñas en el cuerpo humano además de los óvulos / espermatozoides.


Células grandes: los adipocitos, las células que almacenan grasa son posiblemente las más grandes en los seres humanos, porque después de la pubertad rara vez se dividen y simplemente se agrandan si una persona aumenta de peso. Un adipocito típico tiene aproximadamente 0,1 mm de diámetro, pero puede ser mucho más grande. Otro buen candidato es un megacariocito, que es una célula gigantesca (de hasta 0,1 mm) con múltiples copias de su genoma que produce plaquetas sanguíneas. Dependiendo de su definición de una sola célula, también los miocitos pueden considerarse células grandes, porque durante el desarrollo varias células se fusionan para formar una fibra muscular. Además, los miocitos aumentan de peso si una persona hace ejercicio y fortalece los músculos.

Las celdas pequeñas son más comunes y es difícil señalar algunas celdas consistentemente más pequeñas. El tipo de células más pequeñas son definitivamente las plaquetas y los eritrocitos (glóbulos rojos; están anucleados, por lo que pueden no considerarse células "reales"). Generalmente, la parte que determina el tamaño mínimo de la célula es el núcleo, por lo que cualquier célula que sea más o menos metabólicamente inactiva puede ser un poquito más grande que el tamaño de sus núcleos. Estas pueden ser, por ejemplo, las células polares, las células diminutas, que portan el exceso de genoma durante la meiosis en las mujeres y mueren poco después.

Si está interesado en todo tipo de células extrañas dentro de usted, puede comenzar navegando por esta hermosa, aunque larga lista.


Investigación con células madre

3.2.3 Células madre fetales

Las células madre fetales fueron aisladas y cultivadas por primera vez por John Gearhart y su equipo en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins en 1998 (Shamblott et al., 1998). Estas células conocidas como células germinales primordiales son los precursores de óvulos y espermatozoides y se aislaron de las crestas gonadales y el mesenterio de fetos de 5-9 semanas obtenidos mediante aborto terapéutico. Las células germinales embrionarias (EG) aisladas de ellas son pluripotentes. Los problemas asociados con el aislamiento de estas células madre son (1) pueden obtenerse solo de fetos de 8 a 9 semanas y (2) las células EG tienen proliferación limitada capacidad.


Abstracto

El marcaje de proximidad catalizado por enzimas promiscuas, como TurboID, ha permitido el análisis proteómico de regiones subcelulares de difícil o imposible acceso mediante enfoques convencionales basados ​​en fraccionamiento. Sin embargo, algunas regiones celulares, como los sitios de contacto de orgánulos, permanecen fuera del alcance de los métodos PL actuales. Para abordar esta limitación, dividimos la enzima TurboID en dos fragmentos inactivos que se recombinan cuando son impulsados ​​juntos por una interacción proteína-proteína o aposición membrana-membrana. En los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias, TurboID reconstituido catalizó la biotinilación espacialmente restringida, lo que permitió el enriquecimiento y la identificación de proteínas endógenas de & gt100, incluidas muchas no vinculadas previamente a los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias. Validamos ocho candidatos mediante el fraccionamiento bioquímico y las imágenes de sobreexpresión. En general, split-TurboID es una herramienta versátil para el etiquetado de proximidad condicional y espacialmente específico en celdas.

Se ha demostrado que el etiquetado de proximidad (PL) es una herramienta valiosa para estudiar la localización de proteínas y las interacciones en células vivas (1 ⇓ –3). En PL, una enzima promiscua como APEX (4, 5), BioID (6) o TurboID (7) se dirige genéticamente a un orgánulo o complejo proteico de interés. La adición de un sustrato de molécula pequeña derivado de biotina inicia entonces la biotinilación de proteínas endógenas dentro de unos pocos nanómetros de la enzima promiscua, a través de un intermedio radical difusible en el caso de APEX, o un intermedio de adenilato de biotina activado en el caso de BioID y TurboID. Después de la lisis celular, las proteínas biotiniladas se recolectan usando perlas de estreptavidina y se identifican mediante espectrometría de masas.

PL se ha aplicado en muchos tipos de células y especies para mapear la composición del proteoma de orgánulos, incluidas las mitocondrias (5, 8 ⇓ –10), sinapsis (11, 12), gránulos de estrés (13) y cilios primarios (14). Sin embargo, para aumentar la versatilidad de PL, se necesitan nuevas variantes de enzimas. En particular, las enzimas divididas podrían permitir una mayor especificidad espacial en el direccionamiento de la actividad de biotinilación, así como la actividad PL que está condicionada a una entrada específica, como fármaco, calcio o contacto célula-célula. Por ejemplo, los sitios de contacto entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico (RE) median una biología diversa, desde la biosíntesis de lípidos y la señalización de Ca +2 hasta la regulación de la fisión mitocondrial (15). Existe un gran interés en investigar la composición proteómica de los contactos ER-mitocondria. Sin embargo, la fusión directa de una enzima PL a una de las proteínas residentes del contacto ER-mitocondrias conocidas (p. Ej., Drp1 o Mff) también generaría actividad PL fuera de los contactos ER-mitocondrias, porque estas proteínas también residen en otras ubicaciones subcelulares (16 , 17). Por otro lado, el uso de una enzima PL dividida, con un fragmento dirigido a las mitocondrias y el otro dirigido al RE, restringiría la actividad de biotinilación a los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias específicamente.

Previamente se han informado formas divididas de APEX (18) y BioID (19 ⇓ –21). Sin embargo, split-APEX (desarrollado por nosotros) no se ha utilizado para proteómica, y el requisito de H exógeno2O2 y la adición de hemo limita su utilidad in vivo. Split-BioID fue informado por primera vez por De Munter et al. (19), seguido de versiones más activas de Schopp et al. (20) y Kwak et al. (21). Todos se derivan de la enzima parental BioID, que requiere de 18 a 24 h de marcaje con biotina. Mostramos a continuación que Schopp et al. (20) split-BioID no produce actividad detectable, mientras que Kwak et al. (21) split-BioID requiere más de 16 h de etiquetado para generar suficiente señal.

Por lo tanto, buscamos desarrollar una enzima PL dividida mejorada y más activa partiendo de TurboID. A diferencia de APEX, TurboID no requiere cofactores o cooxidantes, solo la adición de biotina inicia el etiquetado en células o animales. TurboID también es & gt100 veces más rápido que BioID, requiriendo solo de 1 a 10 minutos de tiempo de etiquetado (7). Realizamos un cribado de 14 sitios de división de TurboID diferentes para identificar fragmentos óptimos para la reconstitución de alta y baja afinidad. Convergimos en la división de TurboID en L73 / G74, que dio una reconstitución dependiente de rapamicina cuando se fusionó con FRB y FKBP en múltiples orgánulos subcelulares. Luego usamos este TurboID dividido para realizar el mapeo proteómico de los sitios de contacto ER-mitocondrias en células de mamíferos. El proteoma resultante de 101 proteínas es altamente específico e identifica muchos nuevos candidatos a sitios de contacto ER-mitocondrias, ocho de los cuales validamos mediante fraccionamiento bioquímico o imágenes de sobreexpresión.


En un ser humano, ¿qué células que no pertenecen a la línea germinal tienen la masa más alta / más baja? - biología

Figura 1: Cálculo de la parte posterior del sobre que muestra la fracción de la masa seca celular dedicada a los ribosomas a una tasa de crecimiento bacteriano rápido. Número de ribosomas basado en BNID 101441 y masa seca celular basada en BNID 103891.

