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A5. Modificación oxidativa de lípidos - Biología

A5. Modificación oxidativa de lípidos - Biología


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Figura: Modificación oxidativa de lípidos

Las etapas iniciales de la enfermedad cardiovascular parecen implicar el desarrollo de rayas de ácidos grasos debajo de las paredes de las arterias. Los macrófagos, una célula inmunitaria, tienen receptores que parecen reconocer las lipoproteínas oxidadas en la sangre, que absorben. Las células luego se convierten en células espumosas que contienen grasa que forman las rayas. La oxidación de ácidos grasos en lipoproteínas (posiblemente por ozono) podría producir peróxidos de lípidos y oxidación de proteínas en lipoproteínas. Las neuronas corticales de pacientes con síndrome de Down fetal muestran niveles de especies de O2 reactivas intracelulares de 3 a 4 veces y niveles aumentados de peroxidación de lípidos en comparación con las neuronas de control. Este daño se previene mediante el tratamiento de las neuronas en cultivo con captadores de radicales libres o catalasa.

Figura: captación de LDL oxidada

Un estudio reciente de peroxiredoxinas realizado por Neumann et al mostró la importancia de estos productos génicos en ratones. Las peroxidredoxinas (que catalizan la conversión de peróxidos y tiorredoxina en agua y tiorredoxina oxidada) son proteínas pequeñas con una cisteína de sitio activo y se encuentran en la mayoría de los organismos. La transcripción del gen de peroxiredoxina 1 de mamífero se activa por estrés oxidativo. Desactivaron el gen que produjo un ratón que podía reproducirse y parecía vital, pero que tenía una vida útil más corta. Estos ratones desarrollaron anemia hemolítica grave y varios tipos de cánceres. Se encontraron altos niveles de especies reactivas de oxígeno y el aumento resultante de los niveles de proteínas oxidadas en los glóbulos rojos de los ratones knock-out con anemia. Se encontraron altos niveles de 8-oxoguanina, resultado del daño oxidativo al ADN, en las células tumorales.


OP44 - Biología de sistemas del estrés oxidativo: primeros conocimientos sobre la oxidación de lípidos y las conversaciones cruzadas de modificación de proteínas

Investigaciones recientes indican que el estrés oxidativo (OS) afecta todos los niveles de la organización celular e induce perturbaciones en la expresión génica, la regulación epigenética, los niveles de ARNm y proteínas y el metabolismo celular. Las modificaciones oxidativas de proteínas y lípidos representan otro nivel de complejidad en la regulación celular respaldada por numerosos estudios que demuestran cómo estas modificaciones regulan la expresión génica y las vías de señalización celular. Sin embargo, es casi imposible especificar la entrada y las consecuencias (pato) fisiológicas del sistema operativo utilizando datos de un solo nivel de modificación. Hoy en día, está claro que solo un enfoque holístico, como lo sugiere la biología de sistemas, proporcionará una visión integrada de la regulación y patologías celulares relacionadas con el SO al considerar todos los determinantes conocidos del SO, identificar nuevos y establecer vínculos funcionales entre ellos.

Como primer esfuerzo para estudiar la OS a través de la biología de los sistemas redox, aplicamos un enfoque multiómico para caracterizar el impacto de la OS en los cardiomiocitos (MC) utilizando un modelo dinámico de estrés nitrosativo. Los lípidos carbonilados reactivos, los fosfolípidos hidroxilados y truncados, los ácidos grasos nitrados y los oxiesteroles se cuantificaron en relación con un control en extractos de lípidos de CM después de 15, 30, 70 min y 16 h de SG. Simultáneamente, se analizó la fracción de proteína para una amplia gama de modificaciones postraduccionales, como fosforilación, carbonilación, oxidación de cisteína y nitrosilación. Los datos ómicos se combinaron y apoyaron en estudios bioquímicos y microscópicos sobre la dinámica de oxidación, la distribución espacial y los efectos funcionales. Por lo tanto, la combinación de lipidómica, proteómica basada en datos e integración de biología de sistemas permitió la identificación de más de 200 proteínas modificadas por productos reactivos de peroxidación de lípidos, muchas de las cuales estaban involucradas en vías de señalización de calcio, regulación del citoesqueleto de actina, adhesión focal y fosfatidilinositol. sistema de señalización. Los estudios bioquímicos y de microscopía confirmaron aún más el deterioro derivado de la OS de la distribución de la señalización de Ca y la proteína citoesquelética.


Peroxidación lipídica

Medición de la peroxidación lipídica

La peroxidación de lípidos se puede determinar cuantitativa o cualitativamente mediante una variedad de métodos. Puede medirse por pérdidas de ácidos grasos, cantidades de productos de peroxidación primarios, cantidades de productos secundarios, como carbonilos y gases de hidrocarburos, y reducción de la actividad antioxidante. Algunos de los métodos más utilizados se describen a continuación. El análisis de ácidos grasos por cromatografía de gas líquido (GLC) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza para medir la pérdida de ácidos grasos insaturados, consecuencia de la peroxidación de lípidos. Los hidroperóxidos de lípidos, el producto principal de la peroxidación, se pueden medir directamente mediante HPLC con detectores de quimioluminiscencia. Los métodos de liberación de yodo y glutatión peroxidasa se utilizan a menudo para medir los peróxidos de lípidos. Los peróxidos lipídicos oxidan I - a I2 para la titulación con tiosulfato y, por tanto, el consumo de tiosulfato indica indirectamente la cantidad de peróxidos lipídicos. Los peróxidos e hidroperóxidos de hidrógeno oxidan el GSH reducido a GSSG. La adición de glutatión reductasa y NADPH reduce el GSSG de nuevo a GSH, lo que requiere el consumo de NADPH, que puede estar relacionado con el contenido de peróxido. Las trampas de giro (fenil t-butilnitrona) se utilizan con frecuencia para atrapar radicales intermedios. Los productos de la descomposición del peróxido de lípidos, como los gases de hidrocarburos y los aldehídos citotóxicos, pueden medirse mediante GLC o HPLC. Los productos de peroxidación lipídica pueden dañar el ADN y la formación de 8-oxo-2′-desoxiguanosina (8oxodG) es un marcador de daño oxidativo al ADN. El contenido de 8oxodG en el ADN se puede cuantificar mediante HPLC con un detector de CE y mediante un método inmunoquímico (ELISA).

Los ensayos más populares para medir la peroxidación de lípidos son la prueba del ácido tiobarbitúrico (TBA) y la determinación de la conjugación de dieno. En la prueba TBA, las muestras que contienen lípidos se calientan con TBA y un producto LP, malondialdehído (MDA) a un pH bajo para permitir la formación de un complejo de color rosa (ver reacción a continuación). La densidad del color está relacionada con el grado de peroxidación lipídica. Debido a su simplicidad y economía, este método se utiliza ampliamente en en vivo y in vitro ajustes. Durante el proceso de peroxidación de lípidos, se forman conjugaciones de dieno (una estructura de doble enlace-enlace simple-doble enlace) (ver peroxidación catalizada por enzimas), que absorben luz ultravioleta (UV) en el rango de longitud de onda de 230–235 nm. La absorción de luz ultravioleta a esta longitud de onda puede estar relacionada con el contenido de conjugados de dieno en extractos de lípidos de tejidos y, por tanto, con el grado de peroxidación de lípidos.

Otros métodos recientemente desarrollados y usados ​​de forma rutinaria son el ensayo de 4-hidroxinonenal y el ensayo de 8-iso-prostaglandina F2a. Los kits de Elisa ahora se utilizan principalmente para detectar varios aductos de peroxidación de lípidos. Estos kits están disponibles en el mercado, son bastante específicos y dan resultados precisos. Dado que se ha demostrado que tanto el MDA como el hidroxinonenal (HNE) son capaces de unirse a proteínas y formar aductos estables, también se consideran productos finales de peroxidación lipídica avanzada (ALE). El etanal, propanal, hexanal, glioxal, metilglioxal, 4-hidroxi-2-hexenal, acroleína, formaldehído y acetaldehído se consideran ALE. Estos son compuestos de carbonilo reactivo (CCR) y productos de glucoxidación del azúcar (llamados productos finales de glicación avanzada) que generalmente se acumulan con el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, como la aterosclerosis, la diabetes o las enfermedades neurodegenerativas. Los CCR inducen el "estrés carbonilo" que se caracteriza por la formación de aductos y enlaces cruzados en las proteínas, lo que conduce progresivamente a un mal funcionamiento de las proteínas y daños en todos los tejidos y consecuencias patológicas, incluida la citotoxicidad, la disfunción celular, la inflamación y la muerte celular apoptótica. Una mayor interacción con las proteínas por estos ALE puede causar cambios tanto estructurales como funcionales de las proteínas oxidadas. Específicamente, 4-HNE puede reaccionar con residuos de lisina, histidina o cisteína en la proteína para formar aductos. El inmunoensayo enzimático que se desarrolla es para la detección y cuantificación rápidas de estos aductos. En estos ensayos, la cantidad de aducto en muestras de proteína se determina comparando su absorbancia con la de un aducto conocido - curva estándar BSA.

El colesterol LDL, generalmente conocido como colesterol malo, es aún más peligroso cuando se oxida. El LDL oxidado (OxLDL) es más reactivo con los tejidos circundantes y puede acumularse dentro del revestimiento interno de las arterias. Los macrófagos, el colesterol y otros lípidos pueden acumularse en el sitio (aterosclerosis), formando finalmente una placa que puede provocar un ataque cardíaco, un derrame cerebral o la muerte. La oxidación de LDL afecta tanto a los componentes lipídicos como proteicos de LDL. Los productos de aldehído reactivos formados durante la oxidación de PFA, como MDA y 4-HNE, son capaces de unirse covalentemente a los grupos ε-amino de los residuos de lisina de ApoB-100 para formar aductos de MDA-Lys y HNE-Lys (MDA-LDL y HNE-LDL). La glicosilación avanzada, como la formación de CML-LDL y CEL-LDL, también está involucrada en la oxidación de LDL. El inmunoensayo enzimático está desarrollado para la detección y cuantificación de OxLDL humana en muestras de plasma, suero u otros fluidos biológicos. El kit, que está disponible fácilmente, contiene un estándar de LDL oxidado con cobre.

Históricamente, la medición de MDA mediante el ensayo TBARS (sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico) se ha utilizado con frecuencia para determinar la extensión de LP. Se considera inespecífico y generalmente es deficiente cuando se aplica a muestras biológicas. Los ensayos recientes se basan en la medición de aductos de lisina MDA o HNE. Es probable que sean más aplicables a muestras biológicas, ya que los aductos de estos aldehídos reactivos son relativamente estables. El descubrimiento de los isoprostanos como productos de peroxidación de lípidos, medidos por GCMS o inmunoensayo, ha abierto una nueva vía para la cuantificación indirecta de la peroxidación de lípidos. en vivo.


Correlación entre lipoproteína (a) y peroxidación lipídica en psoriasis: papel de la enzima paraoxonasa-1

Fondo: La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel asociada con un metabolismo anormal de los lípidos plasmáticos y con una alta frecuencia de eventos cardiovasculares. Se han informado modificaciones de los lípidos plasmáticos y un aumento en los niveles de marcadores bioquímicos de peroxidación lipídica en sujetos con psoriasis, lo que sugiere una relación entre psoriasis, lipoproteínas y daño oxidativo.

Objetivos: Investigar más a fondo la relación entre las lipoproteínas y el estrés oxidativo en la psoriasis.

Método: Se evaluaron los niveles de lípidos plasmáticos, lipoproteína (a) [Lp (a)] y marcadores de peroxidación lipídica en sujetos con psoriasis (n = 23) y en controles (n = 25). En los mismos sujetos, se investigó la actividad de la paraoxonasa-1 (PON1), un antioxidante y una enzima antiinflamatoria asociada a las lipoproteínas de alta densidad.

Resultados: Los resultados mostraron niveles más altos de Lp (a) en el suero de pacientes con psoriasis en comparación con los controles (P & lt0 · 001). Se observaron niveles más altos de hidroperóxidos lipídicos (P & lt0 · 001) y una menor actividad de PON1 en el suero de los pacientes en comparación con los sujetos sanos, lo que confirma que la psoriasis está asociada con el estrés oxidativo. El desequilibrio entre el estrés oxidativo y las enzimas antioxidantes y el aumento de los niveles séricos de Lp (a) se relacionaron con el alcance y la gravedad de la psoriasis. Finalmente, nuestros resultados demostraron que los niveles de Lp (a) se correlacionaron positivamente con los marcadores de peroxidación lipídica y se relacionaron negativamente con la actividad de PON1, lo que sugiere que los sujetos con niveles más altos de Lp (a) están más expuestos al daño oxidativo.

Conclusiones: Nuestros resultados proporcionan evidencia adicional de que el estrés oxidativo y el deterioro del sistema antioxidante en el plasma de los pacientes pueden desempeñar un papel en la patogénesis y la progresión de la psoriasis y las complicaciones relacionadas.


Modificación oxidativa in vivo de las proteínas de la membrana de los eritrocitos en la deficiencia de cobre

Se ha postulado que el estrés oxidativo contribuye a la patología asociada con la deficiencia de cobre en la dieta. In vivo, los eritrocitos son objetivos probables de daño oxidativo porque están expuestos a altas concentraciones de oxígeno y contienen hierro hemo que puede autooxidarse, lo que da como resultado la formación de aniones superóxido. La actividad de la importante enzima antioxidante, cobre, superóxido dismutasa de zinc, disminuye marcadamente en los eritrocitos durante la deficiencia de cobre. Se examinó el efecto de la deficiencia de cobre en la dieta sobre los indicadores de estrés oxidativo en las membranas de eritrocitos de ratas mantenidas con una dieta purificada deficiente en cobre durante 35 días después del destete. Los eritrocitos se separaron en poblaciones jóvenes y viejas en un gradiente de Percoll antes del aislamiento de la membrana y la cuantificación de los peróxidos de lípidos y los carbonilos de proteínas. Los carbonilos de proteína, determinados por inmunoensayo de transferencia Western, se detectaron predominantemente en las cadenas alfa y beta de la espectrina. Las subunidades alfa y beta de la espectrina en las membranas de eritrocitos de ratas deficientes en cobre contenían mayores cantidades de carbonilos que los controles, independientemente de la población de eritrocitos estudiada. Este estudio sugiere que la espectrina puede ser un objetivo específico para el daño oxidativo cuando la actividad de superóxido dismutasa de zinc y eritrocitos de cobre se reduce por la deficiencia de cobre.


Modificaciones y oxidación de lípidos y proteínas en suero humano detectadas por termoquimioluminiscencia

La detección de especies excitadas electrónicamente (EEE) en los fluidos corporales puede constituir una importante herramienta de diagnóstico en diversas patologías. Ejemplos de tales productos son los carbonilos excitados por triplete (TEC), que pueden ser una fuente de emisión de fotones en el rango de 400 a 550 nm. El objetivo del presente estudio fue determinar la contribución real de los componentes lipídicos y proteicos (carbonilos de proteínas) a la emisión de fotones generada por termoquimioluminiscencia (TCL) durante el calentamiento de fluidos biológicos. En este estudio, se utilizó un nuevo dispositivo de fotómetro TCL, diseñado por Lumitest Ltd, Israel. Las muestras se calentaron a una temperatura constante de 80 ± 0,5 ° C durante 280 sy se midió la emisión de fotones en varios momentos. Para comparar los resultados de las mediciones de TCL con los métodos convencionales de detección de oxidación de lípidos y proteínas, cada muestra examinada también se calentó en un baño de agua a 80 ° C durante 10-280 s. Posteriormente, se midió la oxidación de lípidos y proteínas utilizando métodos convencionales. Se midió el TCL de cuatro ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) con tres a seis dobles enlaces. La elevación de la amplitud de PUFA TCL se correlacionó con el aumento en el número de dobles enlaces de PUFA. También se observó una correlación entre el aumento en la intensidad de TCL y la generación de carbonilo de proteína en albúmina de suero bovino (BSA). En el suero sanguíneo venoso, nuestro estudio mostró que un aumento de la intensidad de TCL durante el calentamiento reflejaba la escisión de TEC de origen lipídico. Nuestro estudio sugiere que moléculas biológicas como proteínas, lípidos y otras moléculas, que pueden volverse inestables durante el calentamiento, son capaces de generar EES. Demostramos que una curva TCL se puede utilizar como modelo cinético para medir procesos oxidativos, que refleja modificaciones de diferentes moléculas involucradas en los fenómenos de estrés oxidativo. Copyright © 2003 John Wiley & Sons, Ltd.


1. Introducción

De las muchas vacunas COVID-19 en desarrollo, las dos vacunas que han mostrado los resultados más prometedores en la prevención de la infección por COVID-19 representan una nueva clase de productos vacunales: están compuestas por hebras de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) encapsuladas en nanopartículas lipídicas ( LNP). La eficacia de estas vacunas de ARNm desarrolladas por BioNTech / Pfizer y Moderna es aproximadamente del 95% (Baden et al., 2021 Polack et al., 2020) y fueron las primeras vacunas de ARNm en recibir & # x02018 autorización de uso de emergencia & # x02019 (por FDA ) y & # x02018aprobación condicional & # x02019 por EMA. Estas vacunas de ARNm COVID-19 codifican la glicoproteína viral Spike (S) del SARS-CoV-2 que incluye dos sustituciones de prolina (mutaciones K986P y V987P), para estabilizar la conformación de prefusión de la glicoproteína (Wrapp et al., 2020) . Tras la administración intramuscular (IM), el sistema LNP permite la captación por las células huésped y la entrega de ARNm dentro del citosol, donde se produce la traducción de la secuencia de ARNm a la proteína S en los ribosomas. Después del procesamiento posterior a la traducción por parte de las células huésped, la proteína S se presenta como un antígeno unido a la membrana en su conformación de prefusión en la superficie celular, proporcionando el antígeno diana para las células B. Además, parte de las proteínas Spike producidas temporalmente entran en las vías de presentación de antígenos, proporcionando reconocimiento de antígenos por las células T a través de la presentación MHC de epítopos de células T (Verbeke et al., 2021). El informe de evaluación de la EMA formula el mecanismo de acción de las vacunas de ARNm en el sitio de inyección de la siguiente manera: & # x02018 La administración de vacunas de ARN formuladas con LNP por vía intramuscular da como resultado una inflamación local transitoria que impulsa el reclutamiento de neutrófilos y células presentadoras de antígeno (APC) al sitio de entrega. Las APC reclutadas son capaces de captar LNP y expresión de proteínas y posteriormente pueden migrar a los ganglios linfáticos de drenaje local donde ocurre el cebado de células T (EMA, 2020a). & # X02019 Debido a esta inherente actividad inmune innata, no es necesario formular el ARNm vacunas con adyuvantes adicionales. Curiosamente, Pfizer / BioNTech y Moderna usan específicamente ARNm modificado con nucleósidos que disminuyen (en lugar de aumentar) la inmunogenicidad inherente del ARNm, lo que subraya la necesidad de equilibrar adecuadamente la actividad inmune innata de las vacunas de ARNm (ver más abajo). los en vivo La producción de antígeno posterior a la administración que se puede lograr con las vacunas de ARNm, junto con las propiedades autoadyuvantes de las vacunas de ARNm-LNP, conduce finalmente a la generación eficiente de respuestas de anticuerpos neutralizantes e inmunidad celular, disminuyendo el riesgo de desarrollar COVID-19 para la receptores de la vacuna.

Las vacunas de ARNm tienen varios beneficios sobre otros tipos de vacunas. Una ventaja general de las vacunas de ARNm es que su desarrollo es relativamente rápido, ya que los ARNm-LNP son una verdadera plataforma tecnológica. Después de la identificación de los antígenos proteicos protectores y la secuenciación de los genes correspondientes, el ARNm se puede producir en unas semanas (Jackson et al., 2020). Dado que los ARNm que codifican diferentes antígenos son química y físicamente muy similares, el diseño de la formulación y los procesos de fabricación de nuevas vacunas de ARNm siguen los mismos pasos (Petsch et al., 2012). En comparación con los vectores virales de replicación deficiente, las vacunas de ARNm pueden ser más eficaces para la prevención de COVID-19. A diferencia de las vacunas basadas en vectores virales, no generan inmunidad contra el portador. En este sentido, las vacunas de ARNm son similares a las vacunas basadas en ácido desoxirribonucleico (ADN). Las vacunas de ADN, sin embargo, todavía tienen una mínima posibilidad de integración potencial del genoma. Además, a diferencia de las vacunas de ARNm, las vacunas de ADN han mostrado una inmunogenicidad bastante baja en los primeros ensayos clínicos, posiblemente porque las vacunas basadas en ADN necesitan acceder al núcleo para ejercer su acción, lo que complica la administración eficiente. En general, el diseño flexible, los procesos de producción estandarizados y la presencia citoplasmática de vida relativamente corta hacen que las vacunas de ARNm sean muy poderosas, especialmente en una situación de pandemia con virus que muta rápidamente.

Sin embargo, uno de los mayores desafíos que se encuentran al desarrollar vacunas de ARNm es su escasa estabilidad. Actualmente, la mayoría de las vacunas de ARNm se administran por vía IM, donde el ARNm que es captado por las células huésped conduce a la expresión del antígeno (Hassett et al., 2019). Las primeras investigaciones sobre vacunas de ARNm han demostrado que el ARNm desnudo se degrada rápidamente después de la administración (Pardi et al., 2015, Wayment-Steele et al., 2020). En consecuencia, en los últimos años se han realizado esfuerzos para mejorar la en vivo estabilidad del ARNm después de la administración. Esto condujo a formas de optimizar la estructura del ARNm al ralentizar su degradación (consulte la sección & # x02018estabilidad del ARNm & # x02019). Otro enfoque exitoso y ampliamente utilizado en la actualidad es encapsular y proteger el ARNm en LNP (Pardi et al., 2015). Esto reduce la degradación prematura del ARNm después de la administración y mejora la entrega al citosol de las células presentadoras de antígenos (Liang et al., 2017, Lindsay et al., 2019).

Aunque se ha avanzado para mejorar la estabilidad en vivo y eficacia de las vacunas de ARNm-LNP, se ha prestado mucha menos atención a su estabilidad durante el almacenamiento (Crommelin et al., 2021). Para distribuir eficazmente una vacuna en todo el mundo, debe tener una vida útil lo suficientemente larga, preferiblemente a la temperatura del refrigerador (2 & # x020138 & # x000a0 & # x000b0C) o superior. Actualmente, apenas hay datos disponibles en el dominio público sobre lo que sucede cuando las formulaciones de ARNm-LNP se almacenan durante largos períodos de tiempo. Además, no está claro en qué medida la captura de ARNm dentro de los LNP influye en la estabilidad de almacenamiento de la vacuna de ARNm. Además, se sabe muy poco sobre la estructura y morfología de los LNP formulados con ARNm, la estabilidad química de los componentes de LNP y la estabilidad coloidal del sistema ARNm-LNP. Lo que se sabe ahora es que para almacenar las vacunas de ARNm COVID-19 actuales durante períodos de tiempo más largos, deben congelarse. Las vacunas de ARNm COVID-19 actuales de Moderna y BioNTech / Pfizer deben mantenerse entre & # x0221215 y & # x0221225 & # x000a0 & # x000b0C y entre & # x0221260 y & # x0221290 & # x000a0 & # x000b0C, respectivamente (EMA, 2020a, EMA , 2021). Hasta la fecha, los procesos de degradación y las razones por las que los requisitos de temperatura de almacenamiento difieren, no se comprenden completamente.

