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1.2B: Haciendo Lipsomas en el Laboratorio - Biología

1.2B: Haciendo Lipsomas en el Laboratorio - Biología


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Dado que los fosfolípidos formarán espontáneamente algún tipo de estructura bicapa cuando se colocan en agua, la mayoría de los esfuerzos en la producción de liposomas implican producir vesículas con el tamaño, estructura laminar y características físicas deseadas, que como se indicó anteriormente está controlado tanto por el tamaño del liposoma como por la composición química. Además, se deben desarrollar formas para atrapar la molécula deseada dentro de la vesícula de la manera más rentable y con una fuga mínima de contenido. Todos los métodos de producción implican cuatro pasos:

  1. secado de lípidos solubilizados con disolventes orgánicos;
  2. dispersión de los lípidos en la solución acuosa apropiada;
  3. separación de liposomas del exceso de reactivos de partida; y
  4. caracterización de las vesículas por composición química, Tm, permeabilidad, tamaño, etc.

Paso 1: secado de lípidos

Los lípidos purificados de la composición deseada (a menudo PC de huevo: colesterol: PS en proporciones molares de 0,9: 1,0: 0,1) se disuelven en una mezcla de disolvente orgánico purificado y libre de agua (a menudo cloroformo / metanol, 2: 1 v / v) y se secó en un matraz de fondo redondo en un evaporador rotatorio a presión reducida (usando un aspirador de agua) y temperatura ligeramente elevada (20-40 ° C). La rápida rotación del matraz asegurará que el lípido se disperse sobre una gran superficie y aumentará la velocidad de evaporación. Para eliminar las últimas trazas de disolvente, el matraz seco se suele colocar bajo un alto vacío durante la noche. Si se utiliza un pequeño volumen (<1 ml) de solución de lípidos, el disolvente se puede evaporar bajo una corriente de nitrógeno. Para evitar el atrapamiento de cloroformo residual en la película lipídica, la película se disuelve en t-butil-metiléter-dietiléter y se seca varias veces. Alternativamente, el disolvente residual se puede eliminar a alto vacío.

Paso 2: Dispersión de los lípidos en la solución acuosa adecuada.

Hay tres métodos principales para dispersar los lípidos en una solución acuosa para formar liposomas.

  1. Dispersión mecánica - en este método, el lípido secado sobre la superficie de vidrio interior de un recipiente se hidrata con una solución acuosa, que literalmente despega el lípido para formar vesículas multilaminares - MLV - (múltiples bicapas separadas por agua). Solo una pequeña parte de la solución acuosa está encapsulada dentro del liposoma, por lo que este no es el método de elección para la encapsulación de solutos costosos o más bien insolubles. Dependiendo del grado de agitación y la naturaleza del lípido utilizado, se pueden preparar liposomas de diferentes tamaños. Estos liposomas multilaminares pueden procesarse adicionalmente para formar liposomas unilaminares mediante varias técnicas. Estos incluyen sonicación con sonda o baño de MLV, extrusión a alta presión de MLV a través de filtros de membrana de tamaño de poro definido o vesiculación inducida por pH en la que un cambio transitorio de pH desestabiliza la MLV a favor de liposomas unilaminares. Otra técnica implica la fusión de SUV por congelación y descongelación repetidas o por fusión de SUV que contiene fosfolípidos ácidos (como PS) a través de la agregación mediada por Ca2 +.
  2. Dispersión de solventes orgánicos - En estos métodos, los lípidos, que se disuelven en disolventes orgánicos, se inyectan a través de una aguja fina, a velocidad lenta, en una solución acuosa en la que se puede depositar el disolvente orgánico. miscible (como el etanol) o inmiscible (como éter). En cada caso, los lípidos se orientan en la interfaz entre el disolvente orgánico y la solución acuosa, para formar estructuras bicapa. La inyección de lípidos disueltos en etanol proporciona una forma sencilla de producir SUV, pero debido a que la formación de liposomas no puede ocurrir a una concentración de etanol superior al 7,5%, solo una fracción de la fase acuosa total puede quedar atrapada en la vesícula; por tanto, esta técnica no es rentable para atrapar un soluto caro. Alternativamente, el lípido se puede disolver en éter e inyectar lentamente en una solución acuosa que se calienta para que el éter se evapore a la velocidad a la que se inyecta. Dado que el éter se volatiliza, se pueden introducir grandes cantidades de lípido y la eficacia de encapsulación de la solución acuosa es alta.
  3. Dispersión y solubilización de detergente - En este método, los lípidos se solubilizan en una solución acuosa mediante la adición de detergentes. Los detergentes se eliminan lentamente de la solución, dando como resultado la formación espontánea de liposomas. Los detergentes son anfífilos de cadena sencilla que forman espontáneamente micelas en solución acuosa cuando la concentración de lípidos libres se eleva a un valor crítico mínimo, la concentración micelar crítica (CMC); a esta concentración, la autoasociación del detergente da como resultado la formación de un agregado estable, la micela. Esto se ilustra en la figura siguiente, junto con la CMC de varios detergentes diferentes.

CONCENTRACIÓN CRÍTICA DE MICELLE

nombre

mM

mg / ml

MW

glucopiranósido n-hepático7019.5278
n-octil glucopiranósido23.26.8292
glucopiranósido de n-nonilo6.52.0306
n-decil maltósido2.191.1499
n-dodecil maltotriosido0.20.16825
Triton X-100 (a)0.240.15625
Nonidet P-40 (b)0.290.02603
Tween 20 (c)0.0330.041364
Brij 98 (d)0.0250.041527
desoxicolato de sodio2-61.7415
taurocolato de sodio10-156.7538
colato de sodio146.0431
dodecil sulfato de sodio8.32.4289

Datos de lípidos de Avanti Polar Lipids

En este procedimiento, el lípido se deposita en un recipiente pequeño. Luego se agrega una solución acuosa, que contiene moléculas solubles en agua para encapsular. A continuación, se añade detergente a una concentración superior a la concentración de lípidos y superior a su CMC. A continuación, las moléculas de lípidos se "emulsionan" en la micela de detergente. La mezcla solubilizada se coloca luego en una bolsa de diálisis semipermeable, que se coloca en un gran volumen de una solución acuosa. El detergente libre en solución está en equilibrio con el detergente en la micela. La bolsa contiene orificios microscópicos lo suficientemente grandes para que pase la molécula de detergente monomérico, pero lo suficientemente pequeños como para que la micela grande no pueda hacerlo. El lípido, durante este proceso, se incrusta en la micela formando una micela mixta detergente-lípido. A medida que continúa la diálisis, el detergente monomérico se reparte tanto por el volumen de la bolsa como por el volumen que la rodea, mientras que la micela mezclada permanece en la bolsa. Si la solución acuosa que rodea la bolsa se cambia varias veces con solución nueva, el equilibrio en la bolsa se desplaza a la forma monomérica. Alternativamente, se pueden colocar perlas absorbentes de detergente (como Bio Bead SM-2 de Bio-Rad) en la solución acuosa que rodea la bolsa para acelerar el proceso de reequilibrio del detergente. Finalmente, todo el detergente está en esta forma, y ​​durante el proceso, que ocurre lentamente, el lípido en la micela mixta se autoasocia para formar un liposoma. Un detergente de bajo peso molecular de monómeros y una CMC alta es lo más deseable para este método de producción de liposomas. Otro método para eliminar el detergente libre es mediante cromatografía de filtración en gel. En esta técnica, las moléculas de pesos moleculares dispares se pueden separar unas de otras. Una explicación sigue a esta discusión. Este método de formación de liposomas unilaminares es el método de elección si se van a insertar proteínas de membrana en la bicapa del liposoma con el fin de dirigirse al liposoma. Sin embargo, no es el mejor método para la encapsulación cuantitativa de costosas moléculas solubles.

Resumen: preparación de LUV's

  • Preparación de liposomas de Avanti

Paso 3: Separación del liposoma del exceso de reactivos iniciales

Una vez que se forman los liposomas, deben separarse del lípido monomérico libre, el detergente y los solutos no encapsulados. Esto se puede hacer de nuevo mediante diálisis, o más fácilmente mediante cromatografía de filtración en gel. Se pueden separar macromoléculas de diferentes tamaños en una columna en la que la fase estacionaria es una bola de agarosa o acrilamida polimerizada, que contiene poros de varios tamaños. Una molécula pequeña (como detergente monómero, lípido libre o soluto acuoso pequeño) en la fase móvil (solución tamponada acuosa) puede entrar en los poros de la perla, mientras que una macromolécula o agregado más grande (como una proteína grande, una micela, o un liposoma) puede que no, debido a la restricción de tamaño. El resultado es que una fracción mayor del volumen total de la columna está disponible para las moléculas más pequeñas, que por tanto pasan más tiempo en la columna y son eluidas por el solvente móvil después de las especies más grandes. Estudiaremos la teoría de la cromatografía en gel en un futuro experimento.

  • animación de la cromatografía de filtración en gel de Voet2

Paso 4: Caracterización de las vesículas

Los liposomas se pueden caracterizar tanto químicamente, para determinar la composición media de lípidos y proteínas de la bicapa, como físicamente, para determinar el tamaño, la permeabilidad, la lamelaridad y la cantidad de material encapsulado. El tamaño generalmente se determina mediante microscopía electrónica o indirectamente mediante la dispersión de la luz de estas especies grandes. En este laboratorio, en lugar de caracterizar la composición lipídica del liposoma, que sabe que está compuesto solo por PC, realizará una cromatografía en capa fina en una serie de fosfolípidos. También determinará si ha encapsulado un soluto en el liposoma.


Una forma sencilla de producir células madre en media hora aclamada como un gran descubrimiento

Científicos de Japón han desarrollado una forma radical y extraordinariamente fácil de producir células que puedan crecer en cualquier tejido del cuerpo.

La hazaña ha sido aclamada como un descubrimiento importante por investigadores familiarizados con el trabajo, y si se puede repetir en tejido humano, podría conducir a procedimientos baratos y simples para producir células madre compatibles con el paciente que podrían reparar órganos dañados o enfermos.

En una serie de elegantes experimentos, los investigadores demostraron que las células extraídas de animales podían convertirse en células maestras todopoderosas simplemente sumergiéndolas en una solución ligeramente ácida durante media hora.

Para demostrar el potencial de las células, los científicos las inyectaron en embriones de ratón y demostraron que crecían en tejidos y órganos en todo el cuerpo de los animales.

Haruko Obokata, del laboratorio de Riken en Kobe, Japón, le dijo a The Guardian que su equipo había creado varias docenas de ratones a los que les habían crecido tejidos a partir de las células y que habían seguido su salud durante uno o dos años. "Hasta ahora parecen estar sanos, fértiles y normales", dijo.

El hallazgo ha sorprendido a muchos investigadores porque los intentos anteriores de producir células madre han estado plagados de dificultades. Una vía es la clonación, que es controvertida porque implica la creación y destrucción de embriones. Un método más reciente, llamado pluripotencia inducida, utiliza la manipulación genética para convertir las células adultas en un estado inmaduro más flexible.

El trabajo, publicado en dos artículos de la revista Nature, fue "un descubrimiento científico importante que abrirá una nueva era en la biología de células madre", dijo Dusko Ilic, científico de células madre del King's College de Londres.

Chris Mason, un experto en células madre del University College London, compartió su entusiasmo. "Si funciona en el hombre, esto podría ser el punto de inflexión que, en última instancia, haga disponible una amplia gama de terapias celulares utilizando las propias células del paciente como material de partida", dijo.

Obokata comenzó a trabajar en el procedimiento hace cinco años mientras trabajaba en la Escuela de Medicina de Harvard. La idea se le ocurrió después de notar por casualidad que las células que habían sido exprimidas a través de un tubo delgado se redujeron al tamaño de células madre. Continuó examinando más de cerca los efectos que los diferentes tipos de estrés, desde el calor, la inanición y las condiciones ácidas, tenían en las células.

Después de años de perfeccionar los experimentos, Obokata demostró que podía convertir los glóbulos blancos tomados de ratones recién nacidos en células que se comportaban de manera muy parecida a las células madre. Continuó haciendo lo mismo con las células del cerebro, la piel, los músculos, la médula ósea, los pulmones y el hígado. "Fue muy sorprendente ver que una transformación tan notable podría desencadenarse simplemente por estímulos externos", dijo.

Obokata tuvo problemas para convencer a otros científicos y su artículo sobre el trabajo fue rechazado varias veces. Finalmente completó suficientes controles cruzados para convencer a los investigadores de que los hallazgos eran reales.

Obokata llama al procedimiento "adquisición de pluripotencia activada por estímulos", y las células resultantes son células Stap. La inmersión en una solución ácida suave, con un pH de 5,5, funcionó mejor. Exprimir las células tuvo un efecto similar pero fue menos eficiente.

"La generación de estas células es esencialmente la forma en que la madre naturaleza responde a las lesiones", dijo a Nature el autor principal de los estudios, Charles Vacanti de la Facultad de Medicina de Havard.

Austin Smith, director del instituto de células madre Wellcome Trust / MRC de la Universidad de Cambridge, dijo que el trabajo parecía sólido, pero que no estaba claro si funcionaría en humanos y con tejido adulto, como las células de la piel extraídas de un paciente.

Si los científicos pueden hacer que el procedimiento funcione en las personas, podrían superar rápidamente los obstáculos regulatorios que han frenado el desarrollo de terapias basadas en células madre pluripotentes inducidas (iPS). Las terapias basadas en células iPS enfrentan un escrutinio porque se agregan genes a las células para convertirlas en células madre. Es probable que estos genes deban eliminarse antes de que se puedan utilizar de forma segura en los pacientes.

Obokata dijo que se está trabajando para repetir sus experimentos con tejido humano, pero que aún no han obtenido resultados. Una de las muchas preguntas que quedan por resolver es por qué las células del cuerpo no se están convirtiendo constantemente en células madre cuando entran en contacto con ácido, con ardor de estómago o cuando las personas beben jugo de frutas. La sospecha es que la capacidad de revertir a células madre se bloquea cuando hay células en el cuerpo.

Incluso si el procedimiento se puede perfeccionar en humanos, Smith dijo que quedan obstáculos importantes antes de que los pacientes puedan ser tratados con células Stap. Cualquier tejido que crezca a partir de células Stap deberá probarse que es seguro en el cuerpo. Los científicos tendrían que demostrar que no pueden convertirse en tumores y demostrar que trabajan con los tejidos sanos de los pacientes sin causar problemas.

Obokata dijo que el nuevo procedimiento podría tener usos más allá de la regeneración de partes dañadas del cuerpo y arrojar luz sobre la forma en que las células acumulan desgaste a lo largo de nuestras vidas. "Al estudiar el mecanismo, podríamos aprender más sobre cómo la edad de las células también está bloqueada", dijo a The Guardian.


Revisar

Introducción

Los liposomas son pequeñas vesículas artificiales de forma esférica que se pueden crear a partir de colesterol y fosfolípidos naturales no tóxicos. Debido a su tamaño y carácter hidrofóbico e hidrofílico (además de la biocompatibilidad), los liposomas son sistemas prometedores para la administración de fármacos. Las propiedades de los liposomas difieren considerablemente con la composición de los lípidos, la carga superficial, el tamaño y el método de preparación (Tabla 1). Además, la elección de los componentes bicapa determina la "rigidez" o "fluidez" y la carga de la bicapa. Por ejemplo, las especies de fosfatidilcolina insaturadas de fuentes naturales (fosfatidilcolina de huevo o soja) dan bicapas mucho más permeables y menos estables, mientras que los fosfolípidos saturados con cadenas de acilo largas (por ejemplo, dipalmitoilfosfatidilcolina) forman una estructura rígida de dos capas bastante impermeable [1– 3].

Se ha demostrado que los fosfolípidos forman impulsivamente estructuras cerradas cuando se hidratan en soluciones acuosas. Dichas vesículas que tienen una o más membranas de bicapa de fosfolípidos pueden transportar fármacos acuosos o lipídicos, dependiendo de la naturaleza de esos fármacos. Debido a que los lípidos son anfipáticos (tanto hidrófobos como hidrófilos) en medios acuosos, sus propiedades de fase termodinámica y características de autoensamblaje influyen en la confiscación enfocada entrópicamente de sus secciones hidrófobas en bicapas esféricas. Estas capas se denominan laminillas [4]. Generalmente, los liposomas se definen como vesículas esféricas con tamaños de partículas que varían de 30 nm a varios micrómetros. Consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean las unidades acuosas, donde los grupos de cabezas polares se orientan en la ruta de las fases acuosas interior y exterior. Por otro lado, la autoagregación de los lípidos polares no se limita a las estructuras bicapa convencionales que dependen de la forma molecular, la temperatura y las condiciones ambientales y de preparación, sino que pueden autoensamblarse en varios tipos de partículas coloidales [5].

Los liposomas se utilizan ampliamente como vehículos para numerosas moléculas en las industrias cosmética y farmacéutica. Además, las industrias alimentaria y agrícola han estudiado ampliamente el uso de la encapsulación de liposomas para desarrollar sistemas de administración que pueden atrapar compuestos inestables (por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, sabores y elementos bioactivos) y proteger su funcionalidad. Los liposomas pueden atrapar compuestos hidrófobos e hidrófilos, evitar la descomposición de las combinaciones atrapadas y liberar las atrapadas en los objetivos designados [6-8].

Debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad, baja toxicidad y capacidad para atrapar fármacos tanto hidrófilos como lipófilos [9] y simplificar la administración de fármacos en sitios específicos a los tejidos tumorales [10], los liposomas han aumentado la tasa tanto como sistema de investigación como comercialmente como fármaco. -sistema de entrega. Se han realizado muchos estudios sobre liposomas con el objetivo de disminuir la toxicidad del fármaco y / o dirigirse a células específicas [11-13].

La tecnología de encapsulación liposomal (LET) es la técnica de administración más nueva utilizada por los investigadores médicos para transmitir fármacos que actúan como promotores curativos a los órganos del cuerpo asegurados. Esta forma de propuesta de sistema de entrega tenía como objetivo la entrega de combinaciones vitales al cuerpo. LET es un método para generar espumas submicroscópicas llamadas liposomas, que encapsulan numerosos materiales. Estos "liposomas" forman una barrera alrededor de su contenido, que es resistente a las enzimas en la boca y el estómago, soluciones alcalinas, jugos digestivos, sales biliares y flora intestinal que se generan en el cuerpo humano, así como a los radicales libres. El contenido de los liposomas está, por tanto, protegido de la oxidación y degradación. Este escudo o barrera protectora de fosfolípidos permanece intacto hasta que el contenido del liposoma se entrega a la glándula, órgano o sistema exacto donde se utilizará el contenido [14].

La medicación clínica mantiene en uso una gama enormemente amplia de moléculas de medicamentos en este momento, y cada año se agregan nuevos medicamentos a la lista. Uno de los principales objetivos de cualquier cura que emplee un fármaco es aumentar el índice terapéutico del fármaco y minimizar sus efectos secundarios. La utilidad clínica de la mayoría de los quimioterapéuticos conservadores está restringida por la incapacidad de administrar concentraciones de fármaco terapéutico al tejido blando diana o por los efectos secundarios tóxicos espartanos y nocivos sobre los órganos y tejidos normales. Se han realizado diferentes enfoques para superar estas dificultades proporcionando la entrega "selectiva" al área de destino; la solución ideal sería dirigir el fármaco solo a las células, tejidos y órganos que se ven afectados por la enfermedad.Los vehículos seleccionados, por ejemplo, partículas coloidales y conjugados moleculares, pueden ser apropiados para esta determinación. Las partículas coloidales resultan de la incorporación física del fármaco en un sistema coloidal de partículas, por ejemplo, micelas inversas, noisome, micro y nanoesferas, eritrocitos, polímeros y liposomas. Entre estos portadores, los liposomas han sido los más estudiados. Su atractivo radica en su composición, que los hace biodegradables y biocompatibles. El liposoma implica un núcleo acuoso atrapado por una o más bicapas compuestas de lípidos naturales o sintéticos. Están compuestos de fosfolípidos naturales que son biológicamente inertes y débilmente inmunogénicos, y tienen una baja toxicidad inherente. Además, los fármacos con diferentes lipofilicidades pueden encapsularse en liposomas: los fármacos fuertemente lipofílicos quedan atrapados casi en su totalidad en la bicapa lipídica, los fármacos intensamente hidrofílicos se localizan completamente en el compartimento acuoso y los fármacos con logP intermedio se dividen sin esfuerzo entre las fases lipídica y acuosa, ambas en la bicapa y en el núcleo acuoso [15].

La presente revisión explicará brevemente las características de los liposomas y explorará los problemas relacionados y las soluciones propuestas, con un enfoque en la preparación de liposomas, caracterizaciones, factores que afectan, ventajas y desventajas. En particular, volvemos a la literatura relacionada con los liposomas de alta estabilidad y circulación prolongada (liposomas furtivos) y su campo de aplicación.

Clasificación de liposomas

El tamaño de los liposomas puede variar desde vesículas muy pequeñas (0,025 µm) a grandes (2,5 µm). Además, los liposomas pueden tener membranas de una o dos capas. El tamaño de la vesícula es un parámetro agudo en la determinación de la vida media en circulación de los liposomas, y tanto el tamaño como el número de bicapas afectan la cantidad de encapsulación del fármaco en los liposomas. Sobre la base de su tamaño y número de bicapas, los liposomas también se pueden clasificar en una de dos categorías: (1) vesículas multilaminares (MLV) y (2) vesículas unilaminares. Las vesículas unilaminares también se pueden clasificar en dos categorías: (1) vesículas unilaminares grandes (LUV) y (2) vesículas unilaminares pequeñas (SUV) [16]. En los liposomas unilaminares, la vesícula tiene una única esfera de bicapa de fosfolípidos que encierra la solución acuosa. En los liposomas multilaminares, las vesículas tienen una estructura de cebolla. Clásicamente, se formarán varias vesículas unilaminares en el interior de la otra de menor tamaño, formando una estructura multilaminar de esferas concéntricas de fosfolípidos separadas por capas de agua [17].


Información de soporte

Observación de burbujas de gas libre de SF6 sin lípidos secos en el fondo de los viales en las imágenes TEM a la luz del día de los liposomas obtenidas usando agua de nanoburbujas libres (Liposomas GU), agua desgasificada (liposomas convencionales) y usando agua destilada (otros liposomas convencionales), operado en paralelo a diferentes horas de reposo y sometido a la concentración de fosfolípidos de agitación final y al recuento de lípidos en la solución en diferentes tiempos de reacción y proceso de derivación de la ecuación 1. (PDF)


Tabla de contenido (36 capítulos)

Utilización de liposomas para estudiar la transferencia y absorción de fármacos

El uso de liposomas en el estudio del metabolismo de fármacos: un método para incorporar las enzimas del sistema de monooxigenasa del citocromo P450 en vesículas bicapa de fosfolípidos

Uso de liposomas para estudiar osmosensores celulares

Estudio de canales de iones mecanosensibles con liposomas

Estudio del transporte de aminoácidos mediante liposomas

Uso de liposomas para estudiar interacciones de proteínas solubles con membranas celulares

Reconstitución liposomal de proteínas de membrana integrales monotópicas

La reconstitución de la polimerización de actina en liposomas

Electroformación de vesículas unilaminares gigantes a partir de membranas nativas y mezclas de lípidos orgánicos para el estudio de dominios lipídicos en condiciones fisiológicas de fuerza iónica

Visualización de la clasificación de proteínas específicas del dominio lipídico en vesículas unilaminares gigantes

Biosíntesis de proteínas dentro de los liposomas

Estudio de citocromos respiratorios en liposomas

Uso de liposomas para evaluar el papel de las interacciones de las membranas en la actividad antioxidante

Estudio de la agregación coloidal mediante liposomas

Evaluación de las interacciones entre liposomas y células

Métodos para monitorear la fusión, la permeabilidad y la interacción de los liposomas con las células

El uso de calorimetría de titulación isotérmica para estudiar proteínas transportadoras de múltiples fármacos en liposomas

Estudio de la organización de los lípidos en membranas biológicas utilizando liposomas y etiquetado por giro EPR

Subczynski, Witold K. (y col.)

Translocación de membrana ensayada por espectroscopia de fluorescencia

Interacción de lípidos y ligandos con vesículas receptoras de acetilcolina nicotínicas evaluadas por espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica

Imágenes de microscopio electrónico de barrido ambiental de sistemas de vesículas

Microscopía electrónica de congelación-fractura en dominios en mono y bicapa de lípidos en escala de nano resolución

Microscopía de fuerza atómica para la caracterización de proteoliposomas

Sitterberg, Johannes (et al.)

Método de análisis simultáneo de componentes de liposomas mediante HPTLC / FID

Hatziantoniou, Sophia (et al.)

Análisis viscosimétrico de complejos ADN-lípidos

Análisis fluorométrico de complejos catiónicos de ADN-lípidos individuales

Análisis de Lipoplexes basado en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Análisis de la estructura de Lipoplex y cambios en la fase lipídica

Métodos de fluorescencia para evaluar la entrega de genes mediada por lipoplex

Imágenes FRET de células transfectadas con complejos de ARNip / liposomas

Bioimagen espectral e imagen confocal de la distribución intracelular de los lipoplexos

Schneider, Sebastian (y col.)

Técnicas para cargar radionúclidos de tecnecio-99m y renio-186/188 en liposomas preformados para diagnóstico por imagen y terapia con radionúclidos

Espectroscopia de correlación de fluorescencia para el estudio de la dinámica y organización de las membranas en vesículas unilaminares gigantes


Dr. Michael R. King

Michael R. King es profesor de J. Lawrence Wilson y director del departamento de ingeniería biomédica en la Universidad de Vanderbilt. Anteriormente fue profesor de Daljit S. y Elaine Sarkaria en la Universidad de Cornell. Completó un doctorado en ingeniería química en la Universidad de Notre Dame y una formación postdoctoral en bioingeniería en la Universidad de Pennsylvania. Ha escrito libros de texto sobre los temas de métodos estadísticos y flujos de microcanales, y ha recibido varios premios, incluido el Premio NSF CAREER, los Premios a la Investigación Destacada de la Sociedad Estadounidense de Ingenieros Mecánicos y la Sociedad Estadounidense de Química Clínica, y fue miembro de James D. Watson Investigador del Estado de Nueva York. King es miembro del Instituto Americano de Ingeniería Médica y Biológica, la Sociedad de Ingeniería Biomédica y la Academia Internacional de Ingeniería Médica y Biológica, y se desempeña como Vicepresidente de la Sociedad Internacional de Ingeniería Biónica. Es el Editor en Jefe de Bioingeniería Celular y Molecular, una revista oficial de la Sociedad de Ingeniería Biomédica, y se desempeña como Presidente Electo del Consejo de Presidentes de Ingeniería Biomédica.

King Lab trabaja en la interfaz entre la ingeniería celular, la administración de fármacos y la nanotecnología. Emplean herramientas y conceptos de ingeniería para comprender los procesos biomédicos importantes que ocurren en el torrente sanguíneo, incluida la metástasis, la inflamación y la trombosis del cáncer. Han descubierto que las células tumorales en la circulación pueden imitar los mecanismos físicos utilizados por los glóbulos blancos para transitar por el cuerpo y adherirse a la pared de los vasos sanguíneos, y han explorado estrategias para interrumpir este proceso de metástasis dirigiéndose a receptores de adhesión específicos. Los receptores de adhesión de selectina importantes en el tráfico de leucocitos, células madre y CTC tienen una biofísica única que los hace ideales para la administración de fármacos dirigida. El King Lab ha sido pionero en el uso de proteínas de selectina para enviar señales de muerte por apoptosis a las células tumorales en la sangre que fluye y para administrar cargas terapéuticas (p. Ej., ARNip, quimioterápicos) encapsuladas en liposomas a nanoescala. El laboratorio King está probando actualmente estas nuevas terapias contra el cáncer en modelos de ratón de cáncer de mama y próstata metastásico mediante el uso de imágenes de luminiscencia de todo el cuerpo y en muestras de sangre recolectadas de voluntarios humanos diagnosticados con cáncer en varias etapas.

Michael King ha estado casado con Cynthia Reinhart-King, profesora de ingeniería Cornelius Vanderbilt, desde 2002, y juntos tienen dos hijos: Simon (13 años) y Julian (6 años), y un cockapoo de 15 años llamado Lady Mix-a. -Lot King. Viven en Brentwood, en una casa que fue propiedad de CJ2K.

Fuera del trabajo y los intereses familiares, Mike es el fundador de VIBE: la Iniciativa Vanderbilt de Ingenieros Biofunky, un grupo musical de profesores de ingeniería biomédica y estudiantes graduados que han actuado desde 2017 dentro y fuera del campus de Vanderbilt, y en vivo por radio. Nashville libre. Otros intereses incluyen: ser un padre fanático del lacrosse, mantenerse en forma y pasear por la ciudad en un Jeep Wrangler sin puertas.


MIEMBROS DEL LABORATORIO

Dr. Lingyin Li es profesor asistente en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de Stanford. También es miembro del instituto Stanford ChEM-H. Nació en 1981 en Xi'an, la antigua capital de China para muchas de las dinastías más importantes de la historia china y también donde se descubrieron los guerreros de terracota. Cuando era adolescente, estaba fascinada por la historia y la literatura chinas hasta que un día su maestra de matemáticas de sexto grado comentó: la literatura es para niñas y las matemáticas son para niños. A una edad rebelde, cambió su enfoque a las matemáticas, la física y la química, y finalmente asistió a la Universidad de Ciencia y Tecnología de China. Allí se especializó en Física de Polímeros en el Instituto de Química e Ingeniería Química y obtuvo una licenciatura en ingeniería en 2003.

Su mentora graduada, la Dra. Laura Kiessling, de la Universidad de Wisconsin-Madison, la introdujo en el campo de la biología química. Allí, usó señales químicas sintéticas para dirigir la decisión del destino de las células embrionarias humanas, con la esperanza de usar células madre para tratar enfermedades degenerativas. A través de este proyecto, se armó de experiencias en química sintética, técnicas bioquímicas y principios de biología celular. También se apasionó por tener un impacto en la salud humana a través de la ciencia y la ingeniería. Los obstáculos que enfrentó le hicieron darse cuenta de la importancia de los mecanismos bioquímicos para comprender la fisiología y las terapias humanas.

Después de obtener su doctorado en Química en 2010, se trasladó a la Escuela de Medicina de Harvard para buscar más formación bioquímica con el Dr. Tim Mitchison. En Harvard, colaboró ​​con los Institutos Novartis de Investigación Biomédica para realizar farmacología inversa de moduladores inmunitarios conocidos para dilucidar el mecanismo e identificar posibles dianas terapéuticas. Su investigación puso a la STING humana, una proteína adaptadora central en el sistema inmunológico innato, en el mapa del descubrimiento de fármacos contra el cáncer y también la llevó al campo de la inmunología innata en un momento emocionante.

Lingyin se unió a la facultad de la Facultad de Medicina de Stanford en septiembre de 2015. Su laboratorio buscará direcciones de investigación basadas en la química con un alto potencial de impactar en la investigación biológica / inmunológica básica y el desarrollo de fármacos.

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Géminis SkariahGerente de laboratorio

Crecí en Kerala, un estado del sur de la India, conocido por su belleza natural.

Obtuve mi licenciatura en la Universidad de Kerala y continué estudios superiores en el Instituto de Tecnología Química en Mumbai, India. Me encanta pasar tiempo con mi familia.

Trabajo en Stanford desde 2004. Comencé a trabajar en el laboratorio de Mourrain, donde era gerente de laboratorio y estudié la caracterización de neuronas como la hormona concentradora de melanina, la hipocretina y su interacción con otros circuitos neuronales. Más tarde, me uní al laboratorio de Theriot, donde participé en el desarrollo de herramientas para estudiar la motilidad celular en células HL60 y queratocitos de pez cebra.

Ahora en el laboratorio de Li, estoy muy emocionado de estudiar biología del cáncer, con énfasis en las señales inmunes innatas para combatir el cáncer. Con los inhibidores de puntos de control, espero nuevas estrategias para curar el cáncer.

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Daniel FernandezCientífico del personal

Nacido y criado en un área suburbana cerca de Buenos Aires, la capital de Argentina, mi primer recuerdo de la realización de un experimento científico fue tratar de "casar" el agua y el combustible. Sin que mi padre lo supiera (¡el aceite es muy caro en mi país de origen!), Vertí un volumen de gasolina en una botella medio llena con agua del grifo. Taponé la botella, la guardé en caché y esperé. He razonado que los líquidos obstinadamente inmiscibles se juntarán si les doy tiempo. ¡Cómo se había demostrado que estaba equivocado! Pasaron cinco años, se vendió la casa de mis padres y se desenterró una botella de vidrio misteriosa, con rayas claras y rojizas.

Luego me inscribí en la universidad, estudiando Biotecnología. ¡Esa era mi intención! Durante mi segundo año, me atrajo tanto una charla de un cristalógrafo, que le pedí a mi profesor de Física que trabajara en difracción de rayos X de cristal único. Entonces, he estudiado el polimorfismo cristalino en medicamentos comercializados, cristalizado diferentes complejos metálicos de un inhibidor de la resorción ósea y modelé esos inhibidores como quelantes de metales para una proteína tareta de la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana). Después de obtener mi título de Licenciado, pasé a la cristalografía de proteínas.

Eso significó un cruce oceánico hacia el este hasta la ciudad de Barcelona. Mi trabajo se centró en investigar estructuralmente compuestos orgánicos que actúan como inhibidores irreversibles de una familia de proteasas que contienen zinc o metaloproteasas. El objetivo era casar un compuesto orgánico y una macromolécula. Primero en solución, luego en un cristal. Lo primero fue relativamente fácil, lo segundo no tanto. Pero, en mi cuarto año de doctorado, pude obtener una determinación estructural completa que mostraba cómo un compuesto inactivo en otro lugar se volvió activo en el bolsillo del sitio activo de la enzima, matándolo.

Me quedé en Europa durante cinco años más como posdoctorado realizando estudios cristalográficos, y después de un cruce oceánico hacia el oeste, me encuentras en el Centro de Conocimiento de la Estructura Macromolecular (MSKC), ayudando a mis compañeros de trabajo en los muchos rincones en los que se construye el arte, especialmente en aquello de lo que dependen los cristales: el tiempo.

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Volker BöhnertPost-Doc

Nací y crecí cerca de Bonn, la antigua capital de Alemania. Desde que tengo uso de razón, me interesó la biología. Durante la escuela, también me interesé por la química, y durante mi servicio civil como técnico de emergencias médicas, estaba fascinado por la fisiología y la medicina. Afortunadamente, descubrí que podía combinar estos intereses estudiando biomedicina molecular en la Universidad de Bonn. Allí, me fascinó la versatilidad del sistema inmunológico y decidí convertