Información

¿Por qué las construcciones que atrapan genes deben integrarse en intrones y no en exones?

¿Por qué las construcciones que atrapan genes deben integrarse en intrones y no en exones?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pregunta de tarea:

En la captura de potenciadores, los transgenes informadores se integran aleatoriamente en el genoma de la mosca y su expresión identifica potenciadores y, por lo tanto, genes expresados ​​en patrones particulares. En ratones, se emplea una técnica similar para la identificación de genes llamada "captura de genes". En el atrapamiento de genes, un exón que codifica una proteína informadora como GFP (ver más abajo) se integra en ubicaciones aleatorias en los cromosomas de células ME (cuando se introducen construcciones de ADN en células ME de ratón, la mayoría de los eventos de recombinación ocurren en sitios aleatorios; la recombinación homóloga es relativamente rara ). Se utilizan líneas de células ES con transgenes integrados aleatoriamente para generar ratones.

¿En qué parte del genoma debe integrarse una construcción de captura de genes para que las células madre embrionarias expresen GFP?

Respuesta:

Mi pregunta:

¿Por qué no se puede simplemente introducir el constructo en la secuencia de ADN codificante del genoma del ratón? Por que lo hace tengo para integrarse en un intrón?


No se que ellos debe integrar en un intrón. Parece perfectamente razonable que también puedan integrarse en un exón, siempre que el reportero esté dentro del marco. Obviamente, hay un elemento de azar en eso, por lo que la ventaja de la integración dentro de un intrón es que el empalme asegurará que el reportero se traduzca correctamente. Las regiones intragénicas también son más abundantes en el genoma y, por lo tanto, la inserción es más probable. Discuten la ventaja de este diseño en el documento original:

Gossler A, Joyner AL, Rossant J, Skarnes WC. 1989. Células madre embrionarias de ratón y construcciones informadoras para detectar genes regulados por el desarrollo. Science 244: 463-465.

... Las células madre embrionarias permiten la selección de eventos de integración poco frecuentes, lo que nos permitió ... diseñar y usar un vector de "trampa de genes". El vector contiene el gen lacZ, que carece de un promotor y de una señal de iniciación de la traducción, insertado en marco en el exón homeobox del gen En-2 de manera que se coloca un aceptor de corte y empalme en el extremo 5 'de lacZ. La integración de la construcción en intrones de genes en la orientación correcta debería crear un transcrito de fusión lacZ empalmado y una proteína de fusión funcional cuando se mantiene el marco de lectura. La evidencia de esto provino de experimentos en los que una construcción que carece del aceptor de empalme 5 'En-2 produjo 12 veces menos transformantes que expresan lacZ que la construcción que lleva el aceptor de empalme.

Se han informado inserciones exonales por trampas de genes:

Song G, Li Q, Long Y, Gu Q, Hackett PB, Cui Z. 2012. Captura genética efectiva mediada por Bella Durmiente Transposon. PLS One 7.

La inserción de un casete de captura en un exón o un intrón de loci activos transcripcionales puede generar una transcripción de fusión que contiene el exón cadena arriba y el indicador / marcador seleccionable.

Se obtuvieron dieciocho eventos de transposición de distintas colonias de células. La explosión del genoma humano en la base de datos NCBI y ENSEMBL ... indicó que diecisiete de ellos aterrizaron en un intrón y uno de ellos se integró en un exón en loci genómicos activos. Estos datos concuerdan con el hecho de que los exones y los intrones comprenden el 1,5% y el 24% del genoma humano, respectivamente.

Consulte aquí para leer más.


Retroprocesamiento localizado como modelo de pérdida de intrones en el genoma mitocondrial vegetal

Deposición de datos: Se han depositado secuencias de 608 genes mitocondriales en GenBank con los números de acceso KU642045-KU642465, KX254028-KX254102, KX272887-KX272933 y KX363594-KX363635.

Editor asociado: Dra. Sarah Schaack

Argelia Cuenca, T. Gregory Ross, Sean W. Graham, Craig F. Barrett, Jerrold I. Davis, Ole Seberg, Gitte Petersen, Retroprocesamiento localizado como modelo de pérdida de intrones en el genoma mitocondrial de la planta, Biología y evolución del genoma, Volumen 8, Número 7, julio de 2016, páginas 2176–2189, https://doi.org/10.1093/gbe/evw148


MATERIALES Y MÉTODOS

Datos y números de acceso

Los conjuntos de datos de espectros de masas y de secuencia de ARN de este estudio están disponibles en PRIDE (24) (PXD006661) y Gene Expression Omnibus (25) (GSE99697), respectivamente. Los conjuntos de datos proteómicos de escopeta y secuenciación de alto rendimiento disponibles al público utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S1. Los datos procesados ​​de Ribo-seq y proteómicos están disponibles en las Tablas complementarias S2-S4 y S5, respectivamente.

Secuencias de referencia y anotaciones de genes

Las secuencias de referencia y los archivos de anotaciones GTF para humanos y ratones se recuperaron de UCSC Genome Browser (hg19 y mm10) (26) y GENCODE (v19 y vM9) (27, 28), a menos que se indique lo contrario. Las secuencias de referencia y anotaciones para pez cebra, mosca de la fruta y A. thaliana se recuperaron de Ensembl 85 y Ensembl Plant 31 (29).

Las secuencias de ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) para humanos, ratones, peces cebra y moscas de la fruta se obtuvieron de GtRNAdb (versión 30 de enero de 2012) (30). Se obtuvieron pequeñas secuencias de ARN nucleolar (ARNsno) para humanos y ratones de snOPY (recuperado en marzo y junio de 2016, respectivamente) (31). Estas secuencias se combinaron con las secuencias de ARN no codificantes obtenidas de Ensembl.

Los archivos BED de las regiones de ARNm se obtuvieron analizando los archivos GTF con metagene-maker (32). Los archivos BED fueron procesados ​​adicionalmente por BEDTools v2.22.0 (33) para obtener las posiciones de los exones líderes del ARNm (después de la eliminación de los intrones 5'UTR, Tabla complementaria S6).

Anotaciones uORF

La anotación de uORF de ratón se obtuvo a partir de ORF previamente anotados de células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratón (BMDC) (19). Las ubicaciones genómicas se convirtieron de mm9 a mm10 utilizando Liftover (26) (Tabla complementaria S7). Los uORF humanos se predijeron a partir de los conjuntos de datos Ribo-seq de células HeLa y HEK293 usando RiboTaper v1.3 (20, 34, 35) (Tabla complementaria S7).

Cultivo de células

Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Invitrogen (CA, EE. UU.), A menos que se indique lo contrario. El perfil de ADN de las células HepG2 se realizó en DNA Diagnostics Limited (Auckland, Nueva Zelanda). Los loci de repetición en tándem cortos probados son D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 y FGA, y el locus específico de género amelogenina. Los resultados se compararon con las especificaciones de la línea celular HepG2 en ATCC.

Se cultivaron células HepG2 y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM sin piruvato de sodio) suplementado con suero bovino fetal al 10% y cóctel antibiótico-antimicótico al 1% (estreptomicina, anfotericina B y penicilina). Cuando las células se mantuvieron en una tasa de crecimiento óptima durante 2 semanas, el medio se reemplazó con DMEM para SILAC (marcaje de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular) durante tres pases para agotar Arg y Lys celulares. Este medio SILAC se complementó con suero bovino fetal dializado al 10% y 0,01 mM de Arg y Lys.

Las células HepG2 aclimatadas al medio SILAC se sembraron en un matraz de cultivo T-25 a 1 x 105 células por matraz y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se cultivaron por separado en el medio SILAC suplementado con medio (0,5 mM de 1 -Arg-13C6, clorhidrato y l -Lys- 13 C4, clorhidrato) y aminoácidos pesados ​​(0,5 mM de l -Arg- 13 C6, 15 N4, clorhidrato y l -Lys- 13 C6, 15 N2, clorhidrato). Las células suplementadas con 0,5 mM de Arg y Lys sin marcar se utilizaron como control.

Las células HepG2 marcadas con aminoácidos pesados ​​y medios se expusieron a 100 μM de hemina (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) Y 200 μM de deferoxamina (un quelante de hierro Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.). Las células se recolectaron después de 6 h para análisis de RNA-seq y espectrometría de masas.

Espectrometría de masas

Se determinaron los recuentos de células HepG2 y se lisó el mismo número de células en tampón RIPA (500 µl por 1 x 106 células) en hielo con agitación durante 15-20 min. El lisado se centrifugó a 13 000 gramo durante 20 min. Los sobrenadantes de lisado proteico medio y pesado se mezclaron a igual volumen y se sometieron a electroforesis en un gel NuPAGE Bis-Tris al 10% a 200 V en tampón de ejecución NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen, CA, EE. UU.). El gel se tiñó con una solución de tinción de Coomassie.

Todo el carril de gel se cortó en 10 fracciones de peso molecular. Cada fracción se sometió a digestión tríptica en gel utilizando una estación de trabajo robótica de manipulación de líquidos DigestPro (Intavis, Alemania). Los digeridos de proteínas se secaron en un concentrador centrífugo y se reconstituyeron en acetonitrilo al 5% (v / v), ácido fórmico al 0,2% (v / v) en agua. A continuación, cada muestra se analizó mediante cromatografía líquida de nanoflujo acoplada a espectrometría de masas en tándem LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU.).

Los archivos de salida RAW se procesaron a través de Proteome Discoverer v1.4 (Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU.) Utilizando la configuración predeterminada. A continuación, se buscaron las listas de picos en la base de datos de secuencias de proteínas Human Ensembl 88 utilizando el motor de búsqueda Sequest HT en Proteome Discoverer. Se seleccionaron modificaciones dinámicas de carbamidometil (Cys), desaminación (Asn) y oxidación (Met). La estimación de la tasa de falso descubrimiento posterior al procesamiento se realizó mediante el algoritmo Percolator (36). El Sequest XCorr basado en carga se ajustó para asegurar una tasa de descubrimiento falso de menos del 1% en el nivel de péptidos. Sólo se aceptaron péptidos asignados con alta confianza a proteínas maestras que se identificaron con dos o más péptidos. Todos los péptidos que pasaron los filtros anteriores se usaron para el cálculo de la cuantificación absoluta basada en la intensidad (IBAQ) usando pitómica (37).

Secuencia de ARN

El ARN total se aisló usando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). Estas muestras se enviaron al Centro de Bioinformática y Genómica de Otago en la Universidad de Otago (Dunedin, Nueva Zelanda) bajo contrato con New Zealand Genomics Limited para la construcción y secuenciación de bibliotecas. La calidad de estas muestras se verificó utilizando Agilent Bioanalyzer (Agilent, CA, EE. UU.), Con un umbral de integridad del ARN & gt7. Las muestras que pasaron el control de calidad se utilizaron para la construcción de bibliotecas. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de preparación de muestras de ARNm trenzado TruSeq de acuerdo con el protocolo del fabricante (Illumina, CA, EE. UU.). Estas bibliotecas se evaluaron y cuantificaron utilizando Agilent Bioanalyzer (Agilent, CA, EE. UU.) Y el fluorómetro Qubit (Invitrogen, CA, EE. UU.), Respectivamente. Las bibliotecas se secuenciaron en pares de extremos usando HiSeq 2000 (Illumina, CA, EE. UU.), Generando lecturas de 2 x 100 nucleótidos. La expresión génica para pares de réplicas tenía una correlación de Spearman de & gt0.9.

Análisis de datos de ribo-seq y RNA-seq

La alineación de lectura corta se realizó usando STAR 2.5.2b (38). Las réplicas se combinaron a menos que se indique lo contrario. Solo se permitió un desajuste. Para eliminar huellas no ribosómicas, las lecturas se alinearon primero con los ARN no codificantes (mediante el parámetro –outStd SAM –outReadsUnmapped Fastx –clip3pAdapterSeq –SeedSearchLmax 10 –outFilterMultimapScoreRange 0 –outFilterMultimapNmax 255 –outFilterMismatchNmax 1 –outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical & gt / dev / null). Todas las secuencias del adaptador del extremo 3 'utilizadas en las bibliotecas Ribo-seq analizadas se enumeran en la Tabla complementaria S1.

Luego, las lecturas no asignadas se alinearon con el genoma (mediante el parámetro –clip3pAdapterSeq –SeedSearchLmax 10 –outFilterMultimapScoreRange 0 –outFilterMultimapNmax 255 –outFilterMismatchNmax 1 –outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical –outSAMtype BAM SortedByCoordinate). Las huellas de ribosomas alineadas se examinaron para determinar la periodicidad del triplete de acuerdo con el tamaño de la huella (longitud de lectura) utilizando RiboTaper v1.3 (20). Aquellos tamaños de huella con una buena periodicidad de triplete se examinaron más a fondo para obtener los valores de compensación para ajustar su posición de inicio de lectura al sitio del ribosoma A utilizando RibORF v0.1 (23). Este paso de ajuste de lectura de huella también eliminó cualquier huella restante que no se ajustara a la periodicidad del triplete.

Además, las lecturas sin asignar también se alinearon con las transcripciones de codificación de proteínas (mediante el parámetro –clip3pAdapterSeq –SeedSearchLmax 10 –outFilterMultimapScoreRange 0 –outFilterMultimapNmax 255 –outFilterMismatchNmax 1 –outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical –outSAMtype BAM Unsorted –outSAMmode NoQS –outSAMattributes NH NM). Las lecturas de secuencia de ARN alineadas se usaron para la cuantificación de isoformas de ARNm usando Salmon v0.60 (39). Las huellas de ribosomas alineadas se utilizaron para la cuantificación del nivel de isoformas utilizando riboprof (Ribomap v1.2) (40), que fue respaldado por los datos de abundancia de isoformas de ARNm, alineación de secuencia de ARN y los valores de compensación para el ajuste de lectura de la huella (arriba). Este paso asignó huellas de ribosomas de forma única a las isoformas de ARNm al priorizar el marco 1 de un CDS, seguido de los marcos 2 y 3 y, por último, las UTR.

Predicción de plegamiento de ARN

Para la predicción de la estructura del ARN, las secuencias líder de ARNm se extrajeron de las secuencias genómicas utilizando BEDTools v2.22.0 (33). La Energía Libre Mínima (MFE) de plegar las secuencias líder de ARNm se predijo usando RNAfold (41) y se normalizó a la longitud del líder. Para la accesibilidad del ARN, se extrajeron las primeras 100 bases del extremo 5 'de las secuencias de ARNm. La accesibilidad de estas secuencias se estimó utilizando Localfold (42) y se normalizó a la longitud (100 bases).

Análisis de metageno

Las distribuciones de EEJ a lo largo de los ARNm se trazaron utilizando Guitar v1.11.9 (43). Guitar produce un diagrama de metagen basado en longitudes normalizadas de las regiones de ARNm. Los perfiles de ribosoma de metageno alrededor de los codones de iniciación y terminación de la traducción se representaron usando RibORF v0.1 (23). Para el análisis de empalme, se calculó el índice de empalme completo (coSI) utilizando IPSA (https://github.com/pervouchine/ipsa) (44). Para el análisis de metagen de MLN51, las lecturas alineadas de iCLIP (reticulación UV e inmunoprecipitación de resolución de nucleótidos individuales) se "recortaron" mediante un script de shell personalizado y se convirtieron a formato BED utilizando BEDTools v2.22.0 (33). La posición central de cada lectura de iCLIP procesada se usó como el sitio de unión de la proteína de ARN en lugar de la posición de inicio de la lectura (45).

Análisis genómico comparativo

Las coordenadas genómicas de las regiones de ARNm se convirtieron en coordenadas de nivel de transcripción utilizando TransDecoder v3.0.0 (46). Se determinaron las posiciones relativas del líder EEJ y uAUG. Estos datos se asignaron a datos ortólogos humanos y de ratón descargados de Ensembl Biomart (consultado en mayo de 2016). Para evitar la ambigüedad, solo se analizaron los ortólogos uno a uno que contienen un solo líder EEJ y / o uNUG (Tabla complementaria S8).

