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¿Cómo reconoce la enzima de empalme dónde empalmar los intrones?

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Cuando el ADN del núcleo se transcribe a un ARNm, una enzima empalma el ARNm antes de salir a través del poro nuclear. ¿Cuál es el nombre de esta enzima y cómo reconoce dónde empalmar el ADN para que solo queden los intrones en el interior? ¿No necesitaría un conjunto de instrucciones para reconocer exactamente dónde cortar para que la secuencia no cambie?


Hay dos factores que involucran la capacidad de las enzimas para procesar el ARN.
1) Estructura ver wikipedia
2) Afinidad de unión

Echemos un vistazo al proceso de empalme:

Los 'sitios' activos (GU, A y AG) deben estar en proximidad espacial (punto uno), y la enzima debe poder unirse allí, también conocido como formando enlaces de hidrógeno con los nucleótidos, que es principalmente el caso si:
a) los nucleótidos son 'libres' ya que no están emparejados con otros nucleótidos
b) es energéticamente favorable que la enzima se una y haga su trabajo, factores como la temperatura y, por supuesto, los nucleótidos correctos

Si hubiera algunas mutaciones, es posible que el empalme no funcione.


Empalme de ARN

Debido al corte y empalme alternativo del ARNm, la IgD se coexpresa típicamente con IgM en la superficie de las células B maduras antes de la estimulación antigénica. IgM e IgD pueden entregar señales cualitativamente diferentes, quizás como resultado de su capacidad para asociarse con diferentes proteínas asociadas con BCR. Existe evidencia de que la señalización de IgD puede proteger a las células B de la tolerancia. La IgD también está presente en el suero, aunque en concentraciones muy bajas. Un pequeño subconjunto de células B en humanos expresa IgD en ausencia de IgM debido a una forma no canónica de recombinación de cambio de clase que ocurre en la mucosa respiratoria superior. Las células B humanas IgM - IgD + usan solo LC λ. La IgD secretada se une a los basófilos y otras células inmunitarias innatas a través de receptores desconocidos, que en la reticulación promueven las actividades antimicrobianas. 27,28


Lariats: cómo se toman las decisiones de empalme de ARN

Los lariatos son subproductos descartados del empalme de ARN, el proceso mediante el cual se ensamblan las instrucciones genéticas para producir proteínas. Un nuevo estudio ha encontrado cientos de lariats más que nunca, lo que arrojó nueva información sobre cómo se produce el empalme y cómo puede provocar enfermedades.

Pequeños y transitorios bucles de material genético, detectados y estudiados por cientos por primera vez en la Universidad de Brown, están proporcionando nuevos conocimientos sobre cómo el cuerpo transcribe el ADN y empalma (o empalma) esas transcripciones en las instrucciones necesarias para producir proteínas.

Los fragmentos genéticos en forma de lazo & # 151 se llaman lariats & # 151 que el equipo de Brown informa haber estudiado en la edición del 17 de junio de Naturaleza Biología Molecular y Estructural son subproductos de la transcripción de genes. Hasta ahora, los científicos habían encontrado menos de 100 lariats, principalmente estudiando minuciosamente selecciones muy pequeñas de intrones, que son secciones de código genético que no codifican directamente proteínas, pero contienen señales importantes que dirigen la forma en que se ensamblan las regiones codificantes de proteínas. En el nuevo estudio, los biólogos de Brown informan que encontraron más de 800 lariats en un conjunto disponible públicamente de miles de millones de lecturas de ARN derivadas de tejidos humanos.

"Usamos métodos genómicos modernos, secuenciadores profundos, para detectar estos raros intermedios de empalme", ​​dijo William Fairbrother, profesor asociado de biología y autor principal del estudio. "Es el primer informe de que se descubren estas cosas a escala genómica en células vivas, y nos dice mucho sobre este paso del procesamiento de genes".

Ese paso específico se conoce como empalme de ARN. Al igual que los editores de películas empalman escenas de películas, las enzimas cortan los intrones para ensamblar exones que instruyen al ribosoma de una célula para que produzca proteínas. El cuerpo a menudo tiene la posibilidad de elegir diferentes formas y lugares para realizar esos cortes. La mayor parte de lo que se sabe sobre el empalme proviene del estudio de estas instrucciones empalmadas, dijo Allison Taggart, estudiante graduada y autora principal del estudio. Lo que falta son los datos ocultos en los lariats, que se desmoronan poco después de ser empalmados, pero resultan predecir las opciones de empalme del cuerpo.