Figura 2: Fracción de la tasa de síntesis de proteína ribosomal de la síntesis de proteína celular total. Las mediciones se realizaron en cultivos en crecimiento equilibrado y, por tanto, la tasa relativa es similar a la abundancia relativa de las proteínas ribosómicas en el proteoma. Adaptado de J. L. Ingraham et al., & # 8220 Physiology of the bacterial cell & # 8221 página 276, Sinauer 1990.

Uno de los refranes familiares en casi todos los libros de texto de biología es que las proteínas son los caballos de batalla de la célula. Como resultado, las células están profundamente atentas a todos los pasos entre la lectura de la información genética oculta dentro del ADN y la expresión de proteínas activas. Una de las formas en que se controla el ritmo general de producción de proteínas es ajustando el número de ribosomas. Los ribosomas son uno de los componentes dominantes de las células y, en las células que se dividen rápidamente, comienzan a ocupar una fracción significativa del interior celular. El ARN que forma estos ribosomas representa aproximadamente el 85% del conjunto total de ARN de la célula (BNID 106421). Aunque la replicación, transcripción y traducción del ADN son los tres pilares del dogma central, dentro del proteoma, la fracción dedicada a la ADN polimerasa (BNID 104123) o la ARN polimerasa (BNID 101440) es muchas veces menor que las decenas de por ciento de la proteína celular. dedicado a los ribosomas (BNID 107349, 102345). Como tal, existe un interés especial en la abundancia de ribosomas y la dependencia de esta abundancia de la tasa de crecimiento. El trabajo fundamental de Schaechter et al. establecido temprano en la observación nada trivial de que la fracción ribosómica es una función de la tasa de crecimiento y en su mayoría independiente del sustrato, es decir, diferentes medios que conducen a tasas de crecimiento similares tienden a tener fracciones ribosómicas similares (M. Schaechter et al. .J Gen Microbiol. 19: 592, 1958). Los miembros de la llamada "escuela de Copenhague" (incluidos Schaechter, Maaloe, Marr, Neidhardt, Ingraham y otros) continuaron realizando una caracterización cuantitativa extensa de cómo los constituyentes celulares varían con la tasa de crecimiento que sirven como puntos de referencia décadas después de su publicación y proporcionan una descripción convincente. ejemplo de biología cuantitativa mucho antes del advenimiento de las técnicas de alto rendimiento.

La Tabla 1 muestra el número de ribosomas en E. coli en diferentes tiempos de duplicación. En la tabla también es evidente cómo la masa celular (y el volumen) depende en gran medida de la tasa de crecimiento, siendo mucho más grandes las células que se dividen más rápido. Como se calcula en la cuarta columna de la tabla, y esquemáticamente en la Figura 1, en un tiempo de duplicación rápido de 24 minutos, los 72.000 ribosomas por célula representan más de 1/3 de la masa seca de la célula (BNID 101441, 103891). Las mediciones precisas de esta fracción de la década de 1970 se muestran en la Figura 2.

Tabla 1: Número y fracción de ribosomas en función del tiempo de duplicación. Los valores se redondean a un dígito significativo. Los ribosomas por célula son de “E. coli & amp Salmonella handbook ”, Capítulo 97, Tabla 3. La masa seca por célula proviene de E. coli & amp Salmonella, Capítulo 97, Tabla 2. La fracción de masa seca del ribosoma se calcula en base a la masa del ribosoma de 2,7 MDa (BNID 100118).

Se han establecido varios modelos para explicar estas tendencias observadas para el número de ribosomas por célula. Para dividirse, una célula tiene que replicar su contenido de proteínas. Si la tasa de conversión es constante, hay que hacer una gran deducción. Por lo tanto, hacemos esta suposición a pesar de que la tasa de conversión varía de ≈20 aa / seg en E. coli a una tasa de crecimiento rápida hasta más cerca de ≈10 aa / seg bajo un crecimiento lento (BNID 100059). Piense en un volumen celular dado en el citoplasma. Independientemente del tiempo de duplicación, los ribosomas en este volumen deben producir la masa total de proteínas en el volumen dentro de un ciclo celular. Si el ciclo celular se vuelve, digamos, tres veces más corto, la concentración de ribosoma necesaria debe ser tres veces mayor para completar la tarea. Esto supone tácitamente que la velocidad de polimerización es constante, que la degradación de la proteína activa es insignificante y que el contenido total de proteína no cambia con la velocidad de crecimiento. Esta es la lógica que sustenta la predicción de que la fracción ribosómica es proporcional a la tasa de crecimiento. Dicho de otra manera, a medida que el tiempo de duplicación se acorta, se predice que la fracción ribosómica requerida aumentará de manera que la fracción ribosómica multiplicada por el tiempo de duplicación sea una constante que refleje la concentración total de proteoma. El análisis también sugiere que la tasa de síntesis se escala como la tasa de crecimiento al cuadrado, porque el tiempo para alcanzar la concentración de ribosoma requerida se vuelve más corto en proporción con el tiempo de duplicación. ¿Qué tan bien encaja este modelo de juguete con las observaciones experimentales?

Figura 3: Tomografía crioelectrónica del diminuto Spiroplasma melliferum. Utilizando algoritmos para el reconocimiento y la clasificación de patrones, se localizaron y contaron componentes de la célula, como los ribosomas. (A) Imagen de microscopía crioelectrónica única. (B) Reconstrucción 3D que muestra los ribosomas que se identificaron. Los ribosomas marcados en verde se identificaron con alta fidelidad, mientras que los marcados en amarillo se identificaron con fidelidad intermedia. (C) Vista de cerca de parte de la celda. Adaptado de J. O. Ortiz et al., Journal of Structural Biology 156: 334, 2006.

Como se muestra en la columna derecha de la Tabla 1 y en la Figura 2, la relación entre la fracción de ribosoma y la tasa de crecimiento es relativamente constante para las tasas de crecimiento más rápidas en el rango de 24-40 minutos como lo predice el modelo simple anterior y la relación no es constante a tasas de crecimiento lentas. De hecho, a tasas de crecimiento más lentas, se sugiere que la tasa de ribosomas sea más lenta (BNID 100059). Los modelos más avanzados (por ejemplo, M. Scott et al., Science, 330: 1099, 2010) consideran diferentes constituyentes de las células (por ejemplo, una fracción de proteína que es independiente de la tasa de crecimiento, una fracción relacionada con los ribosomas y una fracción relacionada a la calidad del medio de crecimiento) que dan como resultado predicciones más matizadas que se ajustan a los datos en un rango más amplio de condiciones. Estos modelos son un gran paso hacia la respuesta a la pregunta básica de qué gobierna las tasas máximas de crecimiento de las células.

Figura 4: recuento y localización de ribosomas dentro de las células mediante microscopía de molécula única. (A) Dos ribosomas identificados a partir de la imagen de superresolución completa que se muestra a continuación. (B) Distribución de intensidad de una sola molécula. (C) Número de ribosomas en función del volumen celular. (Adaptado de S. Bakshi et al, Molecular Microbiology 85:21, 2012.)

Tradicionalmente, la medición del número de ribosomas por célula se basaba en separar los ribosomas del resto de constituyentes celulares, midiendo qué fracción de la masa total proviene de estos ribosomas y luego con factores de conversión basados ​​en estimaciones de tamaño y masa celular, ribosoma molecular peso, etc. infiriendo la abundancia por celda. Recientemente, está disponible un enfoque más directo basado en el recuento explícito de ribosomas individuales. En la microscopía crioelectrónica, las células congeladas rápidamente se visualizan desde muchos ángulos para crear lo que se conoce como un mapa tomográfico 3D de la célula. La estructura conocida del ribosoma se usa luego como una plantilla que se puede buscar en el tomograma celular completo. Esta técnica se aplicó al pequeño procariota en forma de espiral. Spiroplasma melliferum. Como se muestra en la Figura 3, en esta pequeña celda, 10-100 veces más pequeña que E. coli por volumen (BNID 108949, 108951) y de crecimiento más lento, los investigadores contaron en promedio 1000 ribosomas por célula (BNID 108945). Se han realizado esfuerzos de recuento directo similares utilizando las técnicas de superresolución que han impactado la microscopía de fluorescencia como se muestra en la Figura 4, donde se realizó un recuento de los ribosomas en E. coli. En la Figura 5 se hace una comparación de los resultados de estos dos métodos, donde se hace una estimación simple de la densidad ribosómica a partir de las imágenes de microscopía crioelectrónica y luego esta densidad se escala hasta un valor completo. E. coli volumen, demostrando una coherencia alentadora entre los diferentes métodos.