Análisis estadístico

Welch dos muestra t-prueba, prueba exacta de Fisher, prueba de chi-cuadrado unilateral y análisis de regresión lineal se realizaron utilizando R v3.4.0 (47). Las parcelas se construyeron usando ggplot2 (48) a menos que se indique lo contrario. Los coeficientes de regresión estandarizados de los modelos de regresión lineal se trazaron utilizando sjPlot (49). Un umbral significativo de PAGSe utilizó un valor & lt 0,05 a menos que se indique lo contrario.


Resultados

Numerosos nimtRNAs no identificados hasta ahora están presentes en genomas nucleares

Para escanear, en particular, los genomas humanos y de ratón en busca de secuencias MTL, aplicamos diferentes combinaciones de herramientas de anotación (tRNAscan-SE e Infernal) y estrategias (NUMT-basados ​​y genoma-basado), consulte el archivo adicional 1: Fig. S1A. Dentro de NUMT-basado en el enfoque (utilizando las secuencias publicadas numtDNA como referencia solamente) para el genoma humano, obtuvimos 775 aciertos de Infernal [35] y 726 aciertos de tRNAscan-SE. En contraste, el genoma-basado en el enfoque (utilizando el genoma completo como referencia), recibimos 367 aciertos, sólo, de Infernal, mientras que tRNAscan-SE [36] obtuvo aproximadamente 2,65 veces más aciertos (977 aciertos). El análisis del genoma del ratón arrojó resultados muy similares. Tenemos 105 hits de Infernal y 79 hits de tRNAscan-SE dentro del NUMTenfoque basado en Los golpes del genomaEl enfoque basado en el análisis varía de 75 (Infernal) a 246 (tRNAscan-SE).

Dado que para cada numtDNA se conoce la secuencia de mtDNA original, usamos esta información de sintetizador para validar nuestros resultados. Para cada método, clasificamos los aciertos detectados como verdaderos positivos (TP) si se encontraban en el numtDNA correspondiente, tal como se describe por su sintenía del ADN mitocondrial de origen. Los resultados restantes se designaron como falsos positivos (FP). Como se muestra en el archivo adicional 1: Fig. S1A, Infernal encontró un 2% más de TP en humanos que tRNAscan-SE (tasa de verdaderos positivos (TPR) de 0,91) dentro de la NUMTenfoque basado en A pesar de la menor sensibilidad de tRNAscan-SE, la herramienta cuenta solo 29 falsos positivos (FP) en comparación con los 68 resultados FP de Infernal. La diferencia es aún más pronunciada en el NUMT-basado en ratón, donde Infernal identificó un 13% más de TP, pero también un 11% más de FP en comparación con tRNAscan-SE. tRNAscan-SE muestra la mayor sensibilidad en el genoma-enfoque basado en un TPR de 0,88 y 0,72 en humanos y ratones, respectivamente. Infernal entrega mucho menos TP en ambas especies para el genoma-método basado. Tanto en el NUMT- y el genomaEnfoque basado en tRNAscan-SE muestra el mejor equilibrio entre TP y FP. Para el análisis posterior, el conjunto final de MTL se compone de todos los TP detectados (MTL dentro de numtDNA reconocible) independientemente del método y la herramienta utilizados.

Finalmente, identificamos 731 MTL dentro de numtDNA reconocible (42 MTL (NUMT-método basado en) + 684 (NUMT- y genoma-método basado en) + 5 (genomamétodo basado en)) y 92 MTL dentro de numtDNA reconocible (16 MTL (NUMT-método basado en) + 73 (NUMT- y genoma-método basado en) + 3 (genomabasado en el método)) en genomas humanos y de ratón, respectivamente (Fig. 2a). De los mismos, hay 355 MTL en descubrimientos novedosos en humanos y 44 MTL en ratones. Nuestra estrategia de anotación MTL es más sensible (TPR de 0,93 en humanos y 0,85 en ratón) en comparación con las anotaciones MTL anteriores (TPR de 0,48 en humanos y 0,47 en ratón) [32, 33] (Archivo adicional 1: Fig. S1A). Estudios computacionales anteriores han demostrado que alrededor del 20% de los MTL se encuentran dentro de intrones que designamos como nimtRNAs de genes codificadores de proteínas nucleares en humanos [33, 37]. Observamos resultados comparables con nuestro análisis. En los seres humanos, identificamos un total de 281 nimtRNA de todos los tipos en los intrones de 76 genes del huésped diferentes, de los cuales 30 eran codificadores de proteínas, 28 especificaban RNA no codificantes intergénicos largos (lincRNA), 13 codificaban ncRNA cortos y 5 eran pseudogenes. En total, 121 de los nimtRNA identificados en humanos son nuevos. En comparación con encuestas anteriores [33, 37], identificamos 12 nuevos nimtRNA (de un total de 34) en 11 genes del huésped diferentes (9 genes codificadores de proteínas diferentes y 2 lncRNA diferentes) en el ratón. Se puede obtener una lista completa de todos los MTL anotados y nimtRNA que se encuentran en ratones y seres humanos en Archivo adicional 2: Tabla S1 y Archivo adicional 3: Tabla S2, respectivamente.

Análisis computacionales de MTL dentro del genoma humano y de ratón. a Descripción general de los MTL anotados en humanos y ratones. Diagrama de Venn que ilustra la superposición entre nuestros MTL anotados (propios) y los que ya se conocen (publicados), así como cuáles de ellos se encuentran dentro de numtDNAs previamente anotados (synteny). Aunque la información de síntesis indica qué ARNmt se han integrado en el genoma nuclear, no todos pueden anotarse debido a su fuerte degradación (53 en humanos y 15 en ratones). En total, identificamos 731 y 92 MTL dentro de numtDNA reconocible en humanos y ratones, respectivamente. De estos, 355 están anotados recientemente en humanos y 44 en ratones. B Los genes DCLK1, CENPP, y AKAP6 en H. sapiens y el gen Myo3a en M. musculus fueron analizados por tRNAscan. Además, se determinaron las distancias 5 'y 3' desde los grupos de nimtRNA hasta los extremos del intrón. Las letras blancas en recuadros negros representan el código de aminoácidos de una sola letra del nimtRNA respectivo (Q = nimtRNA Gln, I = nimtRNA Ile, Y = nimtRNA Tyr, C = nimtRNA Cys, N = nimtRNA Asn, A = nimtRN Ala, W = nimtRNA Trp, D = nimtRNA Asp, S = nimtRNA Ser). C MTL evolutivos conservados. Los valores atípicos de los MTL están sujetos a una selección estabilizadora más fuerte después de su inserción en el genoma nuclear en relación con los numtDNA y se muestran por encima de la línea roja. Los valores atípicos se midieron mediante la distancia de Cook. La mayoría (25 de 36) de los valores atípicos más extremos son nimtRNA. D Preservación de la estructura secundaria de nimtRNAs. Como ejemplo, se muestran múltiples alineamientos de secuencia junto con el motivo de ARN de estructura de secuencia de consenso para todos los nimtRNA de tipo nimtRNA Asp. Las secuencias de nimtRNA Asp exhiben cambios de base en comparación con su mtRNA Asp primordial, pero la estructura secundaria se mantiene. Los diferentes colores proporcionan información sobre el número de pares de bases distintos que se producen, mientras que el sombreado indica cuántas secuencias o estructuras en la alineación no forman un par de bases en particular.

Conservación de MTL y nimtRNA

En varios casos, grandes grupos de genes nimtRNA con extensas similitudes de secuencia con el genoma mitocondrial estaban presentes dentro de intrones de genes nucleares pero estaban completamente ausentes de las regiones exónicas. Se muestran cuatro ejemplos de intrones del gen del huésped nimtRNA en humanos y uno en ratón (Fig. 2b). Los grupos de mitocondrias observados se encuentran en diferentes genes del ratón en comparación con los genomas humanos. Encontramos un grado similar de conservación evolutiva entre nimtRNAs y las correspondientes secuencias mitocondriales entre diferentes mamíferos. Dado que sus puntuaciones PhyloP son muy bajas, la mayoría de MTL dentro de numtDNA reconocible no muestran evidencia de selección negativa en los genomas del huésped. Si bien descubrimos que las puntuaciones PhyloP están ligeramente mejoradas en MTL dentro de numtDNA y nimtRNA reconocibles en comparación con las secuencias de numtDNA circundantes (archivo adicional 1: Fig. S1B y C), las presiones de selección son insuficientes para identificar MTL individuales dentro de numtDNA o nimtRNA reconocibles que son bajo fuerte selección negativa. En cambio, solo se conservan algunos elementos más cortos. Los interpretamos como posibles sitios de unión que han surgido de la secuencia de mtRNA insertada. Utilizando un método diferente, identificamos alrededor de una docena de MTL dentro de numtDNA y nimtRNA reconocibles que parecen haber evolucionado significativamente más lentamente que las secuencias de numtDNA adyacentes. También es interesante notar que los nimtRNAs representan la mayoría de los valores atípicos más extremos (Fig. 2c) medidos por la distancia de Cook. Todos estos valores atípicos se enumeran en el archivo adicional 4: Tabla S3.

Con base en la estructura de consenso de cada tipo de nimtRNA, es evidente que los cambios de base en la mayoría de los tipos de nimtRNA se ubicaron en regiones de bucle de tRNA o, en varios casos, estuvieron presentes en forma de cambios de base compensatorios en las estructuras del tallo (Fig. 2d, archivo adicional 5: Tabla S4). En consecuencia, en la mayoría de las estructuras de consenso, la estructura secundaria mitocondrial se retiene en gran medida y, por lo tanto, probablemente también su función (ver más abajo). Los cambios de base compensatorios conservados evolutivos son consistentes con un papel funcional de los genes nimtRNA codificados en el núcleo. En algunos casos, las estructuras de consenso se desvían fuertemente de sus mtRNA primordiales. Esta es probablemente una de las razones por las que no podemos encontrar todos los MTL esperados dentro de un numtDNA, como es el caso de mtRNA Pro en particular.

En conjunto, la inserción de genes nimtRNA en los respectivos intrones de genes nucleares podría ser un evento evolutivo muy reciente, que podría haber ocurrido de forma independiente en diferentes especies además de la posible retención de nimtRNAs preexistentes. Además, este análisis computacional apunta a MTL dentro de numtDNA y nimtRNA reconocibles como una fuente de sitios de unión funcionales. Como se esperaba en tal escenario, la mayoría de los MTL dentro de numtDNA y nimtRNA reconocibles no han alcanzado importancia funcional porque simplemente no están presentes en un contexto genómico útil o no hay una ventaja selectiva que se pueda obtener de un MTL dentro de los reconocibles numtDNA o nimtRNA derivados sitio de unión en la posición de la inserción.

Los NimtRNA ubicados en intrones de pre-mRNA codificados en el núcleo no se procesan como tRNA auténticos en las células 293T

Los ARNt codificados tanto mitocondrial como nuclear son procesados ​​postranscripcionalmente por la ARNasa P y la ARNasa Z en sus extremos 5 'y 3', respectivamente (ver arriba). Para investigar más de cerca una posible escisión, procesamiento y función de los nimtRNA, empleamos un reportero de empalme de eGFP, designado como Low0-eGFP, que consiste en un exón no codificante, un intrón de 2.2 kb de longitud y un segundo exón, que contiene la codificación secuencia de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP Fig. 3a) [38].

Los NimtRNA aumentan la abundancia de mRNA del gen del hospedador aumentando la eficiencia del empalme. a Los recuadros negros representan el código de aminoácidos de una sola letra del nimtRNA respectivo: un nimtRNA (Y), dos (YC), tres (YCN), cuatro (YCNA) o cinco (YCNAW) nimtRNA del ratón Myo3a el intrón 30 se clonó en la región intrónica del indicador de corte y empalme Low0-eGFP, exhibiendo un sitio de corte y empalme 5 'eficiente. Los genes NimtRNA se insertaron como se indica mediante triángulos. B Análisis de transferencia Northern de las construcciones de ARNm de eGFP como se muestra en a realizado con sondas marcadas con digoxigenina (DIG). La normalización de RT-qPCR y análisis de transferencia Northern se realizó al ARNm de control de transfección Dsred2Express. Los experimentos fueron realizados por triplicado. C Análisis de RT-qPCR de constructos como se muestra en a se realizó con la unión del cebador directo al exón 1 y la unión del cebador inverso al exón 2, representada por flechas negras que se muestran en a. D Se insertaron cinco genes de ARNt nucleares (denominados nucl. YCNAW) en el informador de corte y empalme Low0-eGFP y se comparó su influencia en el corte y empalme con el informador que contenía cinco ARNnim (YCNAW). Se tomó como referencia el reportero de empalme Low0-eGFP. mi Se generaron líneas celulares estables que contenían una única copia del indicador de corte y empalme Low0-eGFP y cinco nimtRNA o cinco tRNA nucleares. La normalización se realizó a β-actina. Se tomó como referencia el reportero de empalme Low0-eGFP establemente integrado. F Los niveles de ARNm, pre-ARNm y transcrito total (ARNm + pre-ARNm) de células transfectadas con las respectivas construcciones se evaluaron mediante RT-qPCR. Las barras de error representan la desviación estándar de la media de tres experimentos independientes. gramo El indicador de empalme Low2-eGFP difiere del indicador de empalme Low0-eGFP por poseer un sitio de empalme 5 'menos eficiente como se indica. Los promedios y las desviaciones estándar se determinaron a partir de tres conjuntos independientes de experimentos. Las barras de error representan la SD y *PAG & lt 0.05 ***PAG & lt 0,001 ****PAG & lt 0,0001 (ANOVA)

Un grupo de cinco genes nimtRNA (de los siete nimtRNA del Myo3a gen, Fig.3a), previamente informado de estar presente dentro del intrón 30 del ratón Myo3a gen [33], se insertó en la región intrónica de este reportero de empalme. La justificación para no incluir los siete nimtRNA se basó en el hecho de que dos nimtRNA, es decir, nimtRNA Asp y nimtRNA Ser, respectivamente, se encuentran 1,5 kb aguas arriba del grupo de cinco nimtRNA, y la inserción de una región que abarca 1,5 kb adicionales podría tienen un empalme de reportero canónico deficiente. Por lo tanto, el grupo de ARNmt de ratón exhibió distintas diferencias de secuencia en comparación con los ARNmt humanos auténticos o los ARNnimt humanos, lo que permitió su detección específica mediante análisis de transferencia Northern. Las células HEK 293T se transfectaron transitoriamente con los indicadores de corte y empalme que carecían o contenían nimtRNA. La abundancia y / o procesamiento de nimtRNA, es decir, nimtRNA Tyr, nimtRNA Cys y nimtRNA Asn, de la Myo3a El grupo de nimtRNA se investigó mediante transferencia Northern. Sin embargo, no se detectó ninguna señal de hibridación correspondiente a nimtRNA totalmente procesados ​​de aproximadamente 70 nt de longitud (archivo adicional 1: Fig. S2A).

Por tanto, a continuación investigamos si el procesamiento de otro ncRNA codificado por intrón informado, es decir, un snoRNA dentro de la construcción informadora de empalme de eGFP también se vio obstaculizado. Con ese fin, clonamos el gen de un ncRNA específico del cerebro, es decir, el snoRNA SNORD115 de la caja C / D que incluye regiones flanqueantes en la ubicación intrónica idéntica. En contraste con nimtRNAs, una señal de hibridación del tamaño esperado para las especies de ARN SNORD115 procesadas podría observarse fácilmente (archivo adicional 1: Fig. S2B).