El requisito de almacenar los ARNm-LNP en un estado congelado dificulta la distribución de la vacuna. Especialmente, la temperatura muy baja de & # x0221260 a & # x0221290 & # x000a0 & # x000b0C es un obstáculo importante en lo que respecta al transporte, almacenamiento y distribución de vacunas entre los usuarios finales de todo el mundo. La mayoría de las demás vacunas se pueden almacenar a 2 & # x020138 & # x000a0 & # x000b0C. Claramente, existe la necesidad y la oportunidad de encontrar formas de estabilizar las vacunas de ARNm-LNP para permitir el almacenamiento no congelado. Esta revisión proporciona una descripción general de los enfoques para hacer que las vacunas de ARNm sean más estables, de modo que puedan almacenarse por más tiempo a temperaturas menos extremas. Para explorar el tema, se discuten las características de las vacunas de ARNm-LNP y su influencia en la estabilidad de almacenamiento. Esta información se utiliza para identificar las razones de la inestabilidad de la vacuna de ARNm y explorar opciones tecnológicas para mejorar la estabilidad.


Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son productos metabólicos obligatorios de las células aeróbicas. Se mantienen en niveles bajos por un sistema antioxidante que incluye enzimas como superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasas (GPX), tiorredoxinas (TRX) y peroxiredoxinas (PRDX), y otras moléculas con propiedades depuradoras como como glutatión (GSH), ubiquinol, vitaminas C y E, etc. [1]. Sin embargo, cuando el sistema antioxidante está desregulado y la producción de ROS se exacerba, estas moléculas activas se convierten en subproductos dañinos del metabolismo celular [1].

Los espermatozoides de mamíferos son sensibles a ROS, como el anión superóxido (O2 • -), peróxido de hidrógeno (H2O2), óxido nítrico (NO •), hidroxilo (HO •) y anión peroxinitrito (ONOO -). Cuando los niveles de ROS aumentan, la función de los espermatozoides se ve afectada y conduce a la infertilidad [2-6]. Este aumento de los niveles de ROS se denomina estrés oxidativo y es el resultado de una producción excesiva de ROS y / o una disminución del sistema de defensa antioxidante [7, 8]. El daño oxidativo se dirige a todos los componentes celulares, reduciendo la motilidad de los espermatozoides y la actividad mitocondrial [5, 9, 10]. La primera evidencia de una relación entre el daño oxidativo y la infertilidad masculina fue demostrada por el trabajo pionero de Thaddeus Mann y Bayard Storey [11, 12].

La población infértil ha aumentado durante las últimas décadas [13]. Sin embargo, la eficacia del tratamiento es deficiente porque se desconoce la causa en el 40% -50% de los casos [14]. Varios factores están relacionados con la infertilidad, como la exposición a contaminantes ambientales, sustancias químicas, drogas, humo, toxinas, radiación e incluso enfermedades [15-18]. Una característica común de lo anterior es la producción de estrés oxidativo. En tales condiciones, los componentes vitales de la célula (proteínas, lípidos y ADN) se oxidan, lo que compromete la función celular y la supervivencia [8, 19]. En al menos el 25% de los casos, se detectan niveles elevados de ROS tanto en el semen como en los espermatozoides de pacientes infértiles [2-5]. En algunos casos de infertilidad masculina, el sistema antioxidante presente en el semen [20, 21] no es suficiente para proteger a los espermatozoides de daños dependientes de ROS. Los espermatozoides de pacientes infértiles tienen peroxidación de los lípidos de la membrana [22], fragmentación del ADN y oxidación de las bases [23, 24], bajo potencial de membrana mitocondrial [25, 26] e inactivación de enzimas asociadas con la motilidad [27, 28].

Modificaciones de proteínas en espermatozoides debido a especies reactivas de oxígeno

Las proteínas del esperma son el objetivo de modificaciones dependientes de redox que conducirán, dependiendo de los niveles de ROS, a la activación / inactivación de vías de señalización importantes para la fisiología del esperma o al daño oxidativo y deterioro de las funciones vitales (Tablas 1 y 2). Algunas de estas modificaciones son reversibles, lo que permite una regulación estricta de los procesos celulares implicados en la señalización redox [29, 30]. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática de las principales modificaciones de la proteína redox.

Modificaciones de proteínas dependientes de redox. Dependiendo del tipo de ROS producidos, se producen diferentes modificaciones de proteínas para controlar los procesos celulares o, cuando estos ROS están en niveles altos, promueven el daño por inactivación de la función de la proteína (es decir, actividad enzimática, alteración de la estructura conformacional, etc.). Peróxido de hidrógeno (H2O2) y otros peróxidos promueven diferentes modificaciones proteicas dependiendo de los niveles en los que estén presentes en la célula. El estrés oxidativo leve promoverá principalmente la oxidación del tiol y la S-glutatión. Estas modificaciones dependientes de redox son fácilmente revertidas por antioxidantes (compuestos no enzimáticos). Un fuerte estrés oxidativo conduce a la sulfonación, una modificación que es más difícil de revertir (requiere una reacción enzimática con el consumo de energía). La 4-HNE forma aductos de proteínas que inactivan de forma irreversible enzimas como la succinato deshidrogenasa en los espermatozoides. Superóxido (O2 • -) espontáneamente o por la actividad superóxido dismutasa se dismuta a H2O2 o podría combinarse con óxido nítrico (NO •) para dar ONOO -. Óxido nítrico y ONOO: promueven la S-nitrosilación y la nitración de tirosina que podría participar en procesos fisiológicos y patológicos.

Modificaciones de proteínas dependientes de redox. Dependiendo del tipo de ROS producidos, se producen diferentes modificaciones de proteínas para controlar los procesos celulares o, cuando estos ROS están en niveles altos, promueven el daño por inactivación de la función de la proteína (es decir, actividad enzimática, alteración de la estructura conformacional, etc.). Peróxido de hidrógeno (H2O2) y otros peróxidos promueven diferentes modificaciones proteicas dependiendo de los niveles en los que estén presentes en la célula. El estrés oxidativo leve promoverá principalmente la oxidación del tiol y la S-glutatión. Estas modificaciones dependientes de redox son fácilmente revertidas por antioxidantes (compuestos no enzimáticos). Un fuerte estrés oxidativo conduce a la sulfonación, una modificación más difícil de revertir (requiere una reacción enzimática con el consumo de energía). La 4-HNE forma aductos de proteínas que inactivan de forma irreversible enzimas como la succinato deshidrogenasa en los espermatozoides. Superóxido (O2 • -) espontáneamente o por superóxido dismutasa la actividad se dismuta a H2O2 o podría combinarse con óxido nítrico (NO •) para dar ONOO -. Óxido nítrico y ONOO: promueven la S-nitrosilación y la nitración de tirosina que podría participar en procesos fisiológicos y patológicos.

Modificaciones de proteínas dependientes de redox asociadas con procesos fisiológicos en espermatozoides.

Modificación. Procesos fisiológicos. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Unión de espermatozoides con epitelio oviductal Bovino [ 142, 143]
Motilidad de los espermatozoides Hámster, humano, rata [ 144– 147]
Capacitación de esperma Humano, bovino [ 120, 123, 143, 148]
Remodelación de la cromatina espermática Humano, ratón, equino, conejo, rata [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosilación Motilidad de los espermatozoides Humano [ 76, 152]
Nitración de tirosina Capacitación de esperma Humano [ 83, 153]
Modificación. Procesos fisiológicos. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Unión de espermatozoides con epitelio oviductal Bovino [ 142, 143]
Motilidad de los espermatozoides Hámster, humano, rata [ 144– 147]
Capacitación de esperma Humano, bovino [ 120, 123, 143, 148]
Remodelación de la cromatina espermática Humano, ratón, equino, conejo, rata [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosilación Motilidad de los espermatozoides Humano [ 76, 152]
Nitración de tirosina Capacitación de esperma Humano [ 83, 153]

Modificaciones de proteínas dependientes de redox asociadas con procesos fisiológicos en espermatozoides.

Modificación. Procesos fisiológicos. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Unión de espermatozoides con epitelio oviductal Bovino [ 142, 143]
Motilidad de los espermatozoides Hámster, humano, rata [ 144– 147]
Capacitación de esperma Humano, bovino [ 120, 123, 143, 148]
Remodelación de la cromatina espermática Humano, ratón, equino, conejo, rata [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosilación Motilidad de los espermatozoides Humano [ 76, 152]
Nitración de tirosina Capacitación de esperma Humano [ 83, 153]
Modificación. Procesos fisiológicos. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Unión de espermatozoides con epitelio oviductal Bovino [ 142, 143]
Motilidad de los espermatozoides Hámster, humano, rata [ 144– 147]
Capacitación de esperma Humano, bovino [ 120, 123, 143, 148]
Remodelación de la cromatina espermática Humano, ratón, equino, conejo, rata [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosilación Motilidad de los espermatozoides Humano [ 76, 152]
Nitración de tirosina Capacitación de esperma Humano [ 83, 153]

Modificaciones de proteínas dependientes de redox asociadas con efectos deletéreos en espermatozoides.

Modificación. Resultado asociado. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Infertilidad masculina Humano [ 38, 39, 42]
Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Hámster, humano, rata [ 42, 154, 155]
Bloqueo de la fusión espermatozoide-óvulo Ratón [ 156, 157]
Aductos de proteína 4-HNE Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, equino [ 62, 158, 159]
S-glutationilación Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Nitración de tirosina Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34, 80]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Sulfonacion Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, rata [ 42, 60, 154]
Deterioro de la maduración del epidídimo. Rata [ 154]
Modificación. Resultado asociado. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Infertilidad masculina Humano [ 38, 39, 42]
Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Hámster, humano, rata [ 42, 154, 155]
Bloqueo de la fusión espermatozoide-óvulo Ratón [ 156, 157]
Aductos de proteína 4-HNE Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, equino [ 62, 158, 159]
S-glutationilación Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides Humano [ 34]
Nitración de tirosina Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34, 80]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Sulfonacion Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, rata [ 42, 60, 154]
Deterioro de la maduración del epidídimo Rata [ 154]

Modificaciones de proteínas dependientes de redox asociadas con efectos deletéreos en espermatozoides.

Modificación. Resultado asociado. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Infertilidad masculina Humano [ 38, 39, 42]
Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Hámster, humano, rata [ 42, 154, 155]
Bloqueo de la fusión espermatozoide-óvulo Ratón [ 156, 157]
Aductos de proteína 4-HNE Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, equino [ 62, 158, 159]
S-glutationilación Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Nitración de tirosina Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34, 80]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Sulfonacion Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, rata [ 42, 60, 154]
Deterioro de la maduración del epidídimo. Rata [ 154]
Modificación. Resultado asociado. Especies Referencia.
Oxidación del tiol Infertilidad masculina Humano [ 38, 39, 42]
Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Hámster, humano, rata [ 42, 154, 155]
Bloqueo de la fusión espermatozoide-óvulo Ratón [ 156, 157]
Aductos de proteína 4-HNE Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano, equino [ 62, 158, 159]
S-glutationilación Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides Humano [ 34]
Nitración de tirosina Deterioro de la motilidad de los espermatozoides. Humano [ 34, 80]
Deterioro de la capacidad de los espermatozoides Humano [ 34]
Sulfonacion Impairment of sperm motility Human, rat [ 42, 60, 154]
Impairment of epididymal maturation Rata [ 154]

Thiol oxidation

Cysteine, a sulfur-containing amino acid, is a potent nucleophile under physiological conditions. This remarkable reactivity is due to the thiol (-SH) group. The formation of disulfide bridges (-SS-) by thiol oxidation is a common strategy to fold a protein generating a structure to assure, for instance, enzymatic activity or interaction with receptors, plasma membrane components, etc. A specific ratio -SS-/–SH within a protein molecule is essential to assure its function, and this rate can be affected by ROS. An oxidative stress will oxidize free -SH, thus preventing the formation of -SS- where and when it is needed during a physiological process and will translate in the impairment of protein function. A good example of this situation is the effects of high levels of ROS on the ATP production by human spermatozoa. It was observed that elevated levels of ROS, generated by direct addition of H2O2 or by adding xanthine-xanthine oxidase system (generator of O2 •− and of H2O2) to the incubation medium, reduce human sperm motility in a dose- and time-dependent manner [ 31]. This reduction was correlated with a decrease in the ATP production by the spermatozoon [ 32], thus suggesting that the impairment of sperm motility was a depletion of energy. Human spermatozoa depend on aerobic oxidation of glucose accomplish by the conjunction of glycolysis, Krebs cycle, and the oxidative phosphorylation by the electron transport chain. In 1992, de Lamirande and Gagnon [ 32] suggested that one possible target of ROS could be the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, which is linked to the fiber sheath explaining the drop in ATP production observed in ROS-treated spermatozoa. Recently, it was demonstrated that the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, a key enzyme of the glycolytic pathway, can be inactivated by oxidation of the –SH in its active site by exogenous H2O2 [ 33].

An appropriate level of thiol oxidation in proteins is necessary for sperm motility [ 144– 147]. However, the machinery that makes the spermatozoon to move is very sensitive to ROS [ 42, 154, 155] levels that decrease motility significantly do not impair the viability of these spermatozoa [ 34]. But most importantly, ROS alter motility differently for instance, 100 μM H2O2 promotes a significant decrease in motility and inhibits capacitation of human spermatozoa compared to nontreated controls. However, 100 μM DA-NONOate, a NO • donor, do not affect sperm motility and even stimulate capacitation [ 34]. It is also important to highlight that 200–500 μM DA-NONOate inhibits sperm capacitation without impairing motility or viability [ 34]. Altogether, these findings indicate that there is a need to identify which specifics ROS are at high levels in infertile men to better find treatment strategies to avoid their toxic effects.

Another possible target of ROS is tubulin, a structural protein of the sperm flagellum. We found that increasing concentrations of H2O2 promoted an increase in thiol oxidation levels of α-tubulin in human spermatozoa [ 1]. Thiol oxidation of α-tubulin impaired microtubule polymerization and thus affecting the appropriate functioning of the flagellum [ 35].

Sperm chromatin remodeling is completed during epididymal maturation [ 36, 37]. During this process, an appropriate balance of thiol oxidation in protamines assures a healthy sperm chromatin structure. Both reduction and over oxidation of protamine thiols are associated with male infertility [ 38, 39].

Peroxiredoxins are selenium-free enzymes with one (PRDX6) or two cysteines (PRDX1 to 5) in their active site that are highly reactive with H2O2 and other peroxides. They compose the primary antioxidant system in ejaculated human spermatozoa since the amount of reduced GSH is insufficient (∼0.1 mM), the absence of CAT, and inactivation of mitochondrIal GPX4 as ROS scavenger [ 40, 41]. They are considered essential elements of the antioxidant defense of spermatozoa since infertile men have low amounts of PRDXs with high levels of thiol oxidation. This modification promotes the inactivation of their enzymatic activity and thus generating an increase of oxidative stress and DNA damage [ 42]. Mouse spermatozoa lacking PRDX6 display low motility and high levels of lipid peroxidation (a marker of oxidative stress) and poor sperm quality. This poor sperm quality is associated with subfertility which is exacerbated with age [ 2, 3]. The absence of PRDX4 also leads to loss of spermatogenic cells and increase of apoptosis in the testis without a significant reduction of fertility of the knockout males [ 43]. Although not measured, the authors concluded that the spermatogenic cell loss and the increase in apoptosis are due to an oxidative stress generated by the absence of PRDX4.

Peroxiredoxins are highly sensitive to ROS, and an active reductant system must be taken in place to maintain active their peroxidase activity [ 44]. In the case of 2-Cys PRDXs, this re-activation is done by the TRX/TRX reductase/NADPH system. The functional deletion of thioredoxin domain-containing proteins Txndc2 and Txndc3 in mouse spermatozoa correlated with an increase of age-related oxidative stress [ 45]. The thiol oxidized PRDX6 cannot be reduced by the TRXs and requires the presence of reduced GSH and glutathione-S-transferase pi (GSTpi) [ 46]. Ascorbate can also reduce PRDX6 as it was reported in yeast [ 47]. However, later studies using yeast and mammalian somatic cells revealed that the GSH/GSTpi system is the physiological mechanism to reduce PRDX6 [ 48– 50]. Since the GSH content is very low in spermatozoa [ 51], it is possible that ascorbate may be necessary to maintain the peroxidase activity of PRDX6. In mouse, we demonstrated that PRDX6 is important to protect the paternal genome from oxidative damage [ 52, 53]. The fact ascorbic acid protected human sperm DNA against oxidative damage [ 54] supports the hypothesis yet to be proven that PRDX6 may be reduced by ascorbate rather than by the GSH/GST system in spermatozoa.

Rat epididymal spermatozoa, collected after 24 h of the end of treatment for 2 weeks with tert-BHP, a compound that generates an oxidative stress in vivo, showed increasing levels of thiol oxidation of PRDX1 and PRDX6, the most abundant PRDXs in the rat spermatozoa [ 4]. This treatment was meant to generate the oxidative stress during the epididymal maturation, and this PRDXs oxidation reflects the scavenging activity of these enzymes in an attempt to fight against the oxidative stress caused. Moreover, the total amount of PRDX1, PRDX4, and PRDX6 increased in the treated spermatozoa, suggesting an active transfer of these enzymes from the epididymal epithelium to the maturing spermatozoa [ 4]. This active transfer of antioxidant enzymes has also been reported for other proteins including GPX5 and TRX [ 55–59].

Infertile men have a lower quantity of PRDXs in seminal plasma and spermatozoa than healthy donors [ 42]. Sperm PRDX6 was low in 67% and 39% varicocele and idiopathic infertile patients, respectively. Sperm PRDX1 was only low in 42% of varicocele patients [ 42]. In most of the cases of infertility, higher levels of thiol oxidation of PRDX1 and PRDX6 were observed in sperm from these infertile men. The thiol oxidation ratio (thiol oxidized PRDX/reduced PRDX) negatively and positively correlated with sperm motility and DNA damage and lipid peroxidation, respectively [ 42]. Interestingly, sperm levels of high molecular mass complexes of hyperoxidized PRDX6 were greater in both infertile men groups than in donors and the PRDX6 thiol oxidation ratio correlated positively with lipid peroxidation in spermatozoa [ 42]. These higher molecular mass complexes contain the sulfonated form of PRDXs (PRDX-SO2) a kind of redox-dependent modification that occurs when a strong oxidative stress is established [ 60].

Another significant modification of thiol groups by ROS is the formation of protein adducts with electrophiles such as aldehyde 4-hydroxynonenal (4-HNE) and acrolein, products of lipid peroxidation [ 61]. Both electrophiles promoted an increase in mitochondrial ROS production and reduction, DNA damage and reduction of motility in spermatozoa [ 62, 63]. The 4-HNE-dependent protein modification promotes the inactivation of succinate dehydrogenase and dynein heavy chain, both important proteins of the motility machinery of human spermatozoa. The modification of heat shock protein A2 by 4-HNE promoted its degradation by the proteasome system in male germ cells [ 64]. The recent evidence that the inhibition of arachidonate 15-lipoxygenase prevented the 4-HNE-induced protein damage in male germ cells [ 65] supports the potential advantage of pharmacological inhibition of this enzyme to protect germ cells from oxidative damage. Acrolein is capable of forming adducts with proteins and DNA and thus promoting its deleterious effects observed in spermatozoa [ 62, 63] that may include enzyme inactivation and mutagenesis [ 66, 67]. It has been reported that acrolein impairs the activity of the TRX/TRD system and PRDX [ 68].

S-Glutathionylation

Glutathione is a water-soluble tripeptide ubiquitously distributed in tissues. It is the predominant nonprotein source of intracellular SH groups (∼1–10 mM in most of the mammalian cells) present in the cytosol (∼90% of the total GSH), mitochondria, endoplasmic reticulum, and possibly in the nucleus [ 69, 70]. Protein S-glutathionylation occurs when GSH reacts with protein SH groups, often resulting in enzyme inactivation [ 71–74]. This mechanism may appear detrimental for the cell, but it is protective because it prevents further protein oxidation and it is reversible [ 8, 75].

Mammalian spermatozoa have a little amount of GSH (1–13 nmoles GSH/10 9 spermatozoa) and particularly in humans is approximately 0.3 mM [ 51] compared to the 10 mM found in most somatic cells [ 5]. Thus, the contribution of this antioxidant compound in the defense against oxidative stress is limited. This restriction will impact on antioxidant enzymes, for instance, PRDXs that require GSH for reduction of their thiol groups after ROS oxidized them. This particular topic will be discussed later in this review.

Human and mouse sperm proteins are subjected to S-glutathionylation we observed that mouse spermatozoa, lacking PRDX6, show higher levels of this modification compared to wild-type controls [ 34]. Human spermatozoa treated with H2O2 or tet-butyl hydroperoxide (tert-BHP) showed higher levels of glutathionylated proteins than nontreated controls [ 34]. Although the increase of S-glutathionylation was an antioxidant response, it was not sufficient as the oxidative stress generated either by lacking PRDX6 or by exogenously increasing the levels of ROS severely affected sperm motility.

The response of human spermatozoa to high levels of H2O2 or tert-BHP depended on the concentration of each ROS H2O2 generates S-glutathionylation at lower concentrations than tert-BHP, indicating a more reactive molecule capable of damaging the spermatozoon. Interestingly, this significant reduction in total and progressive motility was observed in viable spermatozoa [ 34]. This observation highlights the differential effects of ROS on sperm functions.

S-Glutathionylation was observed in the cytosolic and Triton X-100-insoluble fractions in human spermatozoa treated with high concentration of H2O2 [ 34]. Members of the human sperm antioxidant system may be inactivated by S-glutathionylation and therefore trigger a strong oxidative stress associated with the impairment of sperm motility and capacitation. PRDX1, PRDX5, and PRDX6 are found in the Triton X-100-soluble fraction, and PRDX6 is also found in the cytosolic and Triton X-100 soluble fractions [ 60]. We then can hypothesize that S-glutathionylation also contributes with the inactivation of these PRDXs, explaining the high oxidative stress associated with poor sperm quality observed in infertile men [ 42].

S-Nitrosylation and tyrosine nitration

Nitric oxide (NO • ) or its derivatives (e.g. ONOO − ) generate S-nitrosylation in proteins. High levels of NO • and ONOO − can modify structural proteins and enzymes, thus altering cellular function. However, low levels of these ROS are involved in redox signaling [ 6, 7]. About 240 s-nitrosylated proteins were identified in human spermatozoa treated with the NO • donor nitrosocysteine [ 76]. Enzymes involved in energy production, motility, ion channels, and in antioxidant defense were identified as modified by s-nitrosylation, indicating that this modification may be involved in redox regulation of sperm physiological processes. Of interest, PRDX1, GST, and thioredoxin domain-containing protein 3 and 11 carried this modification (for a complete list of s-nitrosylated proteins, see Lefièvre et al. [ 76]).

Peroxiredoxins are susceptible to NO • or ONOO − attack for instance, S-nitrosylation impairs the ability of PRDX2 to reduce peroxide, thus promoting neuronal cell oxidative stress [ 77] and, as mentioned above, PRDX1 was identified as one of the S-nitrosylated proteins due to nitroso-cysteine treatment in human spermatozoa [ 76].

Tyrosine (Tyr) nitration is also a protein modification promoted by NO • and ONOO − . A Tyr residue reacts with these ROS producing a nitro (-NO2) group. This modification will alter protein function leading to either a physiological or pathological effect, depending on the protein target and the level of ROS generated [ 78, 79]. It has been reported that spermatozoa from asthenozoospermic patients had high levels of Tyr nitration determined by immunocytochemistry [ 80]. Human spermatozoa treated with DA-NONOate show increased levels of Tyr nitration in a dose-dependent manner, a modification associated with the impairment of sperm motility [ 34]. Tyr-nitrated proteins were located in the Triton X-100-insoluble fraction of human spermatozoa. Immunocytochemistry studies showed that these modified proteins were mainly found in the flagellum in nonpermeabilized spermatozoa but also in the head when the sperm cells were permeabilized with methanol [ 34, 81].