Figura 5: Estimación del reverso de la envoltura sobre cuántos ribosomas hay en un volumen celular.


Ciencia sin gravedad en la Estación Espacial Internacional

Se han llevado a cabo más de 3000 pruebas científicas de este tipo en la ISS desde que comenzaron las misiones tripuladas en 2000.

En dos décadas orbitando la Tierra, la Estación Espacial Internacional se ha convertido en un laboratorio cósmico de vanguardia, con astronautas que investigan todo, desde agujeros negros hasta enfermedades e incluso jardinería en microgravedad.

La ISS, que orbita a unas 250 millas sobre la Tierra, es tan grande como un campo de fútbol en el interior y está dividida como una colmena en espacios donde la tripulación puede llevar a cabo experimentos con la guía de investigadores en tierra.

A menudo, los astronautas también son conejillos de indias.

Se han realizado más de 3.000 pruebas científicas en la ISS desde que comenzaron sus misiones tripuladas en 2000.

"Desde una perspectiva científica, ha habido algunos descubrimientos importantes", dijo Robert Pearlman, historiador espacial y coautor de "Estaciones espaciales: el arte, la ciencia y la realidad de trabajar en el espacio".

La última misión, llamada "Alpha" en honor a Alpha Centauri, el sistema estelar más cercano al nuestro, no será una excepción.

El jueves, los astronautas estadounidenses Shane Kimbrough y Megan McArthur, Akihiko Hoshide de la Agencia de Exploración Aeroespacial de Japón y Thomas Pesquet de la Agencia Espacial Europea despegarán hacia la ISS a bordo de la misión SpaceX Crew-2.

Es probable que estén ocupados.

Además del trabajo para mantener la propia estación espacial, alrededor de un centenar de experimentos están en el diario de su misión de seis meses.

La nueva tripulación (de izquierda a derecha): el astronauta de la Agencia Espacial Europea Thomas Pesquet, Megan McArthur y Shane Kimbrough de la NASA y Akihiko Hoshide de la Agencia de Exploración Aeroespacial de Japón

Estos incluyen una técnica acústica que utiliza ondas ultrasónicas para mover y manipular objetos o líquidos sin tocarlos.

Pesquet, de Francia, ha dicho que su investigación planificada favorita es un estudio que examina los efectos de la ingravidez en los organoides cerebrales: mini cerebros creados con tecnología de células madre.

Los científicos esperan que esta investigación pueda eventualmente ayudar a las agencias espaciales a prepararse para misiones espaciales distantes que expondrán a las tripulaciones a los rigores del espacio durante largos períodos de tiempo e incluso ayudarán a combatir las enfermedades cerebrales en la Tierra.

"Realmente me suena a ciencia ficción", bromeó Pesquet, un ingeniero aeroespacial.

Existe una investigación en curso sobre lo que se conoce como "chips de tejido", pequeños modelos de órganos humanos que están formados por diferentes tipos de células y que se utilizan para estudiar aspectos como el envejecimiento del sistema inmunológico, la función renal y la pérdida de masa muscular.

"No entendemos completamente por qué, pero en microgravedad, la comunicación de célula a célula funciona de manera diferente a como lo hace en un matraz de cultivo celular en la Tierra", dijo Liz Warren, directora senior de programas en el Laboratorio Nacional de EE. UU. De la ISS, agregando células también reunirse de manera diferente.

"Estas características permiten que las células se comporten más como lo hacen cuando están dentro del cuerpo. Por lo tanto, la microgravedad parece brindar una oportunidad única para la ingeniería de tejidos".

Otro elemento importante de la misión es actualizar el sistema de energía solar de la estación mediante la instalación de nuevos paneles compactos que se abren como una enorme estera de yoga.

El día de lanzamiento de Crew-2 coincide con el Día de la Tierra, y cuando la tripulación regrese, también habrán contribuido a la investigación ambiental al tomar 1,5 millones de imágenes de fenómenos como la iluminación artificial por la noche, la proliferación de algas y la ruptura de las plataformas de hielo de la Antártida.

La ISS ofrece nuevas perspectivas tanto en la Tierra como en el Espacio

Evolución experimental

Los experimentos están diseñados para el largo plazo, más allá de las misiones individuales, dijo Sebastien Barde de Cadmos de Francia, que organiza experimentos científicos de microgravedad en el espacio.

El estudio de la ingravidez, o microgravedad, ha pasado de ser "pionero a algo estandarizado", con métodos de medición cada vez más precisos, dijo Barde.

"Hace veinte años, no había una máquina de ultrasonido a bordo", agregó.

Claudie Haignere, la primera mujer francesa en volar al espacio, visitó la ISS en 2001 y la recuerda como bastante "mal equipada".

Ahora dice que cuenta con "laboratorios excepcionales".

Los astronautas también permanecen más tiempo (seis meses, frente a quince días para los primeros vuelos tripulados), lo que da a los investigadores más tiempo para medir los efectos de la microgravedad en ellos.

El vuelo espacial cambia el cuerpo humano.

Gráfico de la Estación Espacial Internacional (ISS).

Debilita los músculos y los huesos y afecta el corazón y los vasos sanguíneos. Algunos de los efectos se asemejan a una progresión acelerada del envejecimiento y las enfermedades en la Tierra.

Si bien son conejillos de indias para esta investigación, la tripulación de la ISS también ha recopilado datos sobre agujeros negros, púlsares y partículas cósmicas para ayudar a expandir nuestra comprensión del Universo.

Con la capacidad de cultivar alimentos complementarios que se considera un paso importante para ayudar a los humanos a adentrarse más en el espacio, incluso han realizado algunas labores de jardinería experimental.

En 2015, los astronautas probaron su primera ensalada cultivada en el espacio y desde entonces han intentado cultivar rábanos.

Pearlman dijo que los descubrimientos van desde los relacionados con la salud humana, como un tratamiento para la salmonela, hasta la ingeniería experimental.

"Una tecnología muy prometedora en este momento que está a punto de suceder es la impresión 3D de partes del cuerpo", dijo.

Algunos han expresado su preocupación por el costo de la ISS, mientras que la propia NASA está tratando de desconectarse a medida que su atención se desplaza hacia el espacio más profundo.

Pero Barde dijo que la estación espacial, programada para retirarse en 2028, es la única plataforma para que algunos científicos continúen su investigación, ya sea en medicina o ciencias de los materiales que necesitan un entorno sin gravedad.

Descartó la idea de que hemos aprendido todo lo que necesitamos saber: "¡Es como preguntarse si realmente necesita agrandar un telescopio, porque ha visto 'suficientes' estrellas!"


Quizás tengas un título en biología, pero no estás seguro de si trabajar en un campo relacionado con la ciencia o la biología es la opción correcta para ti. En este caso, es posible que deba vender sus habilidades y experiencias a empleadores que se preocupan poco por la interacción de las especies animales o la interacción del cuerpo humano. Afortunadamente, aún puede vender sus habilidades útiles a muchos empleadores.