Para abordar la discrepancia en el procesamiento canónico de un snoRNA, en comparación con nimtRNA, empleamos un reportero Pol III sin intrón que contiene una sola copia de nimtRNA Asn de la Myo3a gene. De acuerdo con nuestras expectativas, observamos un nimtRNA Asn totalmente procesado y estable por análisis de transferencia Northern (archivo adicional 1: Fig. S2B), excluyendo la posibilidad de que los nimtRNAs se degraden dentro del núcleo. Además de las secuencias de nimtRNA, también investigamos el procesamiento de nimtRNA de sus transcripciones de genes endógenos del huésped. Sin embargo, como se observó para el reportero de empalme de eGFP, tampoco pudimos detectar nimtRNA procesados ​​de la endógena DYNC2H1 gen del hospedador.

El papel de los nimtRNA en el metabolismo del pre-mRNA

Para investigar las funciones alternativas de los nimtRNA, insertamos uno, dos, tres, cuatro o cinco genes nimtRNA del M. musculus Myo3a intrón, es decir, nimtRNA Tyr, nimtRNA Cys, nimtRNA Asn, nimtRNA Ala y nimtRNA Trp, en el intrón de la construcción informadora de empalme Low0-eGFP empleada anteriormente (Fig. 3a). Posteriormente, mediante el análisis de transferencia Northern y RT-qPCR, investigamos su influencia en el empalme de pre-ARNm del gen del huésped eGFP. Curiosamente, la inserción de nimtRNA en el gen informador de eGFP dio como resultado un aumento significativo en la abundancia de niveles de mRNA de eGFP empalmados, en comparación con un control que carece de los genes de nimtRNA (wt Fig. 3b, c).

Es importante destacar que las células transfectadas con construcciones de eGFP que contienen uno (Y), dos (YC), tres (YCN), cuatro (YCNA) o cinco nimtRNA (YCNAW) exhibieron un aumento dependiente del número de copias de los niveles de mRNA de eGFP empalmados de 1,9 veces , 2,9, 3,2, 3,1 y 3,9 veces, respectivamente, según se evaluó mediante análisis de transferencia Northern y RT-qPCR (Fig. 3b, c). Sorprendentemente, nimtRNA Trp, que está presente en orientación complementaria inversa en el reportero de empalme Low0-eGFP (como también se observa dentro del genoma mt), también aumentó la abundancia de ARNm reportero. La normalización de los niveles de ARNm de eGFP se realizó empleando un plásmido cotransfectado (ARNm de control), que codifica una proteína roja fluorescente (DsredExpress2). El aumento en los niveles de ARNm se acompañó de un aumento en el nivel de proteína eGFP, según lo evaluado midiendo los niveles de fluorescencia de eGFP, normalizado a DsredExpress2 (archivo adicional 1: Fig. S3A).

En los experimentos anteriores, las secuencias intrónicas que contienen nimtRNAs únicos o múltiples se introdujeron en el intrón además de la secuencia de tipo salvaje en lugar de por sustitución. Para excluir una posible influencia del tamaño del intrón y / o la estructura del intrón en la abundancia de ARNm, se clonó un inserto artificial (de la misma longitud que YCNAW), que contenía cinco ARNt nucleares, en el mismo reportero de corte y empalme. De este modo, se insertaron cinco homólogos de ARNt nimt nucleares, es decir, ARNt Tyr, ARNt Cys, ARNt Asn, ARNt Ala y ARNt Trp, en el indicador de corte y empalme Low0 y se analizaron para determinar su efecto sobre el corte y empalme del gen del hospedador. Es de destacar que los tRNA nucleares, aunque codifican los mismos aminoácidos que los nimtRNA, difieren ampliamente en sus secuencias de sus homólogos de nimtRNA. Sin embargo, a diferencia de los nimtRNA, la construcción del grupo nuclear YCNAW resultó en una disminución significativa, en lugar de un aumento en la abundancia de mRNA, apuntando hacia una secuencia específica o características estructurales de nimtRNAs (ver más abajo) que gobiernan el aumento observado en los niveles de mRNA (Fig. 3d).

Los resultados anteriores también se corroboraron mediante la introducción del indicador de corte y empalme Low0-eGFP en líneas celulares estables. Con ese fin, el reportero de empalme Low0-eGFP se clonó aguas abajo de un promotor EF1α y se insertó como una sola copia mediante recombinación de Flippase en células HEK 293 Flip-In [39]. El intrón informador no contenía tRNA, cinco nimtRNAs del Myo3a gen, o sus homólogos de tRNA nuclear (ver arriba). Mediante el análisis de RT-qPCR, observamos una abundancia aún mayor (es decir, 7,9 veces, en comparación con 3,9 veces en las células transfectadas transitoriamente) de niveles de ARNm de eGFP empalmados en la línea celular que contiene nimtARN intrónicos en comparación con las líneas celulares que contienen el original secuencia intrónica o los ARNt nucleares (Fig. 3e).

Los NimtRNA aumentan la abundancia de mRNA mejorando la eficiencia del empalme

A continuación, queríamos determinar si el aumento de la transcripción o el procesamiento de pre-ARNm era responsable del aumento mediado por nimtRNA en los niveles de ARNm de eGFP empalmado. Por lo tanto, investigamos si los niveles de transcripción total y sin empalmar (es decir, niveles empalmados y sin empalmar combinados) del reportero de empalme Low0-eGFP también se vieron afectados por nimtRNA. Tras la inserción intrónica de nimtRNAs en el reportero de empalme Low0-eGFP (designado como Low0-YCNAW), mediante el análisis RT-qPCR observamos un aumento de aproximadamente 3 veces en la abundancia de ARNm empalmado, así como en los niveles de transcripción total, mientras que los niveles de pre-ARNm permaneció sin cambios (Fig. 3f), consistente con un aumento en el empalme mediado por nimtRNA.

El primer paso del ensamblaje del espliceosoma comprende el reconocimiento del sitio de empalme 5 'por parte del ARNnn de U1 [2]. Se sabe que el reconocimiento de sitios de corte y empalme débiles, es decir, aquellos que muestran una baja complementariedad de ARNsn de U1, es más dependiente de los SRE. Por lo tanto, redujimos la fuerza del sitio de empalme 5 '(es decir, complementariedad de ARNnn U1: puntaje de enlace H (HBS) 17.5 & gt 12.1 designado como reportero de empalme Low2-eGFP) y comparamos los niveles de transcripción total y sin empalmar. En particular, el HBS de este donante de corte y empalme todavía está dentro del rango de 12,0 a 20,0, que se observa en el 86% de los exones humanos empalmados constitutivamente [40] (Fig. 3g).

Como se esperaba, el reportero Low2 wt resultó en una disminución extensa, es decir, 450 veces, en la abundancia de ARNm reportero, en comparación con el reportero Low0 wt más eficiente, mientras que solo se redujo aproximadamente 2 veces en los niveles de pre-ARNm y transcrito total. observado. Tras la inserción de nimtRNA en el indicador Low2 (designado como Low2-YCNAW), la abundancia de ARNm empalmado fue aproximadamente 38 veces menor en comparación con la construcción Low0 wt. Por lo tanto, la inserción del grupo YCNAW nimtRNA resultó en un aumento de aproximadamente 13 veces en la abundancia de ARNm empalmado en el reportero de empalme Low2 ineficiente, por lo tanto exhibiendo un efecto más pronunciado sobre el empalme que el reportero de empalme Low0 eficiente (mostrando un aumento de aproximadamente 3 veces en abundancia de ARNm). En particular, los niveles de transcripción de pre-mRNA y reportero total permanecieron sin cambios (Fig. 3f). Esto puede explicarse porque el pre-ARNm informador es significativamente más abundante que el ARNm empalmado.

Los nimtRNA individuales aumentan de manera diferente los niveles de mRNA del huésped

El análisis del corte y empalme de pre-mRNA demostró un aumento dependiente del número de copias de nimtRNA en la abundancia de mRNA. Por lo tanto, para investigar el efecto de nimtRNAs únicos sobre la abundancia de mRNA, nimtRNAs del Myo3a Los genes se insertaron individualmente en el reportero de empalme Low0-eGFP y se evaluó su influencia en el empalme. En este contexto, se observó que nimtRNA Tyr (Y), nimtRNA Cys (C), nimtRNA Ala (A) y nimtRNA Trp (W) aumentaron significativamente los niveles de mRNA de eGFP en 1,9 veces, 2,8 veces, 2,6 veces, y 2,5 veces, respectivamente, en comparación con un control codificado (Fig. 4a). Curiosamente, nimtRNA Trp, que está presente en una orientación complementaria inversa en su intrón huésped (es decir, como está presente dentro del genoma mt), también aumentó la abundancia de mRNA (ver arriba).

Los NimtRNA aumentan la inclusión del exón aguas abajo de una manera dependiente de la estructura y la posición. a Los nimtRNA individuales se analizaron para determinar sus efectos sobre la abundancia de mRNA del gen del huésped informador en comparación con un control codificado (scrbl). B Se eliminaron diferentes dominios de nimtRNA Tyr, es decir, el brazo D (delD), el brazo T (delT), el tallo aceptor (delAcc) o el brazo anticodón (delAnti), respectivamente. Alternativamente, se intercambió nimtRNA Tyr por una secuencia codificada (scrbl), o se insertó en el reportero de empalme en orientación complementaria inversa (r.-c.). C NimtRNA Tyr se integró en diferentes ubicaciones dentro del intrón del reportero de empalme Low0-eGFP. Las abundancias de ARNm del gen huésped respectivo se evaluaron mediante RT-qPCR, las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. La normalización se realizó en relación con un control indicador cotransfectado, es decir, Dsred2express. D El nimtRNA Tyr se insertó en diferentes ubicaciones dentro de los intrones del reportero de empalme alternativo y se usó para experimentos de transfección transitoria. mi Se analizaron isoformas de corte y empalme alternativas mediante RT-PCR y electroforesis en gel posterior. El PSI (porcentaje empalmado), incluida la desviación estándar, se cuantificó a partir de tres conjuntos independientes de experimentos. F, gramo Se realizó un análisis de RT-PCR para detectar isoformas de corte y empalme alternativas de construcciones que contienen diferentes ARNmt o ARNnim dentro del primer intrón del Designer Exon. El PSI, incluida la desviación estándar, se cuantificó a partir de tres conjuntos independientes de experimentos.

El análisis mutacional mediante la eliminación de dominios canónicos de tRNA dentro de nimtRNA Tyr, es decir, el brazo D (delD), el brazo T (delT), el tallo aceptor (delAcc) o el brazo anticodón (delAnti), respectivamente, dio como resultado un disminución de la abundancia de ARNm para todas las versiones mutantes de nimtRNA Tyr. Se eligió NimtRNA Tyr porque observamos que la estructura secundaria de los homólogos de nimtRNA Tyr está bien conservada en el genoma humano y de ratón. La disminución más destacada en el corte y empalme se observó tras la deleción del brazo T dentro de nimtRNA Tyr (Fig. 4b).Como se esperaba, la codificación de la secuencia de nimtRNA Tyr (designada como scrbl) no logró aumentar significativamente los niveles de mRNA de eGFP. Curiosamente, en contraste con el control scrbl, la versión complementaria inversa de nimtRNA Tyr designada como nimtRNA Tyr r.-c. , dio como resultado un aumento en la abundancia de ARNm de eGFP comparable a la observada usando su contraparte canónica.

Los NimtRNA afectan el empalme del pre-mRNA dependiendo de su posición relativa dentro de un intrón

Se ha demostrado que el empalme se modula de una manera dependiente de la posición mediante el empalme de elementos reguladores (SRE) [3]. Por lo tanto, investigamos el efecto del posicionamiento de nimtRNA en el reconocimiento del sitio de empalme. Por lo tanto, introdujimos el grupo YCNAW nimtRNA o un solo nimtRNA Tyr (Y) en diferentes ubicaciones dentro del intrón del reportero de empalme Low0-eGFP. Observamos el aumento más fuerte en la abundancia / empalme de ARNm al insertar el grupo nimtRNA 200 bp aguas abajo del sitio de empalme 5 'en comparación con una inserción en el centro del intrón de 2,2 kb de longitud o 200 bp aguas arriba del 3'- sitio de empalme (archivo adicional 1: Fig. S3B y C). Tras la inserción del nimtRNA Tyr único en diferentes ubicaciones intrónicas, observamos el aumento más fuerte en la eficiencia de empalme para inserciones de 50 a 100 pb aguas abajo del sitio de empalme 5 '(Fig. 4c). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el aumento en la eficiencia de empalme tras la inserción de un nimtRNA único o múltiple depende de la posición y, por lo tanto, es comparable a los efectos observados para los SRE auténticos.

Los NimtRNA aumentan la inclusión de exones alternativos en un reportero de empalme de tres exones

A continuación, queríamos investigar si los nimtRNA también pueden aumentar la inclusión de exón en un reportero de empalme de tres exones que exhibe un exón interno empalmado alternativamente. El reportero de empalme alternativo (designado como Designer Exon) consistió en tres exones de 126 pb, 82 pb y 273 pb de longitud, así como intrones intermedios de 242 y 637 pb, colocados corriente abajo de un promotor de CMV (Fig. 4d) [41 ]. El segundo exón se diseñó para contener un aceptor de empalme 3 'ineficaz en el límite del intrón1 / exón2, con su tracto de polipirimidina compuesto de solo 50% de pirimidinas, lo que reduce la inclusión del exón alternativo.

Tras la introducción de nimtRNA Tyr (Y) en el primer intrón, es decir, 88 pb aguas abajo del sitio de empalme 5 ', un aumento en los niveles de PSI (porcentaje de empalme) de 27.0 ± 5.4 (tipo salvaje) a 54.1 ± 4.9 (con inserción de nimtRNA Tyr) (Fig. 4e). Por el contrario, la introducción de nimtRNA Tyr en el segundo intrón 100 pb aguas abajo del exón alternativo resultó en una disminución en los niveles de PSI a 21,0 ± 5,1, mientras que la inserción en el medio del intrón (es decir, situado 280 pb hacia arriba y hacia abajo de la bordes del exón) o cerca del sitio de empalme 3 '(es decir, 100 pb aguas arriba del tercer exón) dieron como resultado niveles de PSI de 24,7 ± 5,9 y 30,5 ± 6,8, respectivamente, comparables a la construcción del indicador wt que carece de nimtRNA (Fig. 4e ).

Como se indicó anteriormente, postulamos que los nimtRNA se originaron a partir de mtRNA, codificados dentro del genoma mitocondrial. Sin embargo, en el curso de la evolución, los nimtRNA nucleares han adquirido mutaciones específicas, en comparación con sus ancestros mitocondriales. Por lo tanto, para determinar si los antepasados ​​mitocondriales de los nimtRNA, es decir, los mtRNA auténticos, promovieron el empalme como se observó en sus homólogos codificados en el núcleo, también analizamos la influencia de los mtRNA en el empalme alternativo. Por lo tanto, introdujimos mtRNA Gln de ratón, mtRNA Ser1, mtRNA Ser2 o la variante complementaria inversa de mtRNA Ser1, denominada mtRNA Ser1r.-c. , en el intrón 1 del reportero de empalme alternativo. De hecho, mtRNA Gln, mtRNA Ser1, mtRNA Ser2 y mtRNA Ser1r.-c. aumento de la inclusión de exones (Fig. 4f). Además, el mtRNA Ser1r.-c. mostraron efectos comparables sobre la inclusión de exones a un reportero de empalme Low0-eGFP de dos exones, que alberga nimtRNA Trp en orientación de complementariedad inversa.