Protein targets for NO • and ONOO − that display Tyr nitration and may account for impairment of sperm motility are enzymes belong to glycolysis (glyceraldehyde 3-P- dehydrogenase and enolase) and the Krebs cycle (aconitase, α-ketoglutarate dehydrogenase, malate dehydrogenase, and dihydro lipoamide dehydrogenase) (see references in Morielli and O’Flaherty [ 34]). By inactivating these enzymes by Tyr nitration, the production of ATP is severely diminished leading to an impairment of sperm motility. α-tubulin also can be modified by Tyr nitration [ 82], interfering with appropriate microtubule polymerization in the sperm flagellum.

Tyrosine nitration was found mostly in the Triton X-100-insoluble fraction [ 34], where PRDX1, PRDX5, and PRDX6 were found [ 60]. It is possible then that PRDXs are the target of NO • or ONOO − and be inactivated by Tyr nitration, leading to an increase in ROS levels that will impair sperm motility and capacitation.

Tyrosine nitration is also associated with sperm capacitation. Levels of Tyr nitration increased in spermatozoa exposed to ONOO − in a dose-dependent manner but at concentrations that do not affect sperm motility [ 34, 83]. The prevention of the time-dependent Tyr nitration by SOD (O2 •− scavenger) or L-NMMA (inhibitor of nitric oxide synthase (NOS)) that prevent capacitation in spermatozoa under capacitating conditions strongly suggests that ONOO − is endogenously produced during human sperm capacitation [ 84].

Redox signaling during sperm capacitation

Phosphorylation of proteins (e.g. enzymes, receptors and transcription factors) [ 85–92] and the redox regulation (which involves the oxidation of a signaling molecule) [ 93–96] represent two primary mechanisms regulating cell function. In essence, they resemble on–off switches for proteins [ 93, 96]. Under physiological conditions, the reversibility of these reactions is spontaneous or assured by reductive pathways or are catalyzed by enzymes [ 93, 97].

Growing evidence highlights the importance of H2O2 signaling in cell physiology [ 98– 100].

The redox regulation is essential for sperm capacitation [ 101–104]. Low levels of ROS trigger early, intermediate, and late phosphorylation events [ 105–109] that culminate with the increased capacitation-associated Tyr phosphorylation [ 101, 102]. Catalase, GPXs, and PRDXs are recognized scavengers of H2O2, but PRDXs are more versatile with a dual action as antioxidant and as modulators of H2O2-dependent signaling [ 44, 98, 100, 110–114]. This dual action of PRDXs is necessary for mammalian spermatozoa because these cells lack CAT (peroxisomes, containing the enzyme, are eliminated from germ cells during spermatogenesis [ 115, 116], and GPX4 is a structural protein involved in the mitochondrial sheath without antioxidant capacity in the ejaculated spermatozoa [ 117]. Other GPXs such as GPX2, 3, and 5 are not present in human spermatozoa [ 118, 119], and inhibition of either CAT or the GPX system did not increase the levels of lipid peroxidation in human spermatozoa [ 40]. Thus, the highly abundant and reactive PRDXs with different ROS become major players not only in the protection against oxidative damage but the regulation of the redox signaling in human spermatozoa [ 40–42, 60, 101–103].

We observed differential subcellular localization of the six PRDX isoforms in human spermatozoa and that PRDX1, PRDX4, PRDX5, and PRDX6 react with different concentrations of H2O2 [ 60]. Interestingly, PRDX6 is highly abundant and the only member of the family present in all the subcellular compartments of human spermatozoa and to react with H2O2 at levels (50 μM) that promote CAP, as well as with other ROS [ 60].

The thiol oxidation is also associated with physiological functions in human spermatozoa, a temporal inhibition of PRDXs by thiol oxidation allows the increase of ROS at levels that will not promote damage but will trigger the capacitation-associated phosphorylation events such as phosphorylation of PKA substrates and Tyr residues [ 120]. The inhibition of 2-Cys PRDXs with thiostrepton promoted the prevention of sperm capacitation and the establishment of oxidative stress. Thus, PRDX1–5 are important to assure the acquisition of fertilizing ability by the human spermatozoon [ 120].

PRDX6 is the only member of the family with phospholipase A2 activity which is important to remove lipid peroxides from the membranes [ 121, 122]. When 1-Hexadecyl-3-(trifluoroethyl)-sn-glycero-2-phospho-methanol lithium (MJ33) was present in the capacitation medium, spermatozoa not only were unable to undergo capacitation but also they displayed higher levels of lipid peroxidation compared to those capacitated without the inhibitor. These results indicate that PRDX6 is dominant in the protection of human spermatozoa against lipid peroxidation to assure normal function as the other 2-Cys PRDXs were not inhibited by MJ33 [ 120].

Human sperm capacitation is associated with rapid and reversible changes in protein -SH groups that appear to be redox regulated [ 123, 124]. This shift in the redox status of thiol groups is a very dynamic mechanism of switching on or off protein activity. The increases or decreases in -SH content were prevented by exogenous addition of SOD or CAT to the capacitating medium [ 124]. Some sperm proteins, with molecular mass and isoelectric point similar to those of PRDX1, PRDX4, and PRDX6 [ 125, 126], are oxidized by H2O2 during capacitation. This evidence supports the findings that thiol oxidation of PRDXs allows the redox signaling necessary to trigger phosphorylations events occurring during sperm capacitation [ 105, 107–109, 127].


INTESTINAL Lipid Metabolism and Chylomicron Assembly

Intestinal Lipid Absorption

Through absorption of dietary lipids, the intestine is a key regulator of stored and circulating lipids. Primarily it is enterocytes in the small intestine that actively regulate the release of dietary lipids into circulation (503-505). The predominant lipids derived from diet are triglycerides, phospholipids and cholesteryl esters. In the intestinal lumen, ingested lipids are emulsified by bile salts to enhance their hydrolysis by lipases (Figure 9) (506-509). Triglycerides make up the largest percentage of the intestinal lipids. Lipolysis of triglycerides releases free fatty acids (non-esterified fatty acids) and monoacylglycerides (Figure 9). These are absorbed on the luminal surface of the enterocytes both by free diffusion and actively by protein-mediated transport into the enterocyte cytosol (Figure 9) (508-510). The principal transporters identified to date are CD36 (now known as SR-B2 (511)) and several fatty acid binding and transport proteins (512-514).

Figura 9.

Intestinal Triglyceride and Cholesterol Metabolism. In the intestinal lumen, dietary triglyceride (TG) and cholesterol are emulsified by bile salts which enhance their uptake. Lipases in the intestinal lumen digest triglycerides to free fatty acids (FFA) and monoacylglycerides (MAG). These are absorbed into the enterocyte where they are used in the synthesis of TG, phospholipid and cholesteryl ester (CE). Much of the synthesized TG in enterocytes is packaged, along with phospholipids, cholesterol and proteins into chylomicrons, which are secreted at the basolateral surface of the enterocyte and enter the lymphatic system. The assembly of chylomicrons begins in the endoplasmic reticulum. During the synthesis of apolipoprotein B48 (apoB48), the protein acquires phospholipid from the endoplasmic reticulum membrane and also cholesterol and TG to form a primordial chylomicron. Continued acquisition of TG and CE and smaller, exchangeable proteins (e.g. apolipoprotein A-IV and apolipoprotein C-III) in the endoplasmic reticulum enlarges the particle to form a prechylomicron. Prechylomcirons are transported to the Golgi apparatus in specialized COPII vesicles. In the Golgi apparatus, the prechylomicron matures into a chylomicron. The maturation process includes the glycosylation of apoB48, the acquisition of additional proteins (e.g. apolipoprotein A-I) and lipid. Secretory vesicles formed from the Golgi carry the mature chylomicrons to the basolateral surface of the enterocyte. Fusion of the secretory vesicle membrane with the plasma membrane releases the chylomicron into the extracellular space where it is taken up into lacteals near the enterocyte and, thus, enters the lymphatic circulation. Dietary cholesterol in the intestinal lumen is taken into the enterocyte by a process involving Niemann-Pick C1-like protein 1 (NPC1L1). Enterocyte cholesterol and CE can be incorporated into chylomicrons and secreted with TG. In addition, enterocyte cholesterol can be directly excreted into the intestinal lumen using the heterodimer ATP-binding cassette transporter G5 and G8 (ABCG5/G8). Enterocyte cholesterol can also be transported to and incorporated into the basolateral membrane for efflux into the circulation.

Chylomicron Assembly and Secretion

In the enterocyte, the free fatty acids and monoacylglycerides are used to synthesize triglycerides, phospholipids, and cholesteryl esters (Figure 9) (508,509,513,515-517). The majority of the triglycerides formed in the enterocytes are repackaged into large, buoyant lipoproteins, called chylomicrons, and secreted from the basolateral surface of the cell (Figure 9). These particles play a central role in the transport of triglycerides and fat-soluble vitamins to the rest of the body (518).

The assembly of the chylomicron particle from precursors is a complex process. Each particle contains a single copy of apolipoprotein B48 and assembly begins with the synthesis of this protein in the rough endoplasmic reticulum. Apolipoprotein B48 is a truncated form of apolipoprotein B100 that is formed by posttranscriptional editing (519,520). As apolipoprotein B48 is synthesized and translocated across the endoplasmic reticulum membrane, it becomes lipidated to form a phospholipid-rich, dense primordial chylomicron in the lumen of the endoplasmic reticulum (Figure 9). The primordial chylomicron contains apolipoprotein B48, phospholipid, cholesterol and minor amounts of cholesteryl ester and triglyceride (513,521,522). The assembly process requires microsomal triglyceride transfer protein (523). In the absence of sufficient lipid, or if microsomal triglyceride transfer protein function is impaired, apolipoprotein B48 is ubiquitinated and targeted for proteasome degradation (524). The importance of this initiating assembly step is seen in patients with a defect in the MTP gene leading to the rare recessive disorder abetalipoproteinemia. Individuals with abetalipoproteinemia have almost undetectable levels of apoB or and very low total cholesterol levels in their plasma because of the inability to assemble apoB-containing lipoproteins in their enterocytes or hepatocytes. Among the sequelae experienced by these patients are accumulation of triglycerides in their intestines and livers and a deficiency of lipid-soluble vitamins in their plasma (525,526). If untreated, these patients develop severe neurological problems mostly related to vitamin E and A deficiency.

After formation, the initial primordial particle expands by the acquisition of additional triglyceride and cholesteryl ester (Figure 9). The additional lipid is acquired by fusion with non-apolipoprotein B48 containing particles that are rich in triglyceride and cholesteryl ester. The exact origin of these lipid particles and their precise composition is currently actively debated (504,505,513,527,528), but the fusion of the primordial chylomicron with the apolipoprotein B48-free particles occurs in the endoplasmic reticulum (513). The resulting particle is a prechylomicron (Figure 9). In addition to apolipoprotein B48, the prechylomicron surface can contain multiple copies of other small, exchangeable apoproteins including apolipoprotein A-IV and apolipoprotein C-III. Exchangeable apoproteins are soluble proteins that are not as tightly adherent to the particle surface and so can be exchanged between lipid particles.

Prechylomicrons are transported out of the endoplasmic reticulum and delivered to the Golgi apparatus for further processing (Figure 9). Transport occurs in specialized vesicles that can accommodate their large size. The unique vesicles contain a number of specific proteins necessary for the transport and docking process. Vesicle-associated membrane protein-7, coatomer protein II and Sar1b, a small GTPase component of the coatomer protein II vesicle assembly machinery (Figure 9) are among the specialized proteins on the lipid transport vesicles (505,529-531). The maturation of the particle in the Golgi apparatus includes further glycosylation of apolipoprotein B48 and the addition of apolipoprotein A-I to the surface (505,532,533). After processing, the mature chylomicron is packaged into Golgi-derived secretory vesicles and transported to the basolateral surface and exocytosed into the lymph (Figure 9) (527,534,535).

The assembly of chylomicrons in enterocytes is a complex process requiring a number of coordinated steps and specific factors to work in unison. A failure in any of these can lead to lipid-related disease states. For instance, mutations in the SAR1B gene lead to retention of prechylomicrons within membrane-bound structures in the enterocytes (529). The condition is marked in childhood by decreased blood cholesterol levels, lipid accumulation in the enterocytes, chronic fat malabsorption with steatorrhea, and deficiencies in fat-soluble vitamin and essential fatty acids.

Chylomicron Cholesterol

Although chylomicrons are triglyceride-rich, they also carry substantial amounts of cholesterol (536,537). The cholesterol in chylomicrons comes from the general pool of enterocyte cholesterol. Enterocytes acquire cholesterol by uptake at the luminal surface, acquisition from lipoproteins at the basal lateral surface, and by de novo synthesis within the enterocyte. Niemann-Pick C1-Like 1 protein is a key component of the luminal acquisition machinery (Figure 9) (538), while the low density lipoprotein receptor appears to be a major mediator of cholesterol acquisition at the basolateral surface (539,540). The incorporation of cholesterol into chylomicrons contributes to the circulating levels of cholesterol, and increases in intestinal synthesis of chylomicrons due to increased dietary lipids contributes to cardiovascular risk and atherosclerosis, albeit by complex mechanisms (516,541,542).

Non-Chylomicron Intestinal Lipid Metabolism

Enterocytes can also regulate circulating lipids by means other than chylomicron secretion. In the presence of excess fatty acids or cholesterol, the enterocyte can store excess lipid in their esterified forms (triglycerides and cholesteryl esters, respectively) within cytoplasmic lipid droplets (543-545). The neutral lipids in the droplets can subsequently be mobilized by hydrolysis as needed by the cell. The free fatty acids liberated from storage droplets can be incorporated into the chylomicron production pathway to become part of secreted chylomicrons.

Finally, the intestine also regulates circulating cholesterol levels by taking up excess circulating cholesterol and excreting it into the intestinal lumen for clearance in the feces. This process is known as trans-intestinal cholesterol excretion. It acts as an adjunct to liver biliary secretion and can account for as much as 30% of neutral sterol excretion (546). Trans-intestinal cholesterol excretion occurs at the luminal surface of the enterocytes by a process that primarily utilizes the ATP-binding cassette transporter pair ABCG5/G8 (Figure 9) but can use other pathways as well (547).

Resumen

It is clear that intestinal lipid processing is a key contributor to the circulating levels of both triglyceride and cholesterol. Dietary, genetic and metabolic factors that disrupt the process of enterocyte lipid metabolism potentially can alter lipid homeostasis and produce disease states.


Abstracto

Oxidative stress is known to play an important role in the pathogenesis of a number of diseases. In particular, it is linked to the etiology of Alzheimer’s disease (AD), an age-related neurodegenerative disease and the most common cause of dementia in the elderly. Histopathological hallmarks of AD are intracellular neurofibrillary tangles and extracellular formation of senile plaques composed of the amyloid-beta peptide (Aβ) in aggregated form along with metal-ions such as copper, iron or zinc. Redox active metal ions, as for example copper, can catalyze the production of Reactive Oxygen Species (ROS) when bound to the amyloid-β (Aβ). The ROS thus produced, in particular the hydroxyl radical which is the most reactive one, may contribute to oxidative damage on both the Aβ peptide itself and on surrounding molecule (proteins, lipids, …). This review highlights the existing link between oxidative stress and AD, and the consequences towards the Aβ peptide and surrounding molecules in terms of oxidative damage. In addition, the implication of metal ions in AD, their interaction with the Aβ peptide and redox properties leading to ROS production are discussed, along with both in vitro y en vivo oxidation of the Aβ peptide, at the molecular level.


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