La información clave descubierta en el estudio, dijo Taggart, es la ubicación de los llamados "puntos de ramificación" en los lariats. Físicamente, el punto de ramificación es donde el lazo se cierra sobre sí mismo para formar un bucle durante el primer paso del empalme, pero su posición y proximidad a los posibles sitios de empalme, aprendieron los investigadores, se relacionan de manera confiable con el lugar donde ocurrirá el empalme.

Después de estudiar los sitios de estos puntos de bifurcación y su relación con los sitios de empalme, los investigadores crearon un modelo algorítmico que podía predecir los sitios de empalme el 95,6 por ciento de las veces. El valor del modelo no está en identificar los sitios de empalme y los que ya son bien conocidos, dijo Fairbrother. En cambio, la precisión del modelo muestra que, con los nuevos datos de los lariats, los científicos han obtenido una comprensión más general de cómo el cuerpo elige entre sitios alternativos de empalme.

"Lo que sí nos dice son conjuntos de reglas que definen la relación entre los puntos de ramificación y los sitios de empalme elegidos, lo que da pistas sobre cómo la maquinaria de empalme toma decisiones", dijo Taggart. "Ciertas ubicaciones de puntos de ramificación pueden imponer isoformas de empalme específicas".

Conexiones con la enfermedad

Además de descubrir los mecanismos del empalme alternativo, el equipo también estudió la conexión entre los puntos de ramificación y la enfermedad. Buscaron en la base de datos de mutaciones de genes humanos mutaciones causantes de enfermedades encontradas en intrones y compararon sus secuencias de ramificaciones recién encontradas con esas mutaciones. Descubrieron que muchos se relacionan específicamente con los puntos de ramificación.

"Vimos un motivo de secuencia que se veía exactamente como un motivo de secuencia de punto de ramificación", dijo. "Lo que esto nos dice es que estas mutaciones se están formando en los puntos de ramificación y conducen a la enfermedad, presumiblemente al causar un empalme aberrante al interferir con la formación del lazo".

En otras palabras, dijo Fairbrother, bien podría ser que una consecuencia de las mutaciones en los puntos de ramificación pudiera ser una enfermedad.


Terapéutica basada en intrones del grupo I a través de la reacción trans-empalme

3.1 Trans-Ribozima de empalme para reparación de ARN

TransLas ribozimas de empalme para la reparación del ARN se han diseñado para apuntar y escindir en sentido ascendente de genes mutados y, posteriormente, reemplazarlos con ARN de ribozima 3'-exón que codifica la secuencia de tipo salvaje para restaurar la función génica correcta. 71 Cualquier residuo de uridina en un ARN mutado podría ser reconocido por un trans-Ribozima de empalme, lo que indica que la mayoría de las mutaciones genéticas a nivel de ARN encontradas en enfermedades genéticas, cáncer u otros pueden ser dirigidas y reparadas para producir genes que funcionen correctamente sin perturbar la regulación genética espacial y temporal endógena. 33, 36, 39, 40, 42, 104, 105

Se informaron dos estudios por primera vez en 1998 que transLas ribozimas de empalme podrían diseñarse para reparar transcripciones mutantes clínicamente relevantes asociadas con enfermedades genéticas. La reparación de una repetición de trinucleótidos en la proteína quinasa de la distrofia miotónica (DMPK) asociada con la distrofia miotónica fue informada por Phylactou et al. trans-Ribozima de empalme para unirse inmediatamente aguas arriba del área de expansión de repetición CUG mutada del ARNm de DMPK y reemplazar el extremo 3 'con la secuencia de ARN de tipo salvaje in vitro y en fibroblastos humanos. 39 La reparación del ARNm de la beta-globina falciforme (β S -globina) en transcripciones con funciones normales fue lograda por el grupo Sullenger, que diseñó un Rib61–3′γ trans-unir ribozima para apuntar y reemplazar el ARNm de β S -globina mutante responsable de la anemia de células falciformes con un ARNm que codifica la γ-globina anti-falciforme in vitro y en precursores de eritrocitos derivados de pacientes con anemia falciforme. 104 Se sabe que un nivel del 10-20% de expresión de γ-globina en relación con los ARN de β S -globina en los glóbulos rojos de un paciente puede mejorar en gran medida el pronóstico clínico. 106, 107 En un estudio siguiente, para lograr una eficiencia de reparación clínicamente susceptible, el grupo de Sullenger optimizó trans-unión de casetes de expresión de ribozimas y tasas de reparación mejoradas de hasta el 10-50% de los ARN de β S -globina falciforme en células de mamífero transfectadas. 33 Sin embargo, el estudio utilizó un casete citoplásmico de expresión de la ARN polimerasa T7 para una alta expresión de la ribozima, que no puede usarse en aplicaciones terapéuticas. Para la aplicación terapéutica de la ribozima se requerirá la optimización de los sistemas de vectores para alcanzar niveles suficientes de expresión de ribozima o derivados de ribozima altamente eficientes. Rogers y col. desarrollado una trans-Ribozima de empalme que puede reparar un ARNm mutante del canal de cloruro del músculo esquelético canino (cClC-1) que causa el trastorno hereditario miotonía congénita. 40 Aunque una eficiencia de reparación de esta ribozima con aproximadamente 1.2%, el 18% de las células fueron reparadas exhibiendo una restauración significativa de la función del canal de cloruro. Intrones del grupo I derivados de Didimio y Fuligo exhibido equivalente trans-eficacia de reacción de empalme como las del Tetrahymena y facilitó la reparación del ARN de α-manosidasa mutado in vitro. 103

Trans-se han diseñado ribozimas de empalme para reparar genes mutantes asociados con cánceres. 36, 42, 105 Watanabe et al. desarrollado trans-unir ribozimas que se dirigen a la uridina en las posiciones 41 y 65 de un gen supresor de tumores p53 mutante, reparando así el ARN p53 mutante y produciendo una proteína p53 funcional con actividad promotora restaurada en varias líneas celulares cancerosas mutadas en p53. 105 Nuestro grupo también desarrolló trans-unir ribozima que se dirige a la uridina en la posición 96 del ARN de p53 mutante con una eficiencia de reparación de aproximadamente el 10%, lo que induce a los genes p21 y Bax que responden a p53 y desencadena eficazmente la apoptosis en líneas celulares de cáncer de ovario transfectadas. 42 Kastanos y col. describió un trans-Ribozima de empalme que puede reparar un transcrito de p16 con dos bases eliminadas en una línea celular de cáncer de páncreas, restaurando la síntesis de proteína p16 normal y, en consecuencia, reduciendo la tasa de crecimiento de las células transfectadas. 36


Empalme de ARN

En algunos genes, las secciones del ADN que codifican proteínas ("exones") están interrumpidas por regiones no codificantes ("intrones"). El empalme de ARN elimina los intrones del ARNm previo para producir el conjunto final de instrucciones para la proteína.

Duración: 1 minuto, 37 segundos

A medida que el ADN se transcribe en ARN, es necesario editarlo para eliminar las regiones no codificantes, o intrones, que se muestran en verde. Este proceso de edición se llama empalme, que implica eliminar los intrones, dejando solo las regiones codificadoras de proteínas amarillas, llamadas exones.

El empalme de ARN comienza con el ensamblaje de proteínas auxiliares en los bordes intrón / exón. Estos factores de empalme actúan como balizas para guiar a las pequeñas proteínas ribo nucleares para formar una máquina de empalme, llamada espliceosoma. La animación muestra que esto sucede en tiempo real. El espliceosoma luego acerca los exones a ambos lados del intrón muy juntos, listos para ser cortados. Un extremo del intrón se corta y se dobla sobre sí mismo para unirse y formar un lazo. El espliceosoma luego corta el ARN para liberar el bucle y unir los dos exones. El ARN y el intrón editados se liberan y el espliceosoma se desmonta.

Este proceso se repite para cada intrón del ARN. Numerosos espliceosomas, que se muestran aquí en púrpura, se ensamblan a lo largo del ARN. Cada espliceosoma elimina un intrón y libera el bucle antes de desmontarlo. En este ejemplo, se eliminan tres intrones del ARN para dejar las instrucciones completas para una proteína.

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Reconociendo el 35 aniversario de la propuesta de que las snRNP participan en el empalme

Hace treinta y cinco años, como jóvenes estudiantes de posgrado, tuvimos el placer y el privilegio de estar en el laboratorio de Joan Steitz en un punto crucial en la historia de la biología molecular del ARN. Los intrones se habían descubierto recientemente en los laboratorios de Philip Sharp y Richard Roberts, pero se desconocía por completo la maquinaria para eliminarlos de los precursores de ARNm. Esta retrospectiva describe nuestra hipótesis de que los snRNP recientemente descubiertos funcionaban en el empalme de pre-ARNm. Se demostró que la propuesta era correcta, al igual que la intuición de Joan de que los ARN pequeños proporcionan especificidad a las reacciones de procesamiento del ARN a través del emparejamiento de bases en diversos entornos. Sin embargo, la investigación realizada durante los años transcurridos ha revelado que tanto la selección del sitio de empalme como el empalme en sí son mucho más complejos y dinámicos de lo que imaginamos.