Por el contrario, la variante complementaria inversa de mtRNA Gln, es decir, mtRNA Gln r.-c. , no mejoró la inclusión del exón (PSI = 25,1 ± 5,1) (Fig. 4f). Tras una inspección más cercana, mtRNA Gln contenía un par de bases U-G en cada una de sus regiones del tallo. Como consecuencia, la variante de mtRNA Gln r.-c. exhibe un par A-C en esta posición (archivo adicional 1: Fig. S4). Tras la mutación de los nucleótidos respectivos (es decir, A a G o C a U), observamos un rescate parcial de la inclusión de exón alternativo (PSI = 32,7 ± 5,1) (Fig. 4f, mtRNA Gln r.-c. mut.). Curiosamente, tres copias idénticas del mismo nimtRNA, es decir, mtRNA Ser2, dieron como resultado un aumento sustancial adicional en la inclusión de exones alternativos (Fig. 4f), como ya se observó en el reportero de empalme Low0-eGFP de dos exones que emplea múltiples, pero diferentes , nimtRNAs (ver arriba y Fig. 3c).

Los NimtRNA del mismo isotipo podrían derivarse de diferentes secuencias fundadoras de mtRNA, ya que planteamos la hipótesis de que la integración nuclear de los mtRNA se producía en varios puntos de tiempo diferentes en la evolución (ver más arriba). Es importante destacar que las secuencias de nimtRNA del mismo isotipo pueden verse influidas en diferentes grados por la presión evolutiva y, por lo tanto, pueden diferir ampliamente en su capacidad para influir en el empalme.

Por lo tanto, para determinar las posibles diferencias en la capacidad de empalme de un solo isotipo de nimtRNA, investigamos diferentes variantes de nimtRNA Ser2 en el reportero de empalme alternativo. Con este fin, todas las secuencias de nimtRNA Ser2 fueron alineadas por MUSCLE [42] y se estimaron las distancias entre las secuencias empleando MEGA para calcular la probabilidad máxima [43]. Este análisis dio como resultado la generación de agrupaciones distintas, de las cuales se eligieron seis secuencias candidatas de nimtRNA Ser2 para el análisis de corte y empalme en el indicador de corte y empalme alternativo. En comparación, también se investigaron los efectos del ARNmt Ser2 humano genuino sobre el empalme. Curiosamente, en el curso de estos análisis, observamos diferentes efectos estimulantes de las variantes de nimtRNA Ser2 en la inclusión de exones alternativos, que van desde 59,7 a 90,9 en PSI (Fig. 4g), por lo tanto, el mtRNA Ser2 humano de buena fe dio como resultado un PSI de 87,8. Por tanto, diferentes nimtRNA, derivados del mismo isotipo, así como mtRNA auténticos, pueden ejercer un amplio rango en la inclusión de exones dentro del informador de corte y empalme alternativo.

CRISPR / Cas9 mediado por la deleción parcial de nimtRNA Lys endógeno dentro del intrón 28 del PPFIBP1 El gen da como resultado una disminución de la inclusión del exón 29 aguas abajo

Para analizar la influencia de los nimtRNA endógenos en el empalme de genes del huésped, nos enfocamos en el nimtRNA Lys ubicado dentro del intrón 28 del PPFIBP1 gen mediante un enfoque basado en CRISPR / Cas9 (Fig. 5a). los PPFIBP1 El gen comprende 31 exones y contiene un único nimtRNA intrónico Lys, que exhibe una estructura secundaria canónica similar a tRNA. PPFIBP1 codifica la proteína de unión a PPFIA 1 (PPFIBP1), un miembro de la familia de proteínas que interactúan con la proteína LAR-tirosina fosfatasa, también denominada liprinas y se expresa abundantemente en las células HEK 293T. Mediante el empleo de la herramienta web CRISPOR [44], se diseñó un sgRNA (RNA de guía única) para apuntar directamente al bucle T de nimtRNA Lys y se clonó en lentiCRISPRv2 para la transducción lentiviral de células HEK 293T, como se describió anteriormente [45]. Posteriormente, la eficiencia de la formación de nimtRNA indel fue confirmada por análisis TIDE [46] (archivo adicional 1: Fig. S5). Por lo tanto, determinamos una eficiencia de edición del 94,5%, donde aproximadamente el 31% de las células albergaban deleciones entre 13 y 17 nts, respectivamente.

Una deleción parcial mediada por CRISPR de un nimtRNA regula negativamente la inclusión del exón corriente abajo de un gen del huésped endógeno. a El gen nimtRNA Lys, ubicado dentro del intrón 28 del humano PPFIBP1 gen, fue dirigido por un enfoque mediado por CRISPR para analizar la influencia de las deleciones parciales dentro del gen nimtRNA Lys en la inclusión del exón 29 de PPFIBP1. B Se cultivaron clones individuales de células dirigidas a CRISPR y se analizaron mediante secuenciación de Sanger para las deleciones de nimtRNA Lys basadas en este análisis, tres clones individuales, designados como 638-5, 638-9 y 638-10, indicados en naranja, azul y rojo. , respectivamente, fueron seleccionados. C Posteriormente, mediante análisis de RT-PCR comparando wt con células en masa y de clon único, respectivamente, se evaluó la abundancia del transcrito de ARNm de PPFIBP1 que carece del exón 29, empleando cebadores como se indica. D La abundancia de transcrito de ARNm de PPFIBP1 que alberga el exón 29 se determinó mediante RT-qPCR en células wt y se comparó con células diana de CRISPR de clon único y en masa que emplean cebadores como se indica. Células objetivo de un ARN guía que no se une al PPFIBP1 gen (gRNA simulado) se emplearon como un control adicional. La normalización se realizó a GAPDH. mi Además de la inclusión específica del exón 29, se determinó la abundancia general de niveles de ARNm de PPFIBP1 empleando cebadores que se unen al exón 21 y 22 corriente arriba del locus nimtRNA, como se indica. Células objetivo de un ARN guía que no se une al PPFIBP1 gen (gRNA simulado) se emplearon como un control adicional. La normalización se realizó a GAPDH. Los promedios y las desviaciones estándar se determinaron a partir de tres conjuntos independientes de experimentos.

A partir de la mayor parte de las células dirigidas a nimtRNA Lys, se seleccionaron clones unicelulares con el fin de obtener deleciones de nimtRNA Lys inducidas por CRISPR definidas y extendidas. De hecho, a través de estos análisis, identificamos tres clones, que mostraban diferentes deleciones más grandes dentro del gen nimtRNA Lys, que comprende el brazo T (es decir, 638-10) o el brazo T y el tallo aceptor (es decir, 638-5 y 638-9), y presentan deleciones de 12 a 20 y 25 nt, respectivamente (Fig. 5b).

Al comparar las células wt con clones a granel o individuales de células dirigidas a nimtRNA Lys, similar a nuestro ensayo indicador de empalme constitutivo, analizamos el PPFIBP1 ARNm para la inclusión del exón 29, ubicado aguas abajo de nimtARN Lys, mediante el empleo de cebadores que abarcan los bordes exón / exón (Fig. 5c, d). En el curso de estos análisis, detectamos una variante de corte y empalme a granel o clones únicos de células dirigidas a nimtRNA Lys que carecían del exón 29, mientras que esta variante estaba ausente en las células wt (Fig. 5c).

En cuanto al indicador de corte y empalme constitutivo (véase más arriba), en las células dirigidas a nimtRNA Lys en masa, se observó una disminución de aproximadamente el 41% en la inclusión del exón 29 en comparación con las células wt no tratadas. Además, encontramos una disminución en la inclusión del exón 29 para los tres clones individuales, en comparación con las células wt, que van del 19 al 32% respectivamente (Fig. 5d).

Como control adicional, investigamos PPFIBP1 Exón 29 inclusión en células con un nimtRNA Lys sgRNA no relacionado, dirigido a una región intrónica de la SYTL4 gen (designado como gRNA simulado, Fig. 5d), que dio como resultado los mismos niveles de inclusión del exón 29 que los observados para las células wt. El rango de desviaciones estándar de los niveles de inclusión del exón 29 en las células dirigidas a nimtRNA Lys podría deberse potencialmente a la influencia del estrés celular y / o diferencias en la confluencia celular en estas células. Probablemente, el estrés celular o las confluencias celulares variables pueden resultar, por ejemplo, en una alta variabilidad en la expresión de transfactores proteicos que actúan, asociados con un aumento de empalme mediado por nimtRNA. De acuerdo con esta hipótesis, notamos la influencia de estos parámetros también en experimentos previos de transfección transitoria para nuestros ensayos informadores de empalme constitutivos o alternativos.

Dentro de PPFIBP1 gen, el exón 29 está anotado como un exón constitutivo y podría ser esencial para el correcto funcionamiento del gen. Al emplear un conjunto diferente de cebadores, dirigidos al exón 21 y 22 corriente arriba del locus nimtRNA, observamos una regulación negativa general de spliced PPFIBP1 Niveles de ARNm en células dirigidas a nimtARN Lys (Fig. 5e). Una vez más, las células tratadas de forma simulada de ARNg exhibieron niveles idénticos de PPFIBP1 Niveles de ARNm como células wt. Estos hallazgos son consistentes con la disminución de las deleciones inducidas por CRISPR dentro del gen intrónico nimtRNA Lys PPFIBP1 niveles de genes del huésped inhibiendo la inclusión del exón 29.

Las proteínas asociadas al empalme se unen a una transcripción de nimtRNA

Informes anteriores han demostrado que el empalme está modulado por transproteínas que actúan y que se unen a los SRE ubicados dentro de las transcripciones de pre-ARNm [2]. Curiosamente, el análisis computacional de la secuencia de nimtRNA Tyr reveló una puntuación HEXplorer negativa [40] que indica la presencia de posibles sitios de unión de hnRNP y / o hnRNP (archivo adicional 1: Fig. S6). Por lo tanto, para dilucidar qué proteínas nucleares podrían unirse a nimtRNAs, dando como resultado la regulación positiva de empalme / inclusión de exón, realizamos un ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP). Este enfoque utilizó un transcrito de T7 biotinilado que contenía cinco nimtRNA idénticos a los empleados previamente (es decir, YCNAW, ver más arriba) que se incubó con un extracto nuclear generado a partir de células HEK 293T. Proponemos que es probable que los nimtRNA de ratón y humano sean reconocidos por idénticos trans-factores en las células HEK 293T, ya que demostramos que la estructura del nimtRNA, más que la secuencia, es responsable de los efectos observados.

Empleando perlas de estreptavidina, las proteínas asociadas con nimtRNA se aislaron y posteriormente se separaron mediante SDS-PAGE (Fig. 6a). Las bandas que aparecieron predominantemente en el enfoque de extracción de nimtRNA, pero no en el control que carecía de nimtRNA (designado como scrbl), se escindieron del gel y posteriormente se analizaron por LC-MS. Mediante un análisis de la red de interacción proteína-proteína STRING de proteínas identificadas por MS, determinamos una red muy significativa de proteínas que se unen al transcrito nimtRNA (pag & lt 1.0e-16). Un análisis de GO inherente determinó el “procesamiento de ARN” y el “empalme de ARN” como procesos biológicos, y la “vía principal de empalme de ARNm” en el Reactome, se enriqueció significativamente (Fig. 6b). Las 10 proteínas que interactúan con el transcrito de nimtRNA más abundantes se enumeran en la Fig. 6c.

Análisis de interacción de proteínas NimtRNA. a Los transcritos biotinilados que contenían o carecían de nimtRNA se incubaron con extractos de proteínas nucleares. Posteriormente, las proteínas de unión se aislaron y analizaron mediante PAGE, los patrones de bandas diferenciales se escindieron y analizaron por MS. B GO análisis de proteínas que interactúan con la transcripción de nimtRNA. C Las 10 principales proteínas que interactúan con la transcripción de nimtRNA clasificadas por abundancia absoluta. DF Se realizó un ensayo de cambio de movilidad electroforética con concentraciones crecientes de KHDRBS1 que se incubaron con una transcripción del nimtRNA Tyr (D), nimtRNA Tyr delT (mi), o snoRNA SNORD115 (F). La transcripción no unida se indica con un asterisco, los complejos transcripción-proteína se indican con triángulos

De acuerdo con nuestros análisis experimentales, observamos que los sitios de unión de 24 proteínas que funcionan en el empalme o exhiben otras funciones reguladoras (consulte el archivo adicional 6: Tabla S5 para obtener una lista completa) se superponen con las secuencias de nimtRNA, ya sea en líneas celulares HepG2 o K652, o ambos, según lo determinado por el análisis de los datos de ENCODE eCLIP. De estos, G3BP1 y NSUN2 tienen un enriquecimiento de más del doble de sus sitios de unión en nimtRNA. En particular, también se encontró que KHDRBS1 estaba enriquecido para la unión de nimtRNA en este conjunto de datos como se observó en el análisis de MS mediante nuestros experimentos desplegables (ver arriba).

Previamente, Marnef et al. han demostrado que el mtRNA canónico Thr, pero no otros mtRNA, interactúan con PTBP1 en el citosol [47]. En contraste con KHDRBS1, no pudimos recuperar superposiciones de sitios de unión de PTBP1 con loci nimtRNA en nuestro análisis (ver más abajo). Por lo tanto, mediante un ensayo EMSA, también investigamos una posible interacción directa de PTBP1 y nimtRNA Tyr. Con este fin, se marcó radiactivamente una transcripción de nimtRNA Tyr que incluía 10 nucleótidos adicionales en los extremos 5 'y 3', para no parecerse a los extremos de tRNA procesados, y se incubó con concentraciones crecientes de proteína PTBP1. Sin embargo, no observamos la unión específica de PTBP1 a nimtRNA Tyr, lo cual es consistente con los datos de eCLIP informados que no proporcionaron evidencia de que PTBP1 esté directamente asociado con nimtRNAs.

KHDRBS1, también designado como Sam68, se encontró mediante análisis de MS entre las diez proteínas más abundantes que se unen al transcrito que contiene nimtRNA. Por lo tanto, KHDRBS1 pertenece a la familia de proteínas STAR (transducción de señales y activación del metabolismo del ARN) y se ha demostrado previamente que está asociado con varias funciones en el metabolismo del ARNm, incluida la selección del sitio de corte y empalme.

Por tanto, también empleamos el transcrito que contiene nimtRNA Tyr en un análisis EMSA añadiendo cantidades crecientes de proteína KHDRBS1 al transcrito de nimtRNA marcado. De hecho, el aumento de las concentraciones de proteína KHDRBS1 dio como resultado un cambio de movilidad del transcrito de nimtRNA Tyr (Fig. 6d). Curiosamente, en este análisis, se observaron dos bandas distintas en el análisis EMSA empleando KHDRBS1. Como control negativo, se empleó el mutante de deleción del brazo en T de nimtRNA Tyr (designado como nimtRNA Tyr delT), debido a su potencial reducido para aumentar la eficiencia de corte y empalme (ver arriba), se empleó (Fig. 6e). Observamos una unión significativamente reducida de KHDRBS1 al transcrito mutante nimtRNA Tyr delT en comparación con el transcrito nimtRNA Tyr. Como segundo control negativo, se empleó el snoRNA SNORD115 específico del cerebro en el ensayo EMSA, pero se encontró que era deficiente en la unión a KHDRBS1, de acuerdo con la unión de KHDRBS1 específicamente a secuencias canónicas y / o características estructurales de nimtRNAs (Fig. 6f). .


Mol-Bio Final (material nuevo)

-Esto requiere un cribado genético a gran escala para encontrar mutantes en los que la vía sea disfuncional.