Durante las entrevistas, es importante centrarse en muchos de los proyectos específicos en los que trabajó, citando ejemplos de resolución de problemas, liderazgo, trabajo en grupo o cualquier otra habilidad que pueda aplicarse a la carrera. Analice su comprensión de la investigación, el análisis de datos y otras habilidades que lo convirtieron en un estudiante exitoso de biología y será más atractivo para más clientes.


El efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción

Como regla general, un aumento de temperatura de 10 ° C duplica la velocidad de reacción. ¿Por qué el aumento de la temperatura podría alterar la velocidad de una reacción química?

Si está pensando que es porque las moléculas involucradas se mueven más rápidamente cuando la temperatura es más alta, está en el camino correcto. La temperatura es en realidad una medida de la energía cinética promedio de las moléculas en movimiento.

Las moléculas en movimiento tienden a permanecer en movimiento hasta que encuentran una fuerza externa, y cuando se mezclan diferentes moléculas reactivas, tienen poco con lo que chocar una al lado de la otra.

Cuando aumenta la temperatura, aumenta la cantidad de colisiones atómicas o moleculares entre moléculas. Pero el cambio en la velocidad de reacción con la temperatura no es solo una función de la temperatura, sino que los aumentos de temperatura en realidad afectan las constantes de velocidad (escritas k) de las reacciones de una manera predecible.


5 tipos de glóbulos blancos y sus funciones

Los glóbulos blancos también se conocen como glóbulos blancos o leucocitos. Son las células que componen la mayor parte del sistema inmunológico, que es la parte del cuerpo que se protege contra sustancias extrañas y varios tipos de infecciones. Los leucocitos se producen en la médula ósea a partir de células multipotentes llamadas células madre hematopoyéticas. Los leucocitos existen en todas las partes del cuerpo, incluido el tejido conectivo, el sistema linfático y el torrente sanguíneo. Hay cinco tipos diferentes de glóbulos blancos, cada uno de los cuales tiene funciones diferentes en el sistema inmunológico.

Cinco tipos de glóbulos blancos y sus funciones

Hay dos tipos diferentes de glóbulos blancos y cada uno se ve diferente entre sí bajo el microscopio. Estos incluyen granulocitos y agranulocitos.

  • Granulocitos tienen gránulos o granos visibles dentro de las células que tienen diferentes funciones celulares. Los tipos de granulocitos incluyen basófilos, neutrófilos y eosinófilos.
  • Agranulocitos están libres de granos visibles al microscopio e incluyen linfocitos y monocitos.

Juntos, se coordinan entre sí para combatir cosas como el cáncer, el daño celular y las enfermedades infecciosas. A continuación, se discutirá información detallada sobre cada tipo.

1. Neutrófilos

Los neutrófilos son el tipo más común de glóbulos blancos en el cuerpo con niveles de entre 2000 y 7500 células por mm 3 en el torrente sanguíneo. Los neutrófilos son glóbulos blancos de tamaño mediano con núcleos irregulares y muchos gránulos que realizan diversas funciones dentro de la célula.

Función: Los neutrófilos funcionan adhiriéndose a las paredes de los vasos sanguíneos, bloqueando el paso de los gérmenes que intentan acceder a la sangre a través de un corte o un área infecciosa. Los neutrófilos son las primeras células en llegar a un área donde se ha abierto una brecha en el cuerpo. Matan a los gérmenes por medio de un proceso conocido como fagocitosis o "comer células". Además de comer las bacterias una por una, también liberan una ráfaga de superóxidos que tienen la capacidad de matar muchas bacterias al mismo tiempo.

2. Linfocitos

Los linfocitos son células pequeñas y redondas que tienen un núcleo grande dentro de una pequeña cantidad de citoplasma. Tienen una función importante en el sistema inmunológico, siendo actores importantes en el sistema inmunológico humoral, que es la parte del sistema inmunológico que se relaciona con la producción de anticuerpos. Los linfocitos tienden a establecerse en los tejidos linfáticos, incluidos el bazo, las amígdalas y los ganglios linfáticos. Hay alrededor de 1300 a 4000 linfocitos por mm 3 de sangre.

Función: Los linfocitos B producen anticuerpos, que es uno de los pasos finales en la resistencia a las enfermedades. Cuando los linfocitos B producen anticuerpos, preparan a los patógenos para su destrucción y luego preparan las células de memoria que pueden entrar en acción en cualquier momento, recordando una infección previa con un patógeno específico. Los linfocitos T son otro tipo de linfocitos, diferenciados en el timo e importantes en la inmunidad mediada por células.

3. Monocitos

Los monocitos son los más grandes de los tipos de glóbulos blancos. Solo hay alrededor de 200-800 monocitos por mm 3 de sangre. Los monocitos son agranulocitos, lo que significa que tienen pocos gránulos en el citoplasma cuando se ven bajo el microscopio. Los monocitos se convierten en macrófagos cuando salen del torrente sanguíneo.

Función: Como macrófagos, los monocitos hacen el trabajo de fagocitosis (comer células) de cualquier tipo de célula muerta en el cuerpo, ya sea una célula somática o un neutrófilo muerto. Debido a su gran tamaño, tienen la capacidad de digerir grandes partículas extrañas en una herida a diferencia de otros tipos de glóbulos blancos.

4. Eosinófilos

No hay tantos eosinófilos en el torrente sanguíneo y, sinceramente, alrededor de 40-400 células por mm 3 de sangre. Tienen grandes gránulos que ayudan en las funciones celulares. Los eosinófilos son especialmente importantes cuando se trata de alergias e infestaciones de gusanos.

Función: Los eosinófilos funcionan liberando toxinas de sus gránulos para matar patógenos. Los principales patógenos contra los que actúan los eosinófilos son los parásitos y los gusanos. Los recuentos altos de eosinófilos se asocian con reacciones alérgicas.

5. Basófilos

Los basófilos son el tipo de glóbulo blanco menos frecuente, con solo 0-100 células por mm 3 de sangre. Los basófilos tienen gránulos grandes que realizan funciones que no se conocen bien. Son muy coloridos cuando se tiñen y se miran bajo el microscopio, lo que los hace fáciles de identificar.

Función: Los basófilos tienen la capacidad de secretar anticoagulantes y anticuerpos que tienen función contra las reacciones de hipersensibilidad en el torrente sanguíneo. Actúan inmediatamente como parte de la acción del sistema inmunológico y rsquos contra invasores extranjeros. Los basófilos contienen histamina, que dilata los vasos para llevar más células inmunitarias al área de la lesión.

También puede conocer los tipos de glóbulos blancos con mayor detalle en el video a continuación:

Controle su recuento de glóbulos blancos

Su médico controlará su recuento de glóbulos blancos si hay evidencia de infección o si está tomando medicamentos que pueden reducir su recuento de glóbulos blancos. Si tiene un recuento anormal de glóbulos blancos, puede tener & ldquoleucopenia & rdquo, lo que significa un recuento bajo de glóbulos blancos, o & ldquoleucocytosis & rdquo, que es un recuento alto de glóbulos blancos.

Leucopenia es un recuento bajo de glóbulos blancos que puede ser causado por daño a la médula ósea por cosas como medicamentos, radiación o quimioterapia. La deficiencia de folato o vitamina B12 también puede provocarlo. Lo mismo ocurre con el linfoma, en el que las células cancerosas se apoderan de la médula ósea y evitan la liberación de los distintos tipos de glóbulos blancos. El VIH es otra afección que puede dañar la producción de glóbulos blancos y provocar leucopenia.

Leucocitosis es un recuento alto de glóbulos blancos que puede ser causado por una serie de afecciones, que incluyen varios tipos de infecciones, enfermedades inflamatorias en su cuerpo, situaciones en las que hay una gran cantidad de células muertas en el cuerpo, leucemia y alergias.


Concentraciones de parabenos en tumores de mama humanos

Los parabenos se utilizan como conservantes en muchos miles de productos cosméticos, alimentarios y farmacéuticos a los que está expuesta la población humana. Aunque los informes recientes sobre las propiedades estrogénicas de los parabenos han desafiado los conceptos actuales de su toxicidad en estos productos de consumo, la pregunta sigue siendo si alguno de los parabenos puede acumularse intacto en el cuerpo a partir de los niveles de dosis bajas a largo plazo a los que se llega a los humanos. están expuestos. Los estudios iniciales que se informan aquí muestran que los parabenos pueden extraerse del tejido mamario humano y detectarse mediante cromatografía de capa fina. Estudios más detallados permitieron identificar y medir las concentraciones medias de parabenos individuales en muestras de 20 tumores de mama humanos mediante cromatografía líquida de alta presión seguida de espectrometría de masas en tándem. Se encontró que la concentración media de parabenos en estos 20 tumores de mama humanos era de 20,6 ± 4,2 ng g -1 de tejido. La comparación de parabenos individuales mostró que el metilparabeno estaba presente en el nivel más alto (con un valor medio de 12,8 ± 2,2 ng g -1 de tejido) y representa el 62% del parabeno total recuperado en las extracciones. Estos estudios demuestran que los parabenos se pueden encontrar intactos en la mama humana y esto debería abrir el camino técnicamente para obtener información más detallada sobre las cargas corporales de los parabenos y, en particular, si las cargas corporales en el cáncer son diferentes a las de los tejidos normales. Copyright © 2004 John Wiley & Sons, Ltd.


Evaluación de sistemas de cultivo de células epiteliales bronquiales humanas diferenciadas para la investigación del asma

El objetivo del presente estudio fue evaluar sistemas de cultivo de células epiteliales bronquiales primarios (células epiteliales bronquiales humanas, HBEC) y no primarios (Calu-3, BEAS-2B, BEAS-2B R1) como interfaz aire-líquido- (ALI- ) modelos diferenciados para la investigación del asma. Capacidad para diferenciarse en copa (MUC5AC +) y ciliada (

-Tubulina IV +) las células se evaluaron mediante imágenes confocales y qPCR. Se evaluó la expresión de proteínas de unión / adhesión estrecha (ZO-1, E-Cadherin) y el desarrollo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER). Las células primarias mostraron MUC5AC, -Tubulina IV, ZO-1 y E-Cadherina localizadas y desarrollaron TEER con, sin embargo, un gran grado de variación entre donantes e intradonantes. Las células Calu-3 desarrollaron un TEER más reproducible y un fenotipo similar al de las células primarias, aunque con tinción difusa con -Tubulina IV. Las células BEAS-2B no se diferenciaron ni desarrollaron uniones estrechas. Estos datos destacan los desafíos al trabajar con modelos de células primarias y la necesidad de una caracterización y selección cuidadosas de sistemas para responder preguntas de investigación específicas.

1. Introducción

El asma es una enfermedad respiratoria crónica caracterizada por exacerbaciones recurrentes [1]. A feature of asthma (especially severe asthma) is airway remodelling, that is, increased smooth muscle mass, fibrosis, and excessive mucus production [2]. The epithelium plays a key role in the development of airway remodelling and inflammation as it represents the primary barrier to environmental exposures and also signals to other cell types within the context of the epithelial mesenchymal trophic unit [3, 4].

In vitro models using primary cells and cell lines are essential for understanding the function of the epithelium relevant to asthma. Cells are routinely cultured in submerged monolayers on a plastic substrate. In order to obtain a more physiological model, primary human bronchial epithelial cells (HBECs) may be cultured at air-liquid interface (ALI) using defined medium to drive a differentiated phenotype [5]. This model shows a pseudostratified, polarised phenotype, including ciliated and goblet cells and develops high transepithelial electrical resistance (TEER) [6, 7]. Measurement of TEER provides an indirect measure of formation of tight junctions and is often used as a marker of disruption of the epithelial layer [8].

Cultured primary HBECs from asthma and non-asthma subjects have been compared in a number of studies, to investigate intrinsic differences in the asthmatic epithelium. Epithelial cells from asthmatic patients display differential expression of genes associated with inflammation, repair, and remodelling and have been shown to differ from normal cells in culture, including increased proliferation [9] and slower repair of a mechanical wound [10, 11]. Several groups have cultured asthmatic epithelial cells at ALI, showing a less differentiated phenotype, that is, increased numbers of basal cells [12] or decreased tight junction formation [13], and differing responses to stimulation including viral infection, mechanical wounding, and cigarette smoke [12–14]. There has been some debate regarding reported differences between normal and asthmatic cells. For instance, Hackett et al. [12] report no difference in TEER between normal and asthmatic cultures, whilst Xiao and colleagues suggest that cells from asthmatic subjects show decreased TEER and disrupted tight junctions [13]. These discrepancies may reflect differences in donor profile (donors were significantly older in the Xiao study), cell source (post mortem donor lungs versus bronchial brushings), or the much greater number of subjects included in the Xiao study. Paediatric asthmatic HBECs in monolayer culture show slower repair of a mechanical wound [10, 11]. At ALI, HBECs from asthma donors show increased cytokine release in response to mechanical wounding, or viral or particulate matter exposure [12], and are more sensitive to disruption of TEER by cigarette smoke extract [13]. Another study found that whilst HBECs from normal donors showed an increased rate of wound repair in response to IL-1β treatment, asthmatic cells did not show this response [14]. These results may suggest that asthmatic cells at ALI have an intrinsically different phenotype and show different signalling responses to normal cells and support the utility of epithelial cell culture in asthma research.

Direct comparisons of normal and asthmatic cells allow characterisation of the asthmatic phenotype however, they are less helpful when trying to dissect the underlying mechanisms behind epithelial changes in asthma. Normal primary bronchial epithelial cells and cell lines may be used to model various aspects of asthma. Cytokines may be added to cells in monolayer or ALI culture [15–17], whilst asthma triggers such as Derp1 or rhinovirus have been applied to the cells to mimic allergen inhalation or viral exacerbation [18, 19]. Danahay et al. treated ALI HBECs with IL-13 or IL-4, resulting in changes in permeability, suggesting that these asthma-related cytokines may contribute to a more secretory phenotype [15], whilst Wadsworth and colleagues found that addition of IL-13 and other

cytokines led to increased MMP7 and FasL release, which may lead to epithelial damage and inflammation [16]. In another study, HBEC or BEAS-2B cells at ALI were treated with leukotriene D4, resulting in signalling via EGFR and release of IL-8 [17]. Overall these data demonstrate that the use of HBEC and cell line cultures can provide a unique insight into mechanisms underlying asthma and it is important to understand the strengths and weaknesses of these culture systems.

Accumulating data suggest that bronchial epithelial cells may be a viable drug target in asthma [20]. Cell culture models are used in drug development, both to assess the direct effect of potential drugs on cell function and signalling and to investigate drug uptake and metabolism [21]. Although primary cells are the gold standard, there are some disadvantages to their use including cost, limited life span, and variability between donors, passage, or experiments. Primary cells may also be more difficult to transfect or otherwise manipulate. This has led to the use of cell line systems, in both monolayer culture and at ALI. The Calu-3 cell line was established from a pleural effusion of a lung adenocarcinoma, derived from submucosal gland serous cells [22–24]. It is often used at ALI as a model system, particularly for investigations of tight junction and barrier formation [23], for instance, showing that rhinovirus infection leads to decreased TEER and increased permeability [19]. The BEAS-2B cell line, originally developed by immortalization of normal human bronchial epithelial cells using AD12-SV40 virus [25], has been less frequently used at ALI however there is some literature using BEAS-2B in this system [17, 26]. Although these cells have been separately characterised by techniques such as immunofluorescence and TEER, no systematic comparison of primary cell and cell line culture models in this system has been reported.

The aim of the current study was to evaluate primary and non-primary bronchial epithelial cell culture systems as (ALI-) differentiated models for asthma research. We cultured primary HBECs from two donors, Calu-3, BEAS-2B, and BEAS-2B R1 (a subclone of BEAS-2B, cultured in the presence of foetal calf serum (FCS)) in their respective media at ALI. Development of TEER was measured over 28 days, RNA was collected at days 7, 14, and 21, and immunofluorescence was performed at day 28. We measured expression of a panel of differentiation (β-Tubulin IV, a ciliated cell marker, and MUC5AC, a goblet cell marker [27]) and tight junction/adhesion (E-Cadherin and ZO-1) markers by real-time quantitative PCR (qPCR) and confocal imaging to allow direct comparison of the phenotype of these different cell systems.

We show that although primary cells develop a differentiated phenotype, their TEER is highly variable, confirming the need to use multiple experiments and donors in primary cell systems. Calu-3 cells showed high TEER and similar expression of markers compared to primary cells, suggesting that these cells may be the most suitable model cell line for ALI experiments. Our work (1) indicates that all model systems, including primary cells, should be validated to ensure that the most suitable model is being used for a specific research question and (2) highlights the difficulties in utilising primary cells in epithelial cell research.

2. Materiales y métodos

2.1. Cell Culture and ALI Differentiation

Human bronchial epithelial cells (NHBEC, Lonza, Wokingham, UK) were expanded in growth factor-supplemented medium (BEGM, Lonza) and differentiated at (ALI) at passage 3-4 in differentiation medium (BEDM) according to a previously published method [15, 28]. BEDM was composed of 50 : 50 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma) : BEBM (Lonza) with Lonza singlequots, excluding triiodo-L-thyronine and retinoic acid, but including GA-1000 (Gentamicin and Amphotericin-B). BEDM was supplemented with 50 nM retinoic acid at time of use. All experiments were performed using a single lot of BEBM and singlequots to avoid batch variation. Medium was used within one month of preparation, as recommended by Lonza.

Calu-3 lung adenocarcinoma cells [22] (obtained from ATCC) were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) (Sigma) supplemented with 10% FCS, 1% MEM non-essential amino acid solution (Sigma), and 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma). BEAS-2B [25], a transformed bronchial epithelial cell line (gift from Dr R. Clothier, University of Nottingham), was cultured in BEGM and differentiated at ALI in BEDM. BEAS-2B R1 [29] (a subclone of BEAS-2B) (gift from Dr. R. Penn, University of Maryland, Philadelphia, PA) was cultured in DMEM supplemented with 10% FCS and 1% Penicillin/Streptomycin. All cells were cultured on 12 mm polyester Transwell inserts with a pore size of 0.4 μm (Corning NY, USA). Cells were plated at 100,000 cells per insert in appropriate medium. When confluent (

3 days), cells were raised to ALI. Medium was replaced and the apical face washed with phosphate-buffered saline (PBS) every 48 hours. RNA was extracted after 7, 14, and 21 days at ALI and cells were fixed for immunostaining after 28 days at ALI.

2.2. Transepithelial Electrical Resistance (TEER)

The transepithelial electrical resistance (TEER) was measured in differentiating cells using an EVOM2 epithelial volt-ohm meter (World precision Instruments UK, Stevenage), over 21 to 28 days at ALI to confirm development of tight junctions. Briefly, medium was aspirated and replaced with 1 mL in the basolateral and 0.5 mL in the apical compartment. Cultures were equilibrated in the incubator for 30 minutes before measurement of TEER. Apical medium was then aspirated to restore ALI. TEER of insert and medium alone was subtracted from measured TEER and Ω·cm 2 calculated by multiplying by the insert area.

2.3. Immunofluorescence of Cultured Cells

ALI cultured cells were fixed en el lugar on inserts and transferred to glass slides for visualisation. Cells were fixed using 4% formaldehyde and blocked/permeabilised with PBS, 10% goat serum, 1% BSA, and 0.15% Triton-X. Cells were incubated with appropriate primary antibodies at 4°C overnight (Table 1), and FITC or rhodamine-TRITC labelled secondary for 1 hour at room temperature before mounting in HardSet DAPI (Vector Labs). Controls were incubated with secondary antibody alone or primary isotype control antibody followed by secondary antibody. Cells were visualized using the Zeiss spinning disk confocal microscope using Volocity software (version 5.5, PerkinElmer, Cambridge, UK).

2.4. Quantitative PCR (qPCR)

Cultured cells were lysed and RNA was extracted using silica columns (RNeasy mini kit, Qiagen, Crawley, UK). cDNA was synthesized using Superscript II (Invitrogen, Paisley, UK) and random hexamer primers as per instructions. mRNA levels were quantified using a series of TaqMan assays (Table 2). Probes were labelled with FAM and TAMRA. qPCR was performed using TaqMan gene expression master mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) and HPRT1 (4310890E, Applied Biosystems) endogenous control on a Stratagene MxPro3005 machine using 40 cycles of 95°C 15 sec, 60°C 60 sec. Data were normalised using the housekeeper (HPRT1) and the

3. Resultados

3.1. Primary Epithelial Cells and Cell Lines Develop TEER When Cultured at ALI

Primary HBECs (2 donors) and cell lines were cultured at ALI and TEER measured every 2-3 days for 21–28 days (Figure 1, Table 3). All primary cell experiments were performed at passage 3-4 from different frozen vials. Experiments performed at passage three (two in Donor 1, one in Donor 2) developed TEER >350 Ω·cm 2 , whilst experiments performed at passage four developed TEER <150 Ω·cm 2 (Figures 1(a) and 1(b)). Calu-3 (passage 35–37) developed maximum TEER >400 Ω·cm 2 in all experiments, reaching a peak between days 9 and 12. Thereafter, values dropped slightly before reaching a more variable plateau (Figure 1(c)). BEAS-2B reached a maximum TEER of 100–150 Ω·cm 2 by around day 14 (Figure 1(d)), regardless of passage, whilst BEAS-2B R1 did not develop significant TEER (Figure 1(e)).


(a) HBEC D1
(b) HBEC D2
(c) Calu-3
(d) BEAS-2B
(e) BEAS-2B R1
(a) HBEC D1
(b) HBEC D2
(c) Calu-3
(d) BEAS-2B
(e) BEAS-2B R1 Development of transepithelial electrical resistance (TEER) in cells grown at (ALI). Different primary cells and cell lines were cultured at ALI over 21–28 days. TEER was measured every 2-3 days. Results from three separate experiments are shown for each cell line/donor, six replicates per experiment. HBEC D1 is Donor 1 and HBEC D2 is Donor 2. Error bars show standard deviation.
3.2. Primary Epithelial Cells and Cell Lines Show Morphological Differences

The different cells used in this study showed different phenotypes in culture. Phase contrast images give a limited indication of these differences however gross morphological differences are present (Figure 2). Calu-3 cells took longest to become fully confluent, probably due to their tendency to form discrete colonies, unlike the other cells which form a more even monolayer. HBECs showed darker areas of denser (probably more stratified) cells and lighter, less dense areas (Figures 2(a) and 2(b)). The Calu-3 cell phenotype was more homogenous (Figure 2(c)), with increased mucus secretion apparent on washing. BEAS-2B cells consistently developed an apical layer of material which was not removed by washing (Figure 2(d)). BEAS-2B R1 cells had a very homogenous appearance, with no indication of mucus production or differentiation (Figure 2(e)).


(a) HBEC D1
(b) HBEC D2
(c) Calu-3
(d) BEAS-2B
(e) BEAS-2B R1
(a) HBEC D1
(b) HBEC D2
(c) Calu-3
(d) BEAS-2B
(e) BEAS-2B R1 Phase contrast images of cells at ALI. Different primary cells and cell lines were cultured at ALI over 21–28 days. Phase contrast images were taken at 21 days. Representative images are from three independent experiments.
3.3. Primary Epithelial Cells and Cell Lines Express Characteristic Differentiation Markers

At 28 days, cells were fixed and immunostained with antibodies specific for β-Tubulin IV and MUC5AC (Figure 3, Table 3). A pesar de que β-Tubulin IV is often expressed as a cytoskeletal protein, apical expression is a commonly used marker of ciliated epithelial cells [27]. MUC5AC is expressed by goblet cells as a component of mucus. Single image slices and z-stacks are shown to give an indication of the overall level of expression and location in the cell layer (basal versus apical). As ALI culture thickness varied between cell types, the brightest image is shown in each case. These were representative of 2-3 experiments per donor or cell type. HBEC images shown for both donors are from experiments reaching low TEER however, β-Tubulin IV and MUC5AC expression did not seem to reflect TEER values (data not shown). HBECs presented apical β-Tubulin IV expression in a subset of cells with a greater proportion of cells from Donor 1 than Donor 2 showing expression. β-Tubulin IV expression was observed in Calu-3 layers but staining was only apparent below the apical pole of the cells. Strong staining for β-Tubulin IV was obtained at the apical side of BEAS-2B cells. BEAS-2B R1 showed apical staining in a subset of cells. While both HBEC donors and Calu-3 cells was stained positive for MUC5AC expression in a subset of cells towards the apical side of the cell layer, neither BEAS-2B subtypes showed significant MUC5AC staining.


Immunofluorescent confocal imaging of differentiation markers. Localisation patterns of β-Tubulin IV, MUC5AC, and the Mouse IgG Isotype control at 28 days ALI were evaluated as described in the methods section. Single Z-slices are shown representing maximum intensity observed, with the corresponding Z-stack image below for β-Tubulin IV and MUC5AC. Scale bar represents 50 μmetro. Representative images are from three independent experiments. HBEC images were taken from experiments with low TEER (Figure 1).
3.4. Primary Epithelial Cells and Cell Lines Express Tight Junction Proteins

Sections were costained for expression of ZO-1 (a tight junction protein) and E-Cadherin (a cell adhesion molecule and epithelial cell marker). Matched, single confocal slices and z-stacks are shown. The brightest image from each stack was chosen to allow comparison of maximum expression in each cell culture system (Figure 4, Table 3). Images are representative of 2-3 experiments per donor or cell type. Both HBEC donors showed strong staining for ZO-1 that was localised to cell membranes/cell-cell junctions. This staining may be stronger in Donor 1 (where TEER reached >350 Ω·cm 2 ) than Donor 2 (where low TEER <150 Ω·cm 2 was reached) however the difference in staining was slight, compared to the variation in TEER. Overall, ZO-1 staining was performed in five HBEC experiments and no correlation between staining and final TEER was observed (data not shown). ZO-1 expression was weaker in Calu-3 cells, despite their consistently high (>300 Ω·cm 2 ) TEER, although similarly localised around cell boundaries. In both BEAS-2B subtypes, ZO-1 expression was generally diffuse however, BEAS-2B cells showed membrane localised expression in the apical cell layer. Both BEAS-2B subtypes also showed high non-specific staining with the rabbit isotype control, suggesting that ZO-1 protein levels may be lower than they appeared. E-Cadherin expression was seen in all cells except BEAS-2B R1. In both HBEC donors and Calu-3, expression was tightly localised to the cell membrane/cell-cell junctions, whilst in BEAS-2B expression was more diffuse in the basal layer, but membrane was localised in the apical layer.


Immunofluorescent confocal imaging of tight junction proteins. Localisation patterns of ZO-1, E-Cadherin, and the Rabbit IgG Isotype control at 28 days ALI were evaluated as described in the methods section. Images shown are single Z-stack slices representing maximum intensity observed with the corresponding Z-stack image below and are of matched fields using dual staining. The corresponding Mouse Isotype control for E-Cadherin can be seen in Figure 3. Scale bar represents 50 μmetro. Representative images are from three independent experiments. Images for HBEC Donor 1 were taken from an experiment reaching high TEER (>350 Ω·cm 2 ), whilst Donor 2 images were taken from an experiment reaching low TEER (Figure 1).
3.5. Expression of Differentiation and Tight Junction Markers Varies at the mRNA Level

Cells were harvested for RNA at days 7, 14, and 21 during ALI differentiation and qPCR performed for MUC5AC, β-Tubulin IV, E-Cadherin, and ZO-1 (Figure 5, Table 3). Representative data from one of two experiments are shown. HBEC results were taken from experiments in which TEER reached >350 Ω·cm 2 (Donor 1) and low TEER (Donor 2), whilst in replicate experiments, TEER >350 Ω·cm 2 was reached in both donors. Expression levels of all genes were significantly different between cell types, although not between HBEC donors (

for all genes, 2-way ANOVA). These effects were conserved in a second independent experiment. Overall, no replicated trends in gene expression over time were observed.


(a) MUC5AC
(b) β-Tubulin IV
(c) E-Cadherin
(d) ZO-1
(a) MUC5AC
(b) β-Tubulin IV
(c) E-Cadherin
(d) ZO-1 mRNA expression of differentiation and tight junction markers. Primary cells and cell lines were cultured at ALI over 21–28 days. RNA was extracted at days 7, 14, and 21 during ALI differentiation for each cell line or donor. Expression of MUC5AC (a), β-Tubulin IV (b), E-Cadherin (c), and ZO-1 (d) was measured. Data are normalised to the housekeeping gene HPRT1. Data are representative of two independent experiments. Error bars show standard deviation. Yellow, red, and blue bars represent expression at days 7, 14, and 21 post-ALI, respectively.

MUC5AC mRNA was similar in HBEC and Calu-3 cells. Although expression of MUC5AC appears to increase at later time points in the experiment shown ( , ANOVA), this effect was not conserved in a second independent experiment. MUC5AC mRNA was not detected in the two BEAS-2B subtypes (Figure 5(a)), consistent with immunofluorescence results. β-Tubulin IV expression was highest in BEAS-2B R1>Calu-3>BEAS-2B>HBEC (Figure 5(b)). This is in contrast to the immunofluorescence data where staining was lowest in BEAS-2B R1. Expression of E-Cadherin was highest in HBEC>Calu-3 and BEAS-2B>BEAS-2B R1 (not detected) (Figure 5(c)), whereas immunofluorescence was similar in HBEC and Calu-3. ZO-1 expression (Figure 5(d)) was highest in HBEC>BEAS-2B and BEAS-2B R1>Calu-3.

4. Discusión

We have evaluated two primary human donors of bronchial epithelial cells and Calu-3, BEAS-2B, and BEAS-2B R1 cell culture systems as ALI models of the airway epithelium for asthma research. For the first time, cell lines were directly compared to primary cells (Table 3). Using measurement of TEER [8], immunofluorescent staining, and qPCR, we have investigated formation of tight junctions (ZO-1 and E-Cadherin) as well as expression and localisation of suggested markers of ciliated (β-Tubulin IV) and goblet (MUC5AC) cells [27]. The main outcomes of our study are that (1) primary HBECs demonstrate a variable differentiated phenotype with the development of tight junctions and TEER showing experiment, passage, and donor variation, (2) Calu-3 cells exhibit many of the features of primary cells but have distinct differences including, for example, ZO-1 expression, and β-Tubulin IV localisation, although data generated were more reproducible, and (3) as anticipated, the BEAS-2B cell lines have limited differentiation capacity in ALI models. These data have implications for the use of both primary cells and cell lines for airway epithelial research in asthma.

The use of primary HBECs in vitro has provided insight into the potential mechanisms underlying asthma. This is exemplified by the recent findings of Xiao and colleagues [13], demonstrating that asthmatic epithelial cells at ALI show disrupted tight junctions and increased macromolecular permeability, reflecting the ex vivo fenotipo. Another study by Hackett et al. observed an increased cytokine response to particulate matter, viral exposure, or mechanical wounding [12], demonstrating that asthmatic cells may show an aberrant inflammatory response to common environmental stimuli. Primary and cell line systems also play a role in dissecting the signalling networks involved in asthma. Normal HBECs at ALI treated with cytokines, for instance, show a potentially more secretory phenotype [15], whilst in HBEC or BEAS-2B cells, leukotriene D4 signals via EGFR to release IL-8 [17]. It is beyond doubt that these epithelial ALI culture systems show utility in asthma research therefore in the current study, we aimed to provide a direct comparison of a number of cell culture systems used in asthma research to help in selection of appropriate systems for specific research questions.

We measured expression of various proteins at the mRNA and protein levels as markers of differentiation. A pesar de que β-Tubulin IV is widely expressed in cultured cells, apical expression is often used to identify ciliated epithelial cells at ALI [27, 30], whilst MUC5AC is a mucus protein, expressed by goblet cells in the lung epithelium [31]. ZO-1 and E-Cadherin were included as markers of tight junction formation and barrier integrity. An alternative method of characterising ALI cultures is sectioning and performing histochemical analysis to confirm differentiation which gives a clearer indication of the multilayer structure (e.g. [12]). This study is limited by the use of immunofluorescence only however we can obtain an overview of the phenotypes of different systems using this method.

In this study, we found that mRNA expression was not tightly linked to immunostaining, particularly for β-Tubulin IV, where HBECs showed very low mRNA levels but high protein expression. This suggests that mRNA expression may not be a good marker of functional status for these genes. Differences between mRNA and protein levels may reflect experimental or biological issues [32, 33]. In our study, samples were taken for qPCR at days 7–21 and for immunofluorescence at day 28, a limitation which may partially explain these differences. Some variation in immunofluorescence between samples may reflect different protein localisation that is, diffuse faint staining may reflect similar amounts of protein to bright, localised staining. At the biological level, differences between mRNA and protein may reflect variation in posttranscriptional mechanisms between the cell types, such as mRNA stability or protein synthesis and turn-over.

When culturing primary cells at ALI, the choice of medium is very important, with different media delivering different degrees of stratification and cell phenotypes [5, 34]. We use “Gray’s medium” (BEDM), which is reported to allow development of a pseudostratified, polarised phenotype, including ciliated and goblet cells. This was confirmed in our hands, with localised expression of E-Cadherin, MUC5AC, and β-Tubulin IV observed in both primary cell donors. This model is reported to develop TEER [6, 7]. We found that development of TEER was variable. TEER >350 Ω·cm 2 was obtained in the three experiments performed at passage three, whilst TEER <150 Ω·cm 2 was obtained at passage four, despite consistent expression of ZO-1 mRNA and protein, localised to the cell membrane/cell-cell junctions. These observations reinforce the assumption that localised ZO-1 staining is not a surrogate marker for TEER and viceversa, as well as the importance of passage when using primary cells. The variation seen in this study between different experiments in a single donor is indicative of the potential issues when comparing normal versus asthma cells. Routinely, a single experiment is performed per donor [12, 13]. It is important that these experiments are performed with cells cultured for the same period of time and in the same batch of medium to minimise experimental variation.

The Calu-3 cell-line was established from a pleural effusion of a lung adenocarcinoma, derived from submucosal gland serous cells [22–24]. Calu-3 cells are routinely cultured in FCS-supplemented media [23] and spontaneously differentiate at ALI to give significant TEER [23, 35]. These cells are reported to express ZO-1 (a tight junction protein) and E-Cadherin (an epithelial marker and cell adhesion protein). We showed development of TEER >400 Ω·cm 2 and some expression of ZO-1 and E-Cadherin. Interestingly, although TEER was higher and more robust than in the primary HBECs, ZO-1 expression at both the mRNA and protein levels was lower, demonstrating that other tight junction proteins have a role to play in maintaining TEER. The cells expressed apical MUC5AC, as anticipated from their known secretory phenotype. However, staining for β-Tubulin IV expression was diffuse and not clearly located at the apical side, suggesting that villi or cilia had not formed in the Calu-3 model, in accordance with previous studies [23] that have shown that ciliated cells are sparse in the Calu-3 cell line.

The BEAS-2B cell line was originally developed by immortalization of normal human bronchial epithelial cells using AD12-SV40 virus [25]. This parental population of cells (as well as subclone S6, not used here) retains the ability to undergo squamous differentiation in response to TGFβ1 or serum [29]. The BEAS-2B R1 line was derived from the parental population by subculture in the presence of 5% FCS. Unlike the parental cell line, these cells are induced to proliferate by serum or TGFβ1 and have a more fusiform appearance [29]. BEAS-2B cells (S6 subclone, similar to the parental population) have previously been shown to attain TEER >100 Ω·cm 2 at higher passage, in KGM (keratinocyte growth medium, Clonetics) when supplemented with calcium [26], or when grown in BEGM [36] or Laboratory of Human Carcinogenesis (LHC) serum-free medium [37]. We used BEDM to drive BEAS-2B towards a differentiated phenotype. These cells attained the reported TEER of >100 Ω·cm 2 . At ALI, these cells developed an apical layer which stained strongly for β-Tubulin IV and showed localised ZO-1 and E-Cadherin staining. However, staining was fainter and more diffuse in the basal layer. It may be the presence of this apical layer that increases the TEER, rather than tight junction formation throughout the culture model. These cells did not express MUC5AC.

There is no literature regarding the use of the BEAS-2B R1 cell line at ALI therefore these cells were included essentially as a negative control, cultured in DMEM with 10% FCS. As anticipated, these cells did not develop TEER and expressed minimal levels of E-Cadherin at the RNA and protein level. The cells show apical β-Tubulin IV expression, but no MUC5AC or localised ZO-1 expression. The reduced E-Cadherin expression of this cell line suggests that they may have developed a more mesenchymal phenotype by culturing in the presence of FCS.

5. Conclusiones

Normal and asthmatic primary bronchial epithelial cells and cell lines are widely used in asthma research. ALI models are used to attempt to more closely replicate the en vivo situación. We have evaluated primary bronchial epithelial cells from two donors and three cell lines in an ALI model with respect to various markers of differentiation. Although primary cells are regarded as the most physiologically relevant, they exhibit a high degree of variability between donors, experiments, and passage, particularly with respect to development of TEER. Primary cells are costly and therefore unsuitable for large scale experiments such as drug screening they also have a finite lifespan and may be difficult to manipulate. Cell lines may, therefore, present an attractive alternative model. We found that Calu-3 cells develop a high TEER and have a pattern of expression of epithelial markers similar to primary cells. Although frequently used in monolayer culture, the two BEAS-2B cell lines did not perform well in the ALI model, showing poor TEER and lacking expression of epithelial differentiation markers.

This work underlines the importance of using a well-characterised model, suitably validated for the outcomes of interest in any experiment. Importantly, this study highlights some of the challenges ahead characterising primary human airway epithelial cells from asthma and control donors accounting for the inter- and intradonor variability identified in the current study.

Expresiones de gratitud

This work was funded by Asthma UK Grants 08/017 and 10/006 to Ian Sayers. C. E. Stewart and E. E. Torr equally contributed to the paper.

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