En el verano de 1979, ambos comenzamos a trabajar en el laboratorio de Joan Steitz en el Departamento de Biofísica Molecular y Bioquímica de la Universidad de Yale (Figura 1). Steve había elegido el laboratorio Steitz para su trabajo de tesis después de una rotación durante su primer año. Sandy había completado su primer año del programa de doctorado en medicina de Yale y estaba probando el laboratorio Steitz como estudiante de rotación. Fue un momento emocionante para ser estudiante de biología molecular. Solo 2 años antes, se habían descubierto las primeras secuencias intermedias en el ARNm (Berget et al., 1977 Chow et al., 1977). Ahora la atención se centró en encontrar un mecanismo para su eliminación. ¿Qué maquinaria todavía completamente misteriosa podría identificar y eliminar las secuencias intermedias?

FIGURA 1: El laboratorio Steitz. (A) Joan Steitz (fotografía tomada en enero de 1983 por T. Charles Erickson, cortesía de John Curtis, Planificación Institucional y Comunicación de la Facultad de Medicina de Yale). (B) El laboratorio Steitz en el verano de 1979. De pie, de izquierda a derecha: Nancy Andrews, Martha Krikeles, Sandra Wolin, Stephen Mount, Bernard Shen, James Spilsbury, Michael Lerner. Sentados: Richard Bram, Margaret Rosa, Joan Weliky (ahora Conaway), John Boyle (fotografía de Randall Reed, que no aparece en la imagen).

Los experimentos en el laboratorio Steitz habían identificado muy recientemente una nueva clase de ribonucleoproteínas (RNP) en células de mamíferos: pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP), conocidas en el laboratorio como "snurps". Un estudiante mayor de MD-PhD, Michael Lerner, acababa de demostrar que los autoanticuerpos "anti-RNP" y "anti-Sm" de pacientes con lupus eritematoso sistémico de enfermedad reumática reconocen snRNP que contienen un conjunto específico de pequeños ARN complejados con proteínas (Lerner y Steitz, 1979). Estos ARN incluían U1 y U2, pequeños ARN nucleares (snRNA) previamente identificados en los laboratorios de Harris Busch y Sheldon Penman (Hodnett y Busch, 1968 Weinberg y Penman, 1968), así como tres nuevos ARN que Lerner y Steitz (1979) denominados ARNnn U4, U5 y U6.

Nuestro artículo de 1980, ¿Están las snRNP involucradas en el empalme? (Lerner et al., 1980), presentó algunos argumentos simples pero poderosos que implican a estos snRNPs Sm recién descubiertos en la eliminación de intrones. Estos incluyeron el hallazgo de que los ARN de tamaño similar a los ARN de mamíferos U1, U2, U4, U5 y U6 estaban presentes en inmunoprecipitados anti-Sm de células de insectos, como se esperaría de los componentes de un proceso altamente conservado, y que ambos " 30S hnRNPs ”(probablemente equivalente a pre-mRNA complejados con proteínas) y snRNAs eran más abundantes en los núcleos de tipos de células metabólicamente activas (Lerner et al., 1980). Para respaldar estos datos relativamente inespecíficos había dos observaciones muy intrigantes: 1) el extremo 5 ′ del ARNrn de U1 era capaz de emparejarse de bases con secuencias conservadas en las uniones intrón-exón, y 2) una forma degradada de ARN de U1 que carece de estas secuencias difiere del ARN de longitud completa en que ya no sedimenta con 30S hnRNP. Estas observaciones se entrelazaron en un modelo en el que el emparejamiento de bases de ARN: ARN entre el extremo 5 'de U1 snRNA y las secuencias de unión de empalme contribuye al reconocimiento de las uniones de empalme (Lerner et al., 1980).

Este artículo no fue tanto el informe de un descubrimiento como la presentación de una hipótesis acompañada de pistas preliminares y tentadoras. De hecho, el artículo contiene cinco especulaciones específicas y es interesante considerarlas una a la vez.

En primer lugar, la hipótesis abordada por el título del artículo: ¿están las snRNP involucradas en el empalme? Ésta es la hipótesis más simple y general, y ha demostrado ser correcta. Todos los Sm snRNP mencionados en el artículo resultaron ser componentes del espliceosoma, una gran estructura dinámica que se forma de nuevo en cada intrón de forma ordenada, los RNP que contienen los cinco snRNA trabajan juntos de manera coordinada para eliminar la mayoría de los intrones que se encuentran en las proteínas. genes codificadores (Brody y Abelson, 1985 Grabowski et al., 1985 Will y Luhrmann, 2011).