Crecer F2. Inducir RN> Ai con dsRNA para GFP
[feed'em E. coli con plásmido que expresa ARN GFP ds] F2 porque la mayoría de los genes son recesivos

-Mutantes animales y vegetales con componentes de ARNi alterados: los propios TRANSPOSONOS del genoma se REAPRENDAN de su estado de heterocromatina cuasipermanente anterior

-let-7 y lin-4 mutantes en C. elegans: desarrollo de gimp debido a una mala sincronización de los eventos de diferenciación celular. & quot Mutaciones heterocrónicas & quot

¡Los genes -let-7 y lin-4 no codifican proteínas! Producen ARN complementarios a otros genes. Contenían & quot; repeticiones invertidas & quot: las transcripciones se pliegan en estructuras de dsRNA

típicamente 24-34 nucleótidos de largo

una enzima similar a la RNAsa que reconoce y digiere dsRNA más largos o las estructuras de tallo bucle formadas por precursores de miRNA

contiene varias proteínas, incluido un miembro de la familia Argonaute además del ARN pequeño

el tallo de pares de bases en el pre-miARN es típicamente

33 nucleótidos y contiene solo unos pocos desajustes, las repeticiones invertidas forman una horquilla. Además, las enzimas lo escinden de una manera que deja un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3 'del dsRNA para que lo reconozca DICER.

-miRNA primario se pliega con estructura de 2 °

Procesamiento en dos pasos mediante 2 ARNas diferentes

-Los mecanismos pueden incluir el bloqueo de la unión inicial del ribo SSU o el ensamblaje completo del ribosoma

-el ARNm sufre una descomposición mediada sin sentido, una vía de mantenimiento celular que existe para deshacerse del ARN de mierda

-necesario "eliminar" Fe ++ cuando [Fe ++] demasiado alto no se necesita bajo [hierro]

-El ARNm de ferritina contiene un elemento de respuesta al hierro (IRE) en su UTR de 5 '

-Inicio de la traducción bloqueado por la unión de la proteína de respuesta al hierro (IRP) a IRE

-IRP regulado por Fe ++: cuando Fe ++ es bajo, IRP se une a IRE y previene el ensamblaje ribosómico por el codón de inicio por impedimento estérico. Se desencadena con Fe ++ elevado

-En el óvulo, los ARNm maternos están reprimidos traslacionalmente.

-La proteína CPEB previene la poliadenilación de longitud completa (poliA)

-5 'final unido por la proteína Maskin bloquea el acceso a los ribosomas y eIF

-Colas de Polia aumentadas después de la fertilización: ARNm & quot; traduccionalmente competente & quot

- La cola de poli (A) es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm. La cola se acorta con el tiempo y, cuando es lo suficientemente corta, el ARNm se degrada enzimáticamente.

- no hecho con la mayoría de las transcripciones, principalmente semillas en orgánulos, protistas

-cambiar la secuencia de un ARN después de su transcripción. Las bases individuales se agregan, eliminan o cambian

La mayoría de los ejemplos: de protista (p. Ej., Tripanosoma) o orgánulos de plantas, pero ocasionalmente se encuentran en ARN eucariotas codificados en el núcleo, incl. humanos

-Hay 2 formas de la proteína: una corta y otra larga.

-proteína larga expresada en el hígado, para el transporte de lípidos en sangre

-corta en el intestino, para la absorción de lípidos

-De hecho, solo hay un gen ApoB.

- ¡& gt500 sitios en mitocondrias!
- 34 sitios en cloroplastos
- Importante para el desarrollo (estos órganos hacen MUCHAS cosas fisiológicas)
-Los factores se vinculan aguas arriba del sitio de edición a menudo específicos del sitio

- Se pueden requerir múltiples gRNA para un mRNA

- El proceso comienza en el extremo 3 'del ARN objetivo más grande

- Cada guía: pares de bases de extremo 5 'para el ARN objetivo, como se encuentran en las posiciones del ARNg opuestas a donde se insertará el Us en el ARNm

- A en el gRNA Proporcionar plantilla para la adición de U

- Dos pasos: 1) la endonucleasa corta en los desajustes, 2) luego se agrega Us por uridilil transferasa terminal, guiado por el emparejamiento de bases con la región de edición de gRNA. Luego, la ligasa se une a los extremos 5 'a 3' del mensaje para formar dsRNA

-en el extremo 5 ', está el ancla, que dirige el ARNg a la región del ARNm que editará, tiene una secuencia que puede emparejarse con una región del mensaje inmediatamente al lado de (3' a) la región que será editado

-en el extremo 3 ', está el tramo poli-U - propuso que esta región sirve para unir ARNg a secuencias ricas en purina en el ARNm corriente arriba de (5' de) la región editada

2) El 3'-OH que cuelga del exón 5 'ataca la unión de empalme 3'

3) Se han completado dos reacciones de transesterificación. Los exones se empalman. Intron se ha ido (desenrollado y degradado)

Iniciado en la unión de empalme 5 ', snipet en el extremo 5' del intrón, enlaces fosfodiéster intercambiados

- Primer ataque nucleofílico por 2 'OH en un & quotA & quot interno

REACCION 1
-activada por 2'-OH de la A conservada en el sitio de la ramificación. Este grupo actúa como un nucleófilo para atacar (SN2) el grupo fosfórico del G conservado en el sitio de empalme 5 ': el enlace fosfodiéster entre el azúcar y el fosfato en la unión 5' entre el intrón y el exón se escinde formando una estructura de lazo

REACCION 2
el exón 5 'es el grupo saliente en esta reacción SN2, y es este grupo 3'-OH recién liberado en este exón 5' el que realiza el ataque nucleofílico en el grupo fosforilo el sitio de empalme 3 '

-media las reacciones de transesterificación involucradas en el empalme de intrones

-al realizar una sola reacción de empalme, el espliceosoma hidroliza 2 moléculas de ATP

el propio intrón se pliega en una conformación específica dentro del ARN precursor y cataliza la química de su propia liberación

Ambos se encuentran principalmente en sistemas & quot; extraños & quot (principalmente en plantas de orgánulos y plastidios de algas y protistas de mito.s y hongos)

Ambos se pliegan en una estructura catalítica compleja de 3 ° para la auto-escisión. ASÍ, la estructura del intrón debe mantenerse (restricciones en la evolución).

permite que el gen dé lugar a más de un producto polipeptídico & quotisoformas & quot

El límite exón-intrón (en el extremo 5 'del intrón) está marcado por el' sitio de empalme 5 'y el límite exón-intrón en el extremo 3' está marcado por el sitio de empalme '3'

Además, una tercera secuencia necesaria para el empalme es el sitio del punto de ramificación que se encuentra completamente dentro del intrón, generalmente cerca del extremo 3 'y es seguido por un tracto de polipirimidina (A)

- [O, recuerde, puede servir como un mecanismo para regular los niveles de ARNm, para hacer que la versión de un ARN sea menos (o más) estable que otra]

-Mechansim: por lo general, se trata de elegir la unión de empalme de 3 '.

-Thussssss, la elección del punto de ramificación se puede utilizar para diversificar los productos proteicos de un solo gen. O para regular la expresión de proteínas

denominados colectivamente pequeños ARN nucleares (snRNA)

Hay 6 snRNP (U1 snRNP, U2 snRNP,. U6)

Cada snRNP contiene un snRNA diferente (U1 snRNA, U2 snRNA, etc.)

Y cada uno contiene un montón de proteínas (

-La composición exacta difiere en las diferentes etapas de la reacción de empalme: diferentes snRNP van y vienen en diferentes momentos, cada uno de los cuales realiza funciones particulares en la reacción

U1, U2 enlazan la unión 5 'y el punto de ramificación (U2 enlaza el punto de ramificación después de BBP)

U5, U6, U2 forman un complejo activo.

Intron está plegado para unir sitios importantes.

U6 se une al sitio de empalme 5 ', U5 se une al sitio 3'. U2 está en el punto de ramificación. U2 y U6 interactúan para formar un sitio activo. U1 desplazado

Lariat formado, exones empalmados.

U2 snRNA se une al consenso de punto de ramificación [precedido por BBP y amp U2AF)

U2 y amp U6 se ensamblan entre sí mediante emparejamiento de bases

Los diferentes tipos de snRNA de nosotros se unen a diferentes partes del mRNA

2) entonces U2 snRNP se une al sitio de ramificación, con la ayuda de U2AF, y desplaza el emparejamiento de BBP-base entre U2 snRNA y el sitio de ramificación es tal que el residuo del sitio de ramificación A se extruye del tramo resultante de ARN ds-helicoidal como un solo nucleótido abultado y no está emparejado y está disponible para alcanzar con el sitio de empalme de 5 '

3) luego, los snRNP de U4, U6 y amp U5 se unen al complejo para unir los tres sitios de empalme (U4 y amp U6 se mantienen unidos mediante el emparejamiento de bases complementarias entre sus componentes de ARN y U5 se asocia más libremente a través de interacciones proteína-proteína

4) a continuación, U1 se va y U6 lo reemplaza en el sitio de empalme de 5 '

5) para desencadenar la catálisis, se libera U4 del complejo, lo que permite que U6 interactúe con U2 a través del emparejamiento de bases ARN: ARN, produciendo el sitio activo, lo que también asegura que el sustrato ARN esté correctamente posicionado para actuar sobre él.


¿Por qué las construcciones que atrapan genes deben integrarse en intrones y no en exones? - biología

Suponga que está intentando insertar un gen en un plásmido. Alguien le da una preparación de ADN genómico que ha sido cortado con la enzima de restricción X. El gen que desea insertar tiene sitios en ambos extremos para cortar con la enzima de restricción Y. Tiene un plásmido con un solo sitio para Y, pero no para X Su estrategia debería ser A) insertar los fragmentos cortados con X directamente en el plásmido sin cortar el plásmido. B) cortar el plásmido con la enzima de restricción X e insertar los fragmentos cortados con Y en el plásmido. C) cortar el ADN nuevamente con la enzima de restricción Y e insertar estos fragmentos en el plásmido cortado con la misma enzima. D) cortar el plásmido dos veces con la enzima de restricción Y y ligar los dos fragmentos en los extremos de los fragmentos de ADN cortados con la enzima de restricción X. E) cortar el plásmido con la enzima X y luego insertar el gen en el plásmido.

¿Cuál es la función enzimática de las enzimas de restricción? A) para agregar nuevos nucleótidos a la cadena en crecimiento de ADN B) para unir nucleótidos durante la replicación C) para unir nucleótidos durante la transcripción D) para escindir ácidos nucleicos en sitios específicos E) para reparar roturas en las cadenas principales de azúcar-fosfato

¿Cómo protege una célula bacteriana su propio ADN de las enzimas de restricción? A) agregar grupos metilo a las adeninas y citosinas B) usar ADN ligasa para sellar el ADN bacteriano en un círculo cerrado C) agregar histonas para proteger el ADN de doble hebra D) formar ʺ extremos pegajososʺ del ADN bacteriano para evitar que la enzima se adhiera E) reforzando la estructura del ADN bacteriano con enlaces fosfodiéster covalentes

¿Cuál es la secuencia de pasos más lógica para empalmar ADN extraño en un plásmido e insertar el plásmido en una bacteria? I. Transformar bacterias con una molécula de ADN recombinante. II. Cortar el ADN plasmídico usando enzimas de restricción. III. Extrae el ADN plasmídico de las células bacterianas. IV. Une con hidrógeno el ADN del plásmido a los fragmentos de ADN que no son del plásmido. V. Utilice ligasa para sellar el ADN plasmídico al ADN no plasmídico. A) I, II, IV, III, VB) II, III, V, IV, IC) III, II, IV, V, ID) III, IV, V, I, II E) IV, V, I, II , III

¿Por qué proceso a menudo se identifican las bacterias que contienen plásmidos recombinantes? A) examinar las células con un microscopio electrónico B) usar trazadores radiactivos para localizar los plásmidos C) exponer las bacterias a un antibiótico que mata las células que carecen del plásmido resistente D) eliminar el ADN de todas las células en un cultivo para ver qué células tienen plásmidos E) producir anticuerpos específicos para cada bacteria que contiene un plásmido recombinante

que contiene EcoRI y un plásmido bacteriano que porta dos genes que confieren resistencia a ampicilina y tetraciclina. El plásmido tiene un sitio de reconocimiento para EcoRI ubicado en el gen de resistencia a la tetraciclina. Esta mezcla se incuba durante varias horas, se expone a la ADN ligasa y luego se agrega a las bacterias que crecen en un caldo nutritivo. Las bacterias se dejan crecer durante la noche y se esparcen en una placa utilizando una técnica que produce colonias aisladas que son clones del original. Las muestras de estas colonias se cultivan luego en cuatro medios diferentes: caldo nutritivo más ampicilina, caldo nutritivo más tetraciclina, caldo nutritivo más ampicilina y tetraciclina y caldo nutritivo sin antibióticos. 7) Las bacterias que contienen el plásmido, pero no el gen eucariota, crecerían A) en el caldo nutritivo más ampicilina, pero no en el caldo que contiene tetraciclina. B) solo en el caldo que contiene ambos antibióticos. C) en el caldo que contiene tetraciclina, pero no en el caldo que contiene ampicilina. D) en los cuatro tipos de caldo. E) en el caldo nutritivo sin antibióticos únicamente.

Un gen eucariota tiene "extremos pegajosos" producidos por la endonucleasa de restricción EcoRI. El gen se agrega a una mezcla que contiene EcoRI y un plásmido bacteriano que porta dos genes que confieren resistencia a ampicilina y tetraciclina. El plásmido tiene un sitio de reconocimiento para EcoRI ubicado en el gen de resistencia a la tetraciclina. Esta mezcla se incuba durante varias horas, se expone a la ligasa de ADN y luego se agrega a las bacterias que crecen en un caldo nutritivo. Las bacterias se dejan crecer durante la noche y se esparcen en una placa utilizando una técnica que produce colonias aisladas que son clones del original. Las muestras de estas colonias se cultivan luego en cuatro medios diferentes: caldo nutritivo más ampicilina, caldo nutritivo más tetraciclina, caldo nutritivo más ampicilina y tetraciclina y caldo nutritivo sin antibióticos. ) solo el caldo nutritivo. B) solo el caldo de nutrientes y el caldo de tetraciclina. C) el caldo de nutrientes, el caldo de ampicilina y el caldo de tetraciclina. D) los cuatro tipos de caldo. E) el caldo de ampicilina y el caldo nutritivo.

Un gen eucariota tiene "extremos pegajosos" producidos por la endonucleasa de restricción EcoRI. El gen se agrega a una mezcla que contiene EcoRI y un plásmido bacteriano que porta dos genes que confieren resistencia a ampicilina y tetraciclina. El plásmido tiene un sitio de reconocimiento para EcoRI ubicado en el gen de resistencia a la tetraciclina. Esta mezcla se incuba durante varias horas, se expone a la ligasa de ADN y luego se agrega a las bacterias que crecen en un caldo nutritivo. Las bacterias se dejan crecer durante la noche y se esparcen en una placa utilizando una técnica que produce colonias aisladas que son clones del original. Las muestras de estas colonias se cultivan luego en cuatro medios diferentes: caldo nutritivo más ampicilina, caldo nutritivo más tetraciclina, caldo nutritivo más ampicilina y tetraciclina, y caldo nutritivo sin antibióticos. ¿En qué medio crecen las bacterias que no absorben plásmidos? A) el caldo de nutrientes solamente B) el caldo de nutrientes y el caldo de tetraciclina C) el caldo de nutrientes y el caldo de ampicilina D) el caldo de tetraciclina y el caldo de ampicilina E) los cuatro caldos

10) Un problema principal al insertar un gen de mamífero no modificado en un plásmido bacteriano, y luego obtener ese gen expresado en bacterias, es que A) los procariotas usan un código genético diferente al de los eucariotas. B) las bacterias traducen únicamente mensajes policistrónicos. C) las bacterias no pueden eliminar los intrones eucariotas. D) la ARN polimerasa bacteriana no puede hacer que el ARN sea complementario al ADN de los mamíferos. E) el ADN bacteriano no se encuentra en un núcleo delimitado por una membrana y, por lo tanto, es incompatible con el ADN de los mamíferos.

Un gen que contiene intrones puede acortarse (pero seguir siendo funcional) con fines de ingeniería genética mediante el uso de A) ARN polimerasa para transcribir el gen. B) una enzima de restricción para cortar el gen en trozos más cortos. C) transcriptasa inversa para reconstruir el gen a partir de su ARNm. D) ADN polimerasa para reconstruir el gen a partir de su producto polipeptídico. E) ADN ligasa para juntar fragmentos del ADN que codifica un polipéptido en particular

¿Por qué las células de levadura se utilizan con frecuencia como huéspedes para la clonación? A) forman colonias fácilmente B) pueden eliminar exones del ARNm. C) no tienen plásmidos. D) son células eucariotas E) solo las células de levadura permiten la clonación del gen

Los fragmentos de ADN que forman una biblioteca genómica generalmente están contenidos en A) plásmidos recombinantes de bacterias. B) ARN viral recombinante. C) pozos individuales. D) Híbridos de ADN-ARN E) Células eucariotas radiactivas

¿En qué se diferencia una biblioteca genómica de una biblioteca de ADNc? A) Una biblioteca genómica contiene solo secuencias no codificantes, mientras que una biblioteca de ADNc contiene solo secuencias codificantes. B) Una biblioteca genómica varía, dependiendo del tipo de célula utilizada para fabricarla, mientras que el contenido de una biblioteca de ADNc no. C) Se puede preparar una biblioteca genómica usando una enzima de restricción y ADN ligasa solamente, mientras que una biblioteca de ADNc requiere ambos, así como la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa. D) La biblioteca genómica se puede replicar pero no transcribir. E) La biblioteca genómica contiene solo los genes que pueden expresarse en la célula.

¿Cuáles de los siguientes elementos contienen los cromosomas artificiales de levadura? A) solo centrómero B) solo telómeros C) solo origen de replicación D) centrómeros y telómeros solamente E) centrómero, telómeros y un origen de replicación

¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor la secuencia completa de pasos que ocurren durante cada ciclo de PCR? 1. Los cebadores se hibridan con el ADN diana. 2. La mezcla se calienta a una temperatura alta para desnaturalizar el ADN diana bicatenario. 3. Se agrega ADN polimerasa fresca. 4. La ADN polimerasa extiende los cebadores para hacer una copia del ADN diana. A) 2, 1, 4 B) 1, 3, 2, 4 C) 3, 4, 1, 2 D) 3, 4, 2 E) 2, 3, 4

Un investigador necesita clonar una secuencia de parte de un genoma eucariota para expresar la secuencia y modificar el producto polipeptídico. ¿Podría satisfacer estos requisitos utilizando cuál de los siguientes vectores? A) un plásmido bacteriano B) BAC para acomodar el tamaño de la secuencia C) un bacteriófago modificado D) un cromosoma humano E) un YAC con enzimas celulares apropiadas

Un estudiante desea clonar una secuencia de ADN de

200 kb. ¿Qué vector sería apropiado? A) un plásmido B) un bacteriófago típico C) un BAC D) un virus vegetal E) un polipéptido grande

¿Cuál de las siguientes fue la primera célula cuyo genoma completo fue secuenciado? A) H. influenzae en 1995 B) H. sapiens en 2001 C) arroz en 1955 D) virus del mosaico del tabaco E) VIH en 1998

La secuenciación de un genoma completo, como el de C. elegans, un nematodo, es más importante porque A) permite a los investigadores usar la secuencia para construir un nematodo "mejor", resistente a enfermedades. B) permite la investigación sobre un grupo de organismos que normalmente no nos preocupan mucho. C) el nematodo es un buen modelo animal para probar curas para enfermedades virales. D) es probable que una secuencia que tiene una función particular en el nematodo tenga una función estrechamente relacionada en los vertebrados. E) es probable que una secuencia que no tiene intrones en el genoma del nematodo haya adquirido los intrones de organismos superiores.


Secuencias de intrones que estimulan la expresión génica en Arabidopsis

Los motivos relacionados aumentan fuertemente la expresión génica cuando se agregan a un intrón ubicado en secuencias codificantes.

Abstracto

Muchos intrones aumentan en gran medida la expresión génica a través de un mecanismo que sigue siendo difícil de alcanzar. Un obstáculo para comprender la mejora mediada por intrones (IME) ha sido la dificultad de localizar las secuencias de intrones específicas responsables de impulsar la expresión porque son redundantes, dispersas y degeneradas. Anteriormente utilizamos el algoritmo IMEter de dos formas independientes para identificar dos motivos (CGATT y TTNGATYTG) que son candidatos para participar en IME en Arabidopsis. Aquí mostramos que ambos motivos son suficientes para aumentar la expresión. Un intrón que tiene poca influencia sobre la expresión se convirtió en uno que aumentó la acumulación de ARNm 24 veces y la actividad de la enzima informadora 40 veces con respecto al control sin intrones mediante la introducción de 11 copias del motivo TTNGATYTG más activo. Este grado de estimulación es dos veces mayor que el del más fuerte de los 15 intrones naturales previamente probados en el mismo gen informador. Aunque los motivos CGATT y TTNGATYTG aumentaron cada uno la expresión, y CGATT coincide con el núcleo NGATY del motivo más largo, la combinación de los motivos para hacer TTCGATTTG redujo la capacidad estimulante del motivo TTNGATYTG. Se usaron sustituciones adicionales para probar la contribución al IME de otros residuos en el motivo TTNGATYTG. La verificación de que estos motivos están activos en IME mejorará nuestra capacidad para predecir la capacidad estimulante de los intrones, diseñar cualquier intrón para aumentar la expresión a un nivel deseado y explorar el mecanismo de IME mediante la búsqueda de factores que podrían interactuar con estas secuencias.

Esta es una vista previa del contenido de la suscripción, acceda a través de su institución.


Fusiones de genes informadores *

C. elegans tiene características distintivas que predestinan a este organismo para la visualización de patrones de expresión génica utilizando los genes indicadores de la proteína fluorescente verde (GFP Chalfie et al., 1994) y & # 946 GAL (LacZ Fire et al., 1990). La transparencia de C. elegans permite el análisis microscópico en vivo sin disección animal.Además, la relativa delgadez de los animales (aproximadamente 75 & # 956 m de sección transversal) a menudo alivia la necesidad de microscopía confocal de alta potencia. Finalmente, las técnicas de transformación de la línea germinal permiten la generación rápida de animales transgénicos.

los E. coli gene LacZ , que codifica la & # 946 -galactosidasa, se utilizó por primera vez para el análisis de expresión génica de una sola célula en C. elegans en 1990 (Harrison et al., 1990) y fue el gen informador de elección hasta la introducción de GFP en 1994 (Chalfie et al., 1994). La principal ventaja de GFP sobre LacZ es la capacidad de visualizar la expresión del gen indicador en animales vivos en lugar de en preparaciones fijas. Por lo tanto, la GFP se puede usar más fácilmente para una variedad de propósitos que incluyen (1) análisis de patrones de expresión, (2) disección de cis -secuencias reguladoras, (3) localización de proteínas, (4) visualización de la anatomía celular (por ejemplo, neuroanatomía), (5) identificación celular y (6) visualización de procesos celulares y fisiológicos (Chalfie et al., 1994 Hobert y Loria, 2005). Por estas razones, los transgenes informadores de GFP se han convertido en la herramienta principal para el análisis de expresión génica en C. elegans . Nos centraremos en GFP a partir de ahora, teniendo en cuenta que en muchos casos LacZ podría sustituir a GFP. En este capítulo, describimos protocolos para la generación de construcciones informadoras de GFP y proporcionamos varias consideraciones técnicas.

1.2. Categorías de construcciones de genes informadores

Un aspecto crucial de los estudios de expresión génica es elegir un tipo de informador adecuado para los fines del experimento. Cada informador difiere en la cantidad de información que proporciona sobre la expresión de un gen. Los tres tipos generales de construcciones de genes informadores son: 1) informadores de transcripción, 2) informadores de traducción y 3) " smg-1 informadores transcripcionales basados ​​en "(Figura 1).

Reporteros transcripcionales consisten en un fragmento de promotor de un gen de interés que impulsa GFP (Figura 1A). Típicamente, los fragmentos de promotores de unas pocas kilobases inmediatamente aguas arriba del codón de inicio contienen una porción significativa del cis -información reguladora necesaria para proporcionar un patrón de expresión tentativo del gen endógeno en estudio.

Figura 1. Arquitectura de construcciones de genes informadores. (A) Reportero transcripcional, (B) reportero traduccional, (C) " smg-1 informador basado en ". Las secuencias de ADN no codificantes se indican con líneas negras. Las secuencias de exones se representan como recuadros azules. La GFP se muestra en verde.

Reporteros traslacionales son fusiones de genes en marco entre GFP y un gen de interés (Figura 1B). Idealmente, un informador de traducción incluye el locus genómico completo de un gen (región 5 & # 8242 corriente arriba, exones, intrones, 3 & # 8242 UTR). La GFP se puede insertar en cualquier punto del marco de lectura abierto, preferiblemente en un sitio que no interrumpa la función o topología de la proteína.

smg-1 - reporteros basados son reporteros transcripcionales que tienen como objetivo incluir a todos cis -información reguladora de un gen. GFP, incluido su codón de parada, se inserta entre el promotor y el primer exón (Figura 1C). Por tanto, la transcripción del transgén está controlada por el cis -secuencias reguladoras encontradas corriente arriba, intrónicamente o corriente abajo del gen de interés, pero sólo se traduce GFP. Sin embargo, la inclusión del codón de terminación de GFP se dirige al ARNm producido para la descomposición del ARNm mediada sin sentido (Pulak y Anderson, 1993 Wilkinson et al., 1994 Mango, 2001). Por lo tanto, estos reporteros deben inyectarse en un trasfondo genético deficiente para la desintegración del ARNm mediada sin sentido, como smg-1 (Mango, 2001).

1.3. Secuencias que se incluirán en construcciones informadoras

los C. elegans el genoma es muy compacto. La mayoría cis -La información reguladora se encuentra dentro de varias kilobases inmediatamente aguas arriba de un gen. Sin embargo, existe un número creciente de ejemplos en los que se cis -se han encontrado secuencias reguladoras dentro de intrones (especialmente genes que contienen intrones grandes Wenick y Hobert, 2004) o la UTR 3 & # 8242 (Wightman et al., 1993). Más raro aún cis Se han encontrado secuencias reguladoras a distancias inusualmente largas (más allá de los genes flanqueantes aguas arriba o aguas abajo) del gen de interés (Conradt y Horvitz, 1999 Wenick y Hobert, 2004).

Dejando a un lado los ejemplos extremos, las construcciones de genes informadores más comunes simplemente incluyen una gran parte de la secuencia intergénica 5 & # 8242 (informador transcripcional). Idealmente, los reporteros deberían contener tanto cis -secuencia reguladora, desde el gen ascendente al descendente, como sea técnicamente posible (traslacional y smg-1 -reporteros basados ​​en).

Durante la última década, ha quedado claro que los microARN desempeñan un papel importante en la regulación génica postranscripcional (a través de 3 & # 8242 UTR Ambros, 2004). Por lo tanto, los informadores transcripcionales, que no incluyen la UTR endógena 3 & # 8242, pueden no representar con precisión los patrones de expresión de genes regulados por microARN.

1.4. Proyectos de expresión génica en todo el genoma

Dada la disponibilidad de la completa C. elegans secuencia del genoma, varios grupos han emprendido proyectos de expresión génica en todo el genoma. Tres grupos están generando sistemáticamente fusiones de promotor :: GFP y documentando los patrones de expresión resultantes. Los resultados y la información adicional están disponibles a través de sus respectivos sitios web:

Base de datos de patrones de expresión de Hope Lab: http://bgypc059.leeds.ac.uk/

1.5. Consideraciones tecnicas

1.5.1. Comentarios sobre diferentes tipos de reporteros

Reporteros transcripcionales se puede utilizar para establecer rápidamente un patrón de expresión tentativo para un gen de interés. La fusión de secuencias ascendentes 5 & # 8242 a GFP se puede realizar de varias formas y, por lo general, no presenta ningún desafío técnico. Comparado con traslacional y smg-1 Sin embargo, las fusiones de promotores basados ​​en reporteros pueden no dar una representación completa del patrón de expresión real de un gen, tanto espacial como temporalmente.

Reporteros traslacionales puede proporcionar una representación fiel del patrón de expresión de un gen porque en tales construcciones informadoras se incluye información reguladora adicional que puede estar presente en intrones o UTR 3 & # 8242. Cuando hay mutantes disponibles, se pueden utilizar informadores de traducción en experimentos de rescate. El rescate exitoso del fenotipo mutante apoya la relevancia funcional de los patrones de expresión resultantes. Además, las fusiones de genes de traducción también pueden proporcionar información sobre la localización subcelular y los aspectos temporales de la regulación de genes. Las fusiones traslacionales pueden parecer menos brillantes que las fusiones transcripcionales debido a la inestabilidad intrínseca de la proteína fusionada a GFP. Sin embargo, la inserción de GFP por vía intragénica a veces puede alterar la función de la proteína o incluso conducir a la toxicidad del producto quimérico. Finalmente, los informadores de traducción que exhiben localización subcelular pueden dificultar la identificación del tipo de célula porque la forma de la célula puede no ser visible (especialmente para las neuronas).

reporteros basados ​​en smg-1 representar patrones de expresión con tanta precisión como los reporteros traslacionales. La GFP producida por estos informadores no está localizada, lo que puede facilitar la identificación del tipo de célula. La mayor desventaja de smg-1 reporteros basados ​​en smg-1 mutación en el trasfondo genético.

1.5.2. Vector columna vertebral

Una gran cantidad de esqueletos de vectores y derivados de genes informadores están disponibles en el Fire Vector Kit construido por el laboratorio de Andrew Fire. Además de los elementos estructurales básicos de los vectores de expresión (sitio de clonación múltiple, intrón artificial, gen indicador, 3 & # 8242 UTR ver Clonación), algunos vectores se han diseñado para contener señales de localización nuclear, dirección de membrana o dirección mitocondrial. Los vectores, sus archivos de secuencia, descripciones detalladas e instrucciones para usar estos vectores están disponibles en: http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=showcol&colid=1 o ftp://ftp.wormbase.org/pub / wormbase / datasets / fire_vectors. Algunos de los vectores más útiles del Fire Vector Kit se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Backbones de vectores útiles: variantes de reportero de GFP / LacZ / DsRed

Vector Descripción Localización
pPD95,75 (L2463) GFP [S65C] Ninguno
pPD16,43 LacZ 1xNLS Núcleo
pDsRed DsRed Clontech -
pDsRed2 DsRed2 Clontech -
pPD135.83 (L4796) GFP [S65C] 2xSV40-NLS Núcleo y núcleo
pPD136.15 (L4809) GFP [S65C] 3xSV40-NLS Núcleo y núcleo gt
pPD133.48 (L4663) CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] 1xSV40-NLS Núcleo y citoplasma gt
pPD133.45 (L4660) CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] :: lacZ 1xSV40-NLS Solo núcleo
pPD132.112 (L4643) YFP [S65G V68A S72A T203Y] 1xSV40-NLS Núcleo y citoplasma gt
pPD133.63 (L4671) YFP [S65G V68A S72A T203Y] :: lacZ 1xSV40-NLS Solo núcleo
pPD122.39 (L4058) PAT-3-GFP [S65C] PAT-3 dominio transmembrana Membrana de plasma
pPD133.54 (L4665) Mt :: CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] Mitocondrias
pPD133.60 (L4667) Mt :: YFP [S65G V68A S72A T203Y] Mitocondrias

El kit Fire Vector no incluye variantes de proteínas rojas fluorescentes, pero DsRed y DsRed2 de Clontech se han sustituido con éxito por GFP en transgenes informadores en C. elegans (por ejemplo, Wenick y Hobert, 2004).

1.6. Sistemas de expresión de GFP multicolor

La disponibilidad de variantes de GFP con espectros de emisión no superpuestos (Cyan-FP, Yellow-FP) ha abierto la posibilidad de etiquetado multicolor de C. elegans células en vivo . Las variantes de CFP e YFP se pueden separar utilizando conjuntos de filtros apropiados (Miller et al., 1999). Recientemente, se han utilizado con éxito combinaciones de tres colores (CFP, YFP, DsRed) para etiquetar clases separadas de neuronas (Hutter, 2003).

1.7. Artefactos comunes

De poca importancia para el experimentador, pero fascinante por derecho propio, es la autofluorescencia exhibida por los gránulos intestinales y los nucléolos de las células hipodérmicas en C. elegans . Estos fenómenos no son el resultado de una expresión transgénica reportero aberrante, sino que ocurren naturalmente en C. elegans .

A diferencia de la autofluorescencia no relacionada con GFP, los indicadores de GFP a veces pueden inducir una fluorescencia no específica en las células del intestino posterior. Se cree que este efecto observado es una consecuencia indirecta de la unc-54 3 & # 8242 UTR, que se utiliza en la mayoría de los vectores del Fire Kit (consulte http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=showcol&colid=1 o ftp://ftp.wormbase.org/pub/ wormbase / datasets / fire_vectors).

1.8. Maduración de fluoróforos de proteínas fluorescentes

Los estudios de regulación temporal de genes se basan en la capacidad de detectar fluctuaciones en la expresión génica dentro de una ventana de tiempo estrecha. Un inconveniente de utilizar proteínas fluorescentes para tales experimentos es el tiempo necesario para la maduración del fluoróforo.

Estudios realizados en E. coli he encontrado la t0.5 para que la maduración sea de 27 minutos para la variante S65T de GFP (usada en pPD95.75 y sus derivados Heim et al., 1995). Evidencia de C. elegans Los experimentos sugieren que GFP S65T madura a un ritmo similar en el gusano, al igual que las variantes de CFP e YFP. Las proteínas rojas fluorescentes, DsRed y DsRed2, maduran significativamente más lentamente. Sin embargo, se han generado nuevas variantes de DsRed que son más brillantes, maduran más rápido (Shaner et al., 2004) y presentan fluorescencia en C. elegans (Etchberger, inédito).

A veces, la expresión de promotores débiles puede requerir una acumulación prolongada de proteína antes de que se detecte una señal fluorescente. en vivo . En estos casos, la tinción de anticuerpos puede revelar la expresión de la proteína fluorescente antes de que se logre una señal fluorescente detectable.

1.9. Marcadores de coinyección

Se encuentran disponibles varios marcadores de coinyección estándar para etiquetar matrices extracromosómicas que contienen genes informadores en C. elegans . El marcador más utilizado es rol-6 (su1006) (Kramer y col., 1990). rol-6 (su1006) es un alelo dominante que puede usarse para etiquetar matrices en la mayoría de los antecedentes genéticos, lo que permite una fácil selección y mantenimiento de líneas transgénicas. Los marcadores de inyección alternativos que requieren antecedentes de mutantes específicos incluyen: pha-1 , dpy-20 , unc-4 , lin-15 (ver sección WormMethods: Transformación y microinyección). En particular, los reporteros de GFP, como ceh-22 :: gfp , unc-122 :: gfp , elt-2 :: gfp , y ttx-3 :: gfp se han utilizado como marcadores de inyección por derecho propio.

1.10. Comentario final

Los transgenes informadores pueden no representar el patrón de expresión completo de un gen, pero aún proporcionan hipótesis comprobables sobre el sitio de la función del gen. Se ha convertido en estándar complementar estas hipótesis con experimentos de rescate específicos de tipo celular, análisis de mosaico y tinción de anticuerpos. Para estudios de embriones tempranos, en el lugar la hibridación también puede ser informativa.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas y condiciones de cultivo.

los C. reinhardtii de tipo salvaje 2137 y el intrón-psbA Se utilizaron cepas IL (26), la última se obtuvo de Udo Johanningmeier (Universidad Martin Luther, Halle-Wittenberg, Alemania). Las células se mantuvieron en placas de agar 2 & # x00025 que contenían medio Tris-acetato-fosfato (TAP) (19) más 100 & # x003 bcg de ampicilina por ml.

Construcción de plásmidos.

La construcción del plásmido pb4c110, que contiene un 7-kb BamHI fragmento de C. reinhardtii ADN de cloroplasto que incluye el marcador de resistencia a espectinomicina spr-u-1-6-2 en los 16 rrn gen, ha sido descrito (37). Los plásmidos utilizados para estudiar la localización de Cr.psbA2 fueron creados subclonando el XbaYo fragmento del psbA gen (Fig. & # x200B (Fig.1), 1), obtenido del plásmido pGEM.R14.2 (20), en el XbaPlásmido atpX digerido con I (16) en ambas orientaciones. Estos plásmidos se denominaron atpX-i2S (sentido) y atpX-i2A (antisentido), respectivamente.

Mapa esquemático del C. reinhardtii psbA gen y de fragmentos clonados utilizados para estudiar la localización de los intrones 2 y 4. (A) Mapa de la psbA gene. Se indica el marcador de resistencia DCMU en el exón 5. La flecha indica la dirección de la transcripción. (B a F) Insertos de clones de plásmido, cuyos nombres se indican a la derecha. Aquellos designados con & # x00394 tienen la parte del Cr.psbA4 ORF entre el EcoNI y MluI sitios eliminados. S y A se refieren a sentido y antisentido, respectivamente. Los sitios de restricción son los siguientes: B, BstEII E, EcoNI K, KpnESTOY, MluYo R, EcoRI X, XbaI.

Para Cr.psbA4, los plásmidos de partida fueron pKS4, que contiene el XbaI-KpnYo fragmento de psbA, y pBX4, que contiene el BstEII-XbaI (Fig. & # X200B (Fig.1 1 y referencia 23). Estos ADN también contenían la mutación DCMU4 en el exón 5, que proporciona resistencia a 3- (3,4-diclorofenil) -1,1-dimetilurea (DCMU ) (13). El inserto pBX4 se obtuvo en el vector atpX como sigue. PKS4 se escindió con BstEII, el extremo se llena con polimerasa Klenow y luego se digiere con XbaI. El fragmento de 2,1 kb purificado en gel se ligó en atpX, que se había digerido con BamHola o PstI, final lleno con fragmento de polimerasa de Klenow, y luego escindido con XbaYo clonando en BamEl atpX cortado con HI produjo el plásmido atpX-i4S (sentido) y la clonación en PstEl atpX cortado con I produjo el plásmido atpX-i4A (antisentido). Se eliminó un fragmento de 544 pb del intrón ORF tanto de pKS4 como de pBX4 mediante digestión con EcoNI y MluTermino de llenar con polimerasa de Klenow, purificación del fragmento más grande y religación. Los plásmidos resultantes, que contienen un ORF severamente truncado, se denominaron pKS4. & # X00394 y pBX4. & # X00394, respectivamente (Fig. & # X200B (Fig. 11).

Plásmidos con Cr.psbA4 borrados progresivamente del extremo 5 & # x02032 se construyeron de la siguiente manera. El plásmido pBX4 se digirió con EcoRI y PstYo, y el ca. Se ligó un fragmento purificado en gel de 1.430 pb en EcoRI y PstPBluescript SK digerido con I para dar pRP4. El plásmido pRP4 se digirió con HincII y PstYo, y el ca. El fragmento purificado en gel de 1.230 pb se clonó en HincII y PstPBluescript SK digerido con I para dar pHP4. pRP4 también se digirió con Sspyo y PstYo, y el ca. El fragmento purificado en gel de 1,120 pb se clonó en HincII- y PstPBluescript SK digerido con I para dar pSP4. Se usó PCR para un mayor emparejamiento del intrón. Para obtener productos de PCR que comienzan en el bp 564 o 626 del intrón, se usaron los oligonucleótidos 206 y 207, respectivamente, junto con el oligonucleótido 100 (ver Tabla & # x200B Tabla 1) 1) y pBX4 como molde. Pfu Se utilizó ADN polimerasa (Stratagene) para maximizar la precisión de la amplificación de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Los respectivos productos de PCR se purificaron en gel y se digirieron con PstYo, y los fragmentos más grandes fueron clonados en HincII- y PstPBluescript SK cortado con I para dar p564P4 y p626P4, respectivamente, se usaron al menos dos clones de cada plásmido en los experimentos de localización. Los insertos de pHP4, pSP4, p564P4 (2) y p626P4 (2) también se clonaron en pUC18 y pUC19 mediante digestión con Pstyo y KpnI, purificación en gel y ligadura en PstYo y KpnADN de vector digerido con I. Los plásmidos resultantes se denominaron pHP4-pUC18, pSP4-pUC18, p564P4-pUC18 (2), p626P4-pUC18 (2), pHP4-pUC19, pSP4-pUC19, p564P4-pUC19 (2) y p626P4-pUC19 (2).

TABLA 1

Oligonucleótidos utilizados como cebadores dentro del psbA gene

OligonucleótidoLocalizaciónDirecciónPosiciones a Secuencia
39 & # x02002Intrón 2Marcha atrás120 & # x020131025 & ​​# x02032-TTGCCCGCAGGGGAAGGAG-3 & # x02032
64 & # x02002Exón 1Hacia adelante387 & # x020134045 & ​​# x02032-TCAGTATTCATCATCGCT-3 & # x02032
99 & # x02002Exón 4Hacia adelante182 & # x020132055 & ​​# x02032-TAGGTACC b GTTACCGTTTCGGTCAAGAAGAAG-3 & # x02032
100Exón 5Marcha atrás78 & # x02013535 & ​​# x02032-TAGGAT c CCAAGCAGCTAAGAAGAAGTGTAATG-3 & # x02032
116Intrón 4Marcha atrás287 & # x020132665 & ​​# x02032-CTTAGTGAAGGTTAGCTCGTAT-3 & # x02032
118Exón 2Hacia adelante127 & # x020131505 & ​​# x02032-GACGAGTGGTTATACAACGGTGGT-3 & # x02032
136Exón 3Marcha atrás48 & # x02013285 & ​​# x02032-AGCGATCCATGGACGCATACC-3 & # x02032
161Intrón 4Marcha atrás664 & # x020136355 & ​​# x02032-TGAAATTAGTTCGTGATTACGAACCTGAGC-3 & # x02032
176Exón 3Hacia adelante114 & # x020131405 & ​​# x02032-TTCATTCTCTGACGGTATGCCTTTAGG-3 & # x02032
206Intrón 4Hacia adelante564 & # x020135905 & ​​# x02032-CCTTACTGGTGTAAATAACATTAAATC-3 & # x02032
207Intrón 4Hacia adelante626 & # x020136525 & ​​# x02032-GCTAATATAGCTCAGGTTCGTAATCAC-3 & # x02032
276Intrón 4Marcha atrás627 & # x020135985 & ​​# x02032-GCATAAAATTGTATTGTTTTTTTTGTAGTC-3 & # x02032

Transformación de cloroplasto.

El ADN se introdujo en C. reinhardtii cloroplastos por bombardeo de partículas (2, 27) utilizando un aparato impulsado por helio (Bio-Rad He 1000). Las condiciones eran 28,5 pulg.de vacío, uso de un disco de ruptura de 1,100 lb / pulg.2, la placa en el estante 4 y el macroportador en la posición 2. Las células receptoras se cultivaron en TAP líquido a 2 & # x000d7 10 6 a 4 & # x000d7 10 6 células / ml, se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a 1 & # x000d7 10 8 células / ml en TAP. Luego, se mezclaron 0,5 ml de células (& # x0223c5 & # x000d7 10 7 células) con 0,5 ml de agar fundido (42 & # x000b0C) 0,25 & # x00025 en medio TAP-mínimo, pipeteado en el centro de una placa TAP (2 & # x000b0C) # x00025 agar y 100 & # x003bcg de ampicilina por ml), y esparcir sobre aproximadamente tres cuartos de la superficie (placas de 110 mm de diámetro). Típicamente, se precipitaron 7 & # x003bcg de ADN en 3 mg de partículas de tungsteno (M17 Bio-Rad), y un octavo de esta suspensión (& # x0223c0.4 mg de tungsteno y 875 ng de ADN) se inyectó en cada placa . Después del rodaje, las placas se mantuvieron durante la noche con poca luz. Al día siguiente, se raspó la capa celular y se volvió a esparcir en dos placas selectivas (100 & # x003bcg de espectinomicina por ml en TAP o 3 & # x003bcM DCMU en medio mínimo), que se incubaron bajo luz moderadamente brillante (& # x0223c2, 000 lx) a 23 & # x000b0C. Los transformantes resistentes a la espectinomicina generalmente comenzaron a aparecer después de aproximadamente 1 semana y continuaron apareciendo hasta 3 semanas después. Los transformantes resistentes a DCMU necesitaron aproximadamente 2 semanas para comenzar a aparecer y continuaron apareciendo durante 3 a 4 semanas a partir de entonces.

Análisis por PCR de transformantes.

Las células para el análisis de PCR se volvieron a cultivar en placas selectivas y el ADN se preparó mediante el método de D & # x000fcrrenberger et al. (12). Se utilizaron protocolos estándar para PCR con Taq polimerasa. El régimen de temperatura fue el siguiente: 4 min a 94 & # x000b0C y 24 ciclos de 60 & # x000b0C (1 min), 70 & # x000b0C (5 min) y 94 & # x000b0C (30 s), seguido de 1 min a 60 & # x000b0C (1 min) # x000b0C y 8 ​​min a 70 & # x000b0C. Los cebadores se dan en la Tabla & # x200B Tabla 1. 1. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa 1 & # x00025 que contenían Tris-acetato 40 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y 0,2 & # x003 bcg de bromuro de etidio por ml. En algunos experimentos, los productos de PCR se eluyeron del gel y se sometieron a secuenciación automatizada utilizando los mismos cebadores.

Análisis de extensión del cebador de los extremos de la transcripción 5 & # x02032.

La extensión del cebador se realizó utilizando los oligonucleótidos 161 y 276, que son complementarios a porciones del Cr.psbA4 ORF (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). Para la etapa de hibridación, se mezclaron 50 & # x003bcg de ARN total (extraído de cultivos en fase logarítmica) con 1 ng de un cebador oligonucleotídico cuyo extremo 5 & # x02032 se había marcado con 32 P, en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5 ) & # x02013300 mM NaCl & # x020132 mM EDTA (10 & # x003bcl), calentado durante 3 min a 85 & # x000b0C, y enfriado a 42 & # x000b0C durante 30 min. A esto se le añadió 40 & # x003bcl de mezcla de transcripción inversa precalentada (42 & # x000b0C), que contenía 1 mM (cada uno) de trifosfato de desoxinucleósido, 75 & # x003bcg de actinomicina D por ml, 125 & # x003bcg de albúmina de suero bovino acetilada por ml , 20 U de inhibidor de la ARNasa placentaria (Roche) y 12,5 U de MP con transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Life Sciences, Inc.) en Tris-HCl 10 mM (pH 8,4) y MgCl # x020137,5 mM2& # x0201310 mM ditiotreitol. Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 min a 42 o 50 ° C, y luego las reacciones se detuvieron añadiendo EDTA a 10 mM seguido de RNasa A a 20 ng /% 003bcl. Después de la digestión del ARN durante 30 min a 37 ° C, las muestras se extrajeron con fenol-cloroformo y se precipitaron con acetato de amonio y etanol. Los ADNc se recogieron en 2,3 & # x003bcl de 1 & # x000d7 Tris-borato-EDTA, y luego un volumen de 1,2 de solución de carga de gel (90 & # x00025 formamida, 50 mM EDTA & # x0005bpH 8,0 & # x0005d, 0,01 & # Se añadió x00025 xileno cianol, 0,01 & # x00025 azul de bromofenol) y los ADNc se calentaron a 80ºC durante 3 min. Los ADNc se separaron mediante electroforesis en un gel de secuenciación de poliacrilamida 6 & # x00025, junto con escaleras de secuencia que se prepararon utilizando el mismo cebador y plásmido pBX4 (23) marcado en los extremos como plantilla. Las escaleras se hicieron utilizando el sistema de secuenciación del ciclo de ADN fmol (Promega). Para una alineación precisa de los ADNc con los de la escalera de secuencia, era necesario que todas las muestras estuvieran en el mismo tampón de carga y que se cargaran volúmenes iguales en el gel. Los geles se procesaron a 60 W (& # x0223c50 & # x000b0C) hasta que el xileno cianol migró & # x0223c90 & # x00025 de la longitud del gel.


Atribuciones de figuras

Figura 3.1 La bicapa de fosfolípidos (Anatomía y fisiología, Capítulo 3.1, Figura 2) de OpenStax se utiliza bajo una licencia CC BY 4.0.

Figura 3.6 La lámina capilar de Bryum de Kristian Peters [Fabelfroh 13:07, 2007 (UTC)] se utiliza bajo una licencia CC BY-SA 3.0.

Figura 3.11 Tabla de estructura celular original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica por Hayley Mann, Xazmin Lowman y Malaina Gaddis está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.12b Mapa del territorio de Tsimshian original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Elyssa Ebding en GeoPlace, Universidad Estatal de California, Chico está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.13 Rosalind Franklin de la colección personal de Jenifer Glynn del Laboratorio de Biología Molecular del MRC se utiliza bajo una licencia CC BY-SA 4.0.

Figura 3.16 Cromosoma original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Katie Nelson está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.19 HeLa-III de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) es de dominio público.

Figura 3.20 Mitosis original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Mary Nelson está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.21 Meiosis original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Mary Nelson está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.23 Síntesis de proteínas original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Mary Nelson se encuentra bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.27 La estatua de Mendel de Coeli ha sido designada al dominio público (CC0).

Figura 3.28 Guisantes Mendels de Mariana Ruiz LadyofHats ha sido designado al dominio público (CC0 1.0).

Figura 3.30 Las flores de mendel cuadradas de Punnett de Madeleine Price Ball (Madprime) se utilizan bajo una licencia CC BY-SA 3.0.

Figura 3.31 Tabla de trastornos mendelianos original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Hayley Mann, Xazmin Lowman y Malaina Gaddis está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.33 Los genotipos sanguíneos ABO originales de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Katie Nelson se encuentran bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.34 El patrón de herencia mendeliano dominante original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Beth Shook está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.35 Fibrosis quística, patrón de herencia mendeliano recesivo, original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Beth Shook está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.36 Patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X original de Exploraciones: Una invitación abierta a la antropología biológica de Beth Shook está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.39 “Rue” el gato calicó de Hayley Mann está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.40 El gel de electroforesis de PCR de Hayley Mann está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.41 La secuenciación de Sanger con resultado heterocigoto de Hayley Mann está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.44 El resultado de portador positivo para el alelo de la enfermedad celíaca de Hayley Mann está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.45 Los resultados de la prueba de porcentaje de ascendencia de ADN de Hayley Mann están bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Figura 3.46 Pedigrí original de Exploraciones: una invitación abierta a la antropología biológica de Beth Shook está bajo una licencia CC BY-NC 4.0.

Cadena de aminoácidos que se pliega en una estructura tridimensional que permite que una célula funcione de diversas formas.

Moléculas de ácidos grasos que sirven para varios propósitos en la célula, incluido el almacenamiento de energía, la señalización celular y la estructura.

Moléculas compuestas por átomos de carbono e hidrógeno que se pueden descomponer para suministrar energía.

Estructura compleja (como ADN o ARN) que transporta información genética sobre un organismo vivo.

Molécula que transporta la información hereditaria transmitida de padres a hijos. El ADN puede describirse como una forma de "doble hélice". Incluye dos cadenas de nucleótidos unidos por enlaces de hidrógeno con un esqueleto de azúcar-fosfato.

El orden de las bases de nucleótidos. Una secuencia de ADN puede ser corta, larga o representativa de cromosomas completos o genomas de organismos.

Molécula de ácido nucleico monocatenario. Hay diferentes ARN que se encuentran dentro de las células y realizan una variedad de funciones, como la señalización celular y la participación en la síntesis de proteínas.

Un organismo unicelular caracterizado por la falta de un núcleo y orgánulos encerrados en membranas.

Organismo unicelular o multicelular caracterizado por un núcleo distinto, con cada orgánulo rodeado por su propia membrana.

Una estructura dentro de una célula que realiza tareas especializadas que son esenciales para la célula. Existen diferentes tipos de orgánulos con función propia.

Los genomas colectivos de la comunidad de microorganismos que tenemos los humanos viviendo dentro de su cuerpo.

Un grupo de células que son morfológicamente similares y realizan la misma tarea.

Dos capas de lípidos que forman una barrera debido a las propiedades de una cabeza hidrofílica (amante del agua) y una cola hidrofóbica (repelente al agua).

La matriz "gelatinosa" dentro de la célula que contiene muchos orgánulos y otras moléculas celulares.

Orgánulo celular de doble membrana que ayuda a proteger el ADN y la regulación de las actividades nucleares.

Una membrana de doble capa que rodea el núcleo.

Orgánulo celular especializado que es el sitio para la producción de energía. También tiene su propio genoma (mtDNA).

Segmento circular de ADN que se encuentra en las mitocondrias y que se hereda por vía materna.

Un cambio en la secuencia de nucleótidos del código genético. Esta es una de las fuerzas de la evolución.

El ADN que se aísla de restos orgánicos a menudo data de hace cientos o miles de años. Además, el ADNa generalmente se degrada (es decir, se daña) debido a la exposición a elementos como el calor, la acidez y la humedad.

Enlace químico entre nucleótidos, como adenina (A) y timina (T) o citosina (C) y guanina (G) en el ADN o (A) y uracilo (U) en el ARN.

Proteína que envuelve el ADN para ayudar con la organización del ADN dentro del núcleo.

ADN envuelto alrededor de complejos de histonas. Durante la división celular, la cromatina se convierte en un cromosoma condensado.

Molécula de ADN que se envuelve alrededor de complejos de proteínas, incluidas las histonas.

Cromosomas en espiral sueltos que se encuentran dentro del núcleo y que son accesibles para el procesamiento regulador del ADN.

Una característica estructural que se define como el "centro" de un cromosoma y que crea dos longitudes de brazo diferentes. El término también se refiere a la región de unión de los microtúbulos durante la mitosis y la meiosis.

Una estructura compuesta ubicada en los extremos de los cromosomas para ayudar a proteger los cromosomas de la degradación después de cada ronda de división celular.

Proceso celular en el que se copia y duplica el ADN.

Un ciclo que la célula atraviesa con puntos de control entre fases para garantizar que la replicación del ADN y la división celular se produzcan correctamente.

Replicación de ADN en la que el ADN nuevo se replica a partir de una hebra de plantilla de ADN existente.

El reclutamiento de proteínas para separar las cadenas de ADN y comenzar la replicación del ADN.

El ensamblaje de ADN nuevo a partir de cadenas molde con la ayuda de ADN polimerasas.

Detención de la actividad de replicación del ADN que se produce cuando se encuentra un codón de "detención" de la secuencia de ADN.

Una proteína que rompe los enlaces de hidrógeno que mantienen unido el ADN de doble hebra.

Cadena de plantilla de ADN en la que la replicación procede de forma continua.

Cadena de plantilla de ADN que es opuesta a la cadena principal. Por lo tanto, la replicación del ADN procede de manera discontinua, generando fragmentos de Okazaki.

Una pequeña secuencia de nucleótidos que se unen al ADN para iniciar el proceso de replicación del ADN o PCR.

Enzima que agrega nucleótidos a las cadenas de ácido nucleico existentes durante la replicación del ADN. Estas enzimas se pueden distinguir por su procesividad (por ejemplo, la replicación del ADN).

Hebras cortas de ADN derivadas de la replicación del ADN en la hebra rezagada. Fueron descubiertos por Reiji y Tsuneko Okazaki en la década de 1960.

Una mutación que aumenta la susceptibilidad de un organismo a las enfermedades.

Período preparatorio del ciclo celular cuando el aumento de la demanda metabólica permite la replicación del ADN y la duplicación de la célula antes de la división celular.

Una serie de pasos moleculares que se activan y conducen a la muerte celular. La apoptosis se puede activar cuando una célula falla en los puntos de control durante el ciclo celular; sin embargo, las células cancerosas tienen la capacidad de evitar la apoptosis.

Células diploides que comprenden tejidos corporales y sufren mitosis para el mantenimiento y reparación de tejidos.

Se refiere a un organismo o célula con dos juegos de cromosomas.

Un par de cromosomas coincidentes en el que un cromosoma se hereda por vía materna y el otro por herencia paterna.

Durante la replicación del ADN, se producen cromátidas hermanas en el cromosoma. En la división celular, las cromátidas hermanas se separan para que se puedan formar dos células. En la meiosis, las cromátidas hermanas también son sitios de recombinación genética.

El proceso que experimentan las células somáticas para dividirse. El final de la mitosis da como resultado dos células hijas diploides.

Las células reproductoras, producidas a través de la meiosis (también conocidas como células germinales o espermatozoides u óvulos).

El proceso que sufren los gametos para dividirse. El final de la meiosis da como resultado cuatro células hijas haploides.

Un proceso celular que ocurre durante la meiosis I en el que los cromosomas homólogos se emparejan y las cromátidas hermanas en diferentes cromosomas intercambian físicamente información genética.

Célula u organismo con un conjunto de cromosomas (n = 23).

Una célula con una cantidad inesperada de cromosomas. La pérdida o ganancia de cromosomas puede ocurrir durante la división mitótica o meiótica.

El procedimiento microscópico en el que se determina la cantidad de cromosomas en una célula.

Moléculas orgánicas que son los componentes básicos de las proteínas. Cada uno de los 20 aminoácidos diferentes tiene su propia propiedad química única. Los aminoácidos también están encadenados para formar proteínas.

Proteínas responsables de catalizar (acelerar) diversas reacciones bioquímicas en las células.

Un proceso de varios pasos mediante el cual los aminoácidos se unen mediante una maquinaria de ARN leída de una plantilla de ADN.

El proceso por el cual se copian los nucleótidos de ADN (dentro de un gen), que da como resultado una molécula de ARN mensajero.

El proceso por el cual se leen los codones del ARN mensajero y los aminoácidos se "encadenan" para formar proteínas.

Molécula de ARN que se transcribe a partir de ADN. Sus codones de tri-nucleótidos son "leídos" por un ribosoma para construir una proteína.

Secuencia de ADN que proporciona información de codificación para la construcción de proteínas.

Segmento de ADN que no codifica proteínas.

Las secuencias de ADN dentro de un gen que codifican directamente secuencias de proteínas. Después de ser transcrito en ARN mensajero, los intrones se recortan y los exones se pegan juntos antes de la traducción.

El proceso por el cual se producen los ARNm maduros. Los intrones se eliminan (empalman) y los exones se unen.

Un orgánulo en la célula que se encuentra en el citoplasma o retículo endoplásmico. Es responsable de leer el ensamblaje de ARNm y proteínas.

Unidades de ADN de tres nucleótidos que funcionan como “palabras” de tres letras, que codifican instrucciones para la adición de un aminoácido a una proteína o indican que la proteína está completa.

Región de un gen que inicia la transcripción. Los factores de transcripción pueden unirse y la metilación del ADN puede ocurrir en un sitio promotor, lo que puede modificar las actividades transcripcionales de un gen.

Proteínas que se unen a regiones reguladoras de genes (p. Ej., Promotor) y aumentan o disminuyen la cantidad de actividad transcripcional de un gen, incluso encendiéndolos o apagándolos.

Enzima que cataliza el proceso de producción de ARN a partir de una plantilla de ADN.

Molécula unida a ribosoma que se utiliza para ensamblar correctamente los aminoácidos en proteínas.

Molécula de ARN involucrada en la traducción. El ARN de transferencia transporta los aminoácidos del citoplasma de la célula a un ribosoma.

Una clasificación dada a los rasgos fenotípicos que están controlados por un solo gen.

Un conjunto de características observables externamente para un individuo.

Conjunto de alelos que tiene un individuo para un gen determinado.

Secuencia de ADN no idéntica que se encuentra en la misma ubicación del gen en un cromosoma homólogo, o copia del gen, que codifica el mismo rasgo pero produce un fenotipo diferente. En otras palabras, una variante genética.

Genotipo que consta de dos alelos diferentes.

Genotipo que consta de dos alelos idénticos.

Se refiere a un alelo para el que una copia es suficiente para ser visible en el fenotipo.

Se refiere a un alelo cuyo efecto no se ve normalmente a menos que haya dos copias presentes en el genotipo de un individuo.

Proteína que se encuentra en la superficie de un glóbulo rojo.

Proteínas inmuno-relacionadas que pueden detectar y unirse a sustancias extrañas en la sangre, como patógenos.

Los efectos de ambos alelos en un genotipo se pueden ver en el fenotipo.

Un individuo que tiene un genotipo heterocigoto que típicamente se asocia con una enfermedad.

Se refiere a un patrón de herencia en el que un alelo se encuentra en un autosoma (un cromosoma que no es un cromosoma sexual).

Se refiere a un patrón de herencia en el que el alelo se encuentra en el cromosoma X o Y.

Se refiere a un patrón de herencia en el que un alelo se encuentra en un autosoma (un cromosoma que no es un cromosoma sexual).

La proporción de la frecuencia con la que la posesión de un alelo da como resultado un fenotipo esperado. Algunos alelos son más penetrantes que otros.

Fenotipo controlado por dos o más genes.

Una categoría de enfermedades que son poligénicas y también están influenciadas por factores ambientales y de estilo de vida.

Toda la información genética de un organismo.

Cambios en la expresión genética que no dan como resultado un cambio en la secuencia de ADN subyacente. Estos cambios típicamente involucran modificaciones de histonas y metilación del ADN. Estos cambios son reversibles y también pueden ser heredados por la próxima generación.

Un procedimiento de laboratorio molecular que produce el orden de las bases de nucleótidos (es decir, secuencias).

Procedimiento molecular que se realiza para probar la presencia de ciertos alelos o para descubrir otros nuevos.

Los grupos metilo se unen al ADN, que modifica la actividad transcripcional de un gen al activarlo o desactivarlo.

El patrón de metilación en todo el genoma, es decir, qué genes (y otros sitios genómicos) están metilados y no metilados.

Un procedimiento de biología molecular que puede hacer copias de segmentos de ADN genómico. Se usa una pequeña cantidad de ADN como plantilla inicial y luego se usa para hacer millones de copias.

Un proceso que implica el uso de nucleótidos marcados con fluorescencia para visualizar ADN (fragmentos de PCR) a nivel de nucleótidos.

Un procedimiento de genotipado que utiliza un chip de microarrays, que es una colección de miles de secuencias cortas de nucleótidos adheridas a una superficie sólida que puede sondear el ADN genómico.

Una tecnología de genotipado que implica la producción de millones de secuencias de nucleótidos (a partir de una sola muestra de ADN) que luego se leen con una máquina de secuenciación. Puede usarse para analizar genomas completos o regiones específicas y requiere extensas aplicaciones basadas en programas.