Una hipótesis más específica, apoyada por la complementariedad que se acaba de señalar, sugirió que U1 snRNA contribuyó al reconocimiento de los sitios de corte y empalme a través del emparejamiento de bases. Esta propuesta, junto con una similar de Rogers y Wall (1980), llamó inmediatamente la atención. Rápidamente se demostró que los snRNP de U1 en un extracto crudo podrían unirse y proteger específicamente las secuencias del sitio de empalme 5 '(Mount et al., 1983) y que anti-Sm y los autoanticuerpos de pacientes relacionados contra solo U1 snRNP inhibieron el empalme en extractos (Padgett et al., 1983). La prueba genética formal de esta hipótesis fue obtenida por el grupo de Alan Weiner (Zhuang y Weiner, 1986), que, no por casualidad, residía al final del pasillo del laboratorio Steitz. Muy recientemente, una estructura cristalina del snRNP U1 complejado con el sitio de empalme 5 '(Kondo et al., 2015) muestra de hecho el emparejamiento de bases propuesto.

La propuesta original incluía un emparejamiento de bases extendido entre el extremo 5 'del ARN de U1 y los sitios de empalme 5' y 3 'en forma de una estructura cruzada que se asemeja a la mitad de una unión de Holliday, un intermedio en la recombinación homóloga de ADN (Holliday, 1964 ). Entonces, una tercera hipótesis fue que el emparejamiento de bases podría unirse a los sitios de empalme a través de una estructura de cruce que se asemeja a la unión de Holliday. Un aspecto de esta propuesta se confirmó muy bien con el descubrimiento de que el ARNnn de U5 interactúa con los nucleótidos del exón en ambos extremos del intrón (Newman y Norman, 1991 Sontheimer y Steitz, 1993). Sin embargo, el papel de U1 se modificó rápidamente para involucrar solo el sitio de empalme 5 ', basado en el hallazgo de que solo el sitio 5' estaba unido in vitro (Mount et al., 1983) y solo los nucleótidos 1-11 se conservaron en Drosophila melanogaster ARN U1 (Mount y Steitz, 1981). El análisis posterior mostró que el sitio de empalme 3 'se reconoce en relación con (y después) del sitio de ramificación, y que U1 abandona el espliceosoma antes del primer paso de empalme (Konforti et al., 1993). El sitio de la ramificación es reconocido por U2 a través del emparejamiento de bases, y cada uno de los demás snRNAs contribuye a la formación o función del espliceosoma a través del emparejamiento de bases de algún tipo (Will y Luhrmann, 2011). Por lo tanto, aunque el modelo de cruce específico estaba equivocado, la idea de que las interacciones de emparejamiento de bases múltiples juegan un papel crítico en unir las cosas ha demostrado ser correcta.

De manera más general, planteamos la hipótesis de que el emparejamiento de bases con ARN pequeños podría proporcionar especificidad al empalme, al igual que se había demostrado que el emparejamiento de bases entre el ARNr 16S y la secuencia de Shine-Dalgarno aumentaba la especificidad en los sitios de inicio de la traducción (Shine y Dalgarno, 1975 Steitz y Jakes , 1975). De hecho, imaginamos una familia de ARN que podría reconocer subconjuntos específicos de sitios de empalme: "diferentes secuencias de ARN [en los otros snRNAs] podrían facilitar un reconocimiento más preciso de secuencias de unión de empalme variantes en hnRNA o en otras moléculas de ARN" (Lerner et al., 1980). Aunque los snRNA que conocíamos (U2, U4, U5 y U6) actúan juntos para eliminar los mismos intrones, esta predicción fue confirmada de manera sorprendente por el descubrimiento del espliceosoma menor, en cuyo caso, los sitios de empalme variantes son de hecho reconocido por una variante de espliceosoma (que contiene U11, U12, U4atac y U6atac en lugar de U1, U2, U4 y U6 pero el mismo U5) (Hall y Padgett, 1994, 1996 Tarn y Steitz, 1996a, b).

Además, la función de la especificidad proporcionada por el emparejamiento de bases a los ARN pequeños dentro de una clase surgió más tarde como tema en otras grandes clases de ARN pequeños. La primera clase grande que se describió fueron los ARN nucleolares pequeños, que dirigen la modificación de bases específicas (pseudouridilación y 2 ′ O-metilación) de sus objetivos (Cavaille et al., 1996 Kiss-Laszlo et al., 1996 Ganot et al., 1997 Ni et al., 1997). La segunda historia, aún más espectacular, fue, por supuesto, los microARN (Lee et al., 1993 Wightman et al., 1993). Por lo tanto, el emparejamiento de bases mediante ARN pequeños con sus objetivos de ARN ha demostrado ser un medio clave para proporcionar especificidad en varios procesos biológicos.

La última hipótesis a destacar en nuestro artículo original fue que los propios ARNpn podrían ser catalizadores. Esta especulación ("snRNP que contienen U1 ... podría ser la propia enzima de empalme [observe el ejemplo de E. coli La RNasa P, que contiene un pequeño ARN complejado con varias proteínas pequeñas] ”) tenía poca base en los datos que se muestran en el artículo. Era pura Joan Steitz y mostró su profundo conocimiento de la función del ARN. Sidney Altman estaba llevando a cabo el trabajo sobre RNase P en otro lugar de Yale y más tarde le valdría el premio Nobel (compartido con Tom Cech) por el descubrimiento de ARN catalítico (Stark et al., 1978 Guerrier-Takada et al., 1983). De hecho, es probable que el empalme espliceosomal sea catalizado, al menos principalmente, por los snRNA, pero por U6 y U2 en lugar de U1 (Madhani y Guthrie, 1992 Valadkhan, 2005), y los ARN intrones del grupo II que se empalman completamente son homólogos (Jacquier, 1990 Sashital et al., 2004). Sorprendentemente, la reciente estructura de microscopía crioelectrónica de 3,6 Å del Schizosaccharomyces pombe El espliceosoma ahora ha permitido la visualización tanto del centro catalítico como de la semejanza con los intrones del grupo II en tres dimensiones (Hang et al., 2015 Yan et al., 2015).

En general, las hipótesis detalladas en nuestro artículo original demostraron ser notablemente proféticas e influyentes, como lo demuestran las & gt1000 citas que ha recibido. Gran parte del enfoque en el campo del empalme ahora se centra en obtener estructuras de alta resolución de complejos de empalme, integrar el empalme con otros procesos, como la transcripción, la estabilidad y la traducción del ARNm, y en descifrar las innumerables formas en que la elección del sitio de empalme y empalme puede ser posible. estar regulado. Además, en 1980, no previmos la plétora de mutaciones causantes de enfermedades en los sitios de empalme, señales de empalme auxiliares y en componentes de la maquinaria de empalme o las formas en que la variación genética puede afectar el empalme (Sterne-Weiler y Sanford, 2014 Xiong et al., 2015). Sin embargo, la idea de usar el emparejamiento de bases entre los ARN cortos y sus objetivos para influir en la selección del sitio de empalme subyace en varios esfuerzos actuales para usar oligonucleótidos antisentido como terapéuticos para secuestrar secuencias inhibidoras y / o corregir defectos de empalme (Hua et al., 2010 Osorio et al., 2011 Lentz et al., 2013).

Treinta y cinco años es mucho tiempo, lo que nos da la oportunidad de reflexionar también sobre cómo ha cambiado la práctica de la ciencia. Varios de los experimentos en nuestro artículo original involucraron el etiquetado metabólico de células de cultivo de tejidos con ortofosfato de [32P] 10 mCi / l, algo que sería muy difícil de convencer a un estudiante o postdoctorado de que hiciera hoy. El experimento que mostró que los snRNP estaban presentes solo en células metabólicamente activas implicó la comparación de núcleos de hígado de pollo y eritrocitos, para lo cual se mantuvo un pollo en el laboratorio, una opción de alojamiento que probablemente no se permitiría ahora. La compilación de los sitios de empalme de consenso se realizó a mano, al igual que la observación de la complementariedad entre estas secuencias y el extremo 5 'del snRNA de U1. Además, dado que Clonación molecular (Maniatis et al., 1982) aún no se había escrito y no había Internet para consultar los protocolos y ciertamente no había kits para comprar, nos vimos obligados a confiar en nuestros colegas, tanto en Yale como en otros lugares, para aprender nuevas técnicas. Formamos amistades profundas dentro del laboratorio Steitz, con estudiantes y postdoctorados en laboratorios cercanos y con colegas en otros lugares, que han perdurado hasta el día de hoy. A pesar de los cambios en la práctica de la ciencia, confiamos en que los estudiantes graduados de hoy continúen encontrando la misma emoción en el descubrimiento y en un ambiente colegiado como el que caracterizó nuestro tiempo en el laboratorio Steitz.


Contenido

En la naturaleza se producen varios métodos de empalme de ARN.
El tipo de empalme depende de la estructura del intrón empalmado y de los catalizadores necesarios para que se produzca el empalme.
Independientemente de la vía que se utilice, los intrones extirpados se descartan.

Intrones spliceosomales

Los intrones spliceosomales residen a menudo en genes codificantes de proteínas eucariotas. Dentro del intrón, se requieren un sitio de empalme 3 ', un sitio de empalme 5' y un sitio de ramificación para el empalme. El empalme es catalizado por el espliceosoma, que es un gran complejo de ARN-proteína compuesto por cinco pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP, pronunciado 'snurps'). Los componentes de ARN de los snRNP interactúan con el intrón y pueden participar en la catálisis. Se han identificado dos tipos de espliceosomas (el mayor y el menor) que contienen diferentes snRNP.

  • Importante
  • E Complex-U1 se une a la secuencia GU en el sitio de empalme 5 ', junto con proteínas / enzimas accesorias ASF / SF2, U2AF (se une en el sitio Py-AG), SF1 / BBP (BBP = Branch Binding Protein)
  • Un complejo-U2 se une al sitio de la ramificación y el ATP se hidroliza.
  • El trímero B1 Complex-U5 / U4 / U6 se une y el U5 se une a los exones en el sitio 5 ', con U6 uniéndose a U2
  • Se libera B2 Complex-U1, U5 pasa del exón al intrón y el U6 se une en el sitio de empalme 5 '
  • Se libera el complejo C1-U4, U6 / U2 cataliza la transesterificación, U5 se une al exón en el sitio de empalme 3 'y el sitio 5' se escinde, lo que da como resultado la formación del lazo
  • El complejo C2-U2 / U5 / U6 permanece unido al lazo, y el sitio 3 'se escinde y los exones se ligan usando hidrólisis de ATP. El ARN empalmado se libera y el lazo se desramifica.
  • Menor
  • Trans-empalme

Auto-empalme

El auto-empalme se produce para intrones raros que forman una ribozima, que realiza las funciones del espliceosoma solo mediante ARN. Hay dos tipos de intrones autoempalmes, Grupo I y Grupo II. Los intrones de los grupos I y II realizan un corte y empalme similar al espliceosoma sin requerir ninguna proteína. Esta similitud sugiere que los intrones de los grupos I y II pueden estar relacionados evolutivamente con el espliceosoma. El auto-empalme también puede ser muy antiguo y puede haber existido en un mundo de ARN que estaba presente antes de la proteína. Aunque los dos mecanismos de corte y empalme descritos a continuación no requieren que se produzca ninguna proteína, se utilizan 5 moléculas de ARN adicionales y más de 50 proteínas e hidrolizan muchas moléculas de ATP. Los mecanismos de empalme utilizan ATP para empalmar con precisión los ARNm. Si la celda no usara ningún ATP, el proceso sería muy impreciso y se producirían muchos errores. Dos transesterificaciones caracterizan el mecanismo en el que se cortan los intrones del grupo I: 1) 3'OH de un nucleósido de guanina libre (o uno ubicado en el intrón) o un cofactor de nucleótidos (GMP, GDP, GTP) ataca al fosfato en el sitio de empalme 5 ' . 2) 3'OH del 5'OH se convierte en un nucleófilo y la segunda transesterificación da como resultado la unión de los dos exones. El mecanismo por el cual se empalman los intrones del grupo II (dos reacciones de transesterificación como los intrones del grupo I) es el siguiente: 1) El 2'OH de una adenosina específica en el intrón ataca el sitio de empalme 5 ', formando así el lazo 2) El 3'OH del exón 5 'desencadena la segunda transesterificación en el sitio de corte y empalme 3' uniendo así los exones.

Empalme de ARNt

El empalme de ARNt (también similar al ARNt) es otra forma rara de empalme que generalmente ocurre en el ARNt. La reacción de empalme implica una bioquímica diferente a la de las vías de empalme y espliceomsomal. Las ribonucleasas escinden el ARN y las ligasas unen los exones. Esta forma de empalme tampoco requiere ningún componente de ARN para la catálisis.


Empalme de ARNm

Una vez que un gen ha sido localizado y transcrito en ARNm, primero debe editarse antes de que pueda traducirse en una proteína. Este proceso de edición se llama empalme e implica la eliminación de regiones no codificantes llamadas "intrones", dejando solo los "exones" que codifican la proteína. En la célula, los intrones son eliminados por enzimas especiales que reconocen secuencias específicas, estas enzimas cortan y vuelven a unir las regiones codificantes para su traducción en proteína.

Una vez que un gen ha sido localizado y transcrito en ARNm, primero debe editarse antes de que pueda traducirse en una proteína. Este proceso de edición se llama empalme e implica la eliminación de regiones no codificantes llamadas "intrones", dejando solo los "exones" que codifican la proteína. En la célula, los intrones son eliminados por enzimas especiales que reconocen secuencias específicas, estas enzimas cortan y vuelven a unir las regiones codificantes para su traducción en proteína.

Empalme de ARNm, exones, enzimas, proteínas, secuencias, traducción, animación 3d


ARN auto-empalmado

El ARN auto-empalmado en la entrada de PDB 1u6b ha sido atrapado en medio de su reacción de empalme. En esta imagen, los dos exones se muestran en rojo y azul, y parte del intrón se muestra en verde. El resto del intrón (que se muestra en la primera página de esta Molécula del mes) se omite. La reacción comienza con una pieza continua de ARN. Imagine que el extremo O3 'del exón rojo está unido al grupo fosfato marcado con un círculo en la parte superior. Luego, si sigue la cadena, pasa del exón rojo, a través del intrón verde y sale por el exón azul. La estructura muestra la molécula después de que se ha realizado la primera escisión. El GTP ha roto la cadena entre el intrón y el exón en rojo, dejando el GTP unido a un extremo del intrón. En este punto, el átomo de O3 'del exón rojo está perfectamente ubicado para atacar el fosfato al final del exón azul (círculo inferior). Cuando se establezca ese enlace, se liberará el intrón verde y los exones rojo y azul se empalmarán. Observe que la porción corta del intrón que se muestra aquí, denominada "secuencia guía", alinea los dos exones perfectamente uno al lado del otro.

Esta imagen fue creada con RasMol. Puede crear imágenes similares haciendo clic en los códigos de acceso aquí y seleccionando una de las opciones para la visualización en 3D. Cuando mire usted mismo esta estructura, tómese un momento para jugar con el color de las cadenas, ya que la estructura general puede ser confusa. El exón de color rojo es la cadena D y el exón de color azul es el residuo número 1-6 en la cadena C.La cadena A es una proteína que se usó para ayudar en la cristalización, y todo lo demás (cadena B y el resto de la cadena C) es el intrón.

Recursos relacionados con el PDB-101

Referencias

  1. T. R. Cech (2002) Ribozimas, los primeros 20 años. Transacciones de la sociedad bioquímica 30, 1162-1166.
  2. J. A. Doudna y T. R. Cech (2002) El repertorio químico de las ribozimas naturales. Nature 418, 222-228.
  3. D. M. J. Lilley (2003) Los orígenes de la catálisis de ARN en ribozimas. Tendencias en ciencias bioquímicas 28, 495-501.

Acerca de PDB-101

PDB-101 ayuda a profesores, estudiantes y al público en general a explorar el mundo 3D de proteínas y ácidos nucleicos. Conocer sus diversas formas y funciones ayuda a comprender todos los aspectos de la biomedicina y la agricultura, desde la síntesis de proteínas hasta la salud y la enfermedad hasta la energía biológica.

¿Por qué PDB-101? Investigadores de todo el mundo hacen que estas estructuras 3D estén disponibles gratuitamente en el archivo Protein Data Bank (PDB). PDB-101 crea materiales introductorios para ayudar a los principiantes a iniciarse en la materia ("101", como en un curso de nivel de entrada), así como recursos para el aprendizaje extendido.


Resumen de la sección

Los pre-ARNm eucarióticos se modifican con una tapa de metilguanosina 5 & # 8242 y una cola de poli-A. Estas estructuras protegen el ARNm maduro de la degradación y ayudan a exportarlo desde el núcleo. Los pre-ARNm también se someten a un empalme, en el que se eliminan los intrones y los exones se vuelven a conectar con precisión de un solo nucleótido. Sólo los ARNm terminados que se han sometido a protección 5 & # 8242, poliadenilación 3 & # 8242 y corte y empalme de intrones se exportan desde el núcleo al citoplasma. Los pre-rRNA y pre-tRNA se pueden procesar mediante escisión intramolecular, empalme, metilación y conversión química de nucleótidos. En raras ocasiones, la edición de ARN también se realiza para insertar bases faltantes después de que se ha sintetizado un ARNm.


Ver el vídeo: Tipos de Empalmes (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Tavio

    Cuáles son las palabras correctas ... super

  2. Sicheii

    Es obvio en mi opinión. No quería desarrollar este tema.

  3. Akishura

    una mala idea

  4. Arajin

    ¡No te desconciertes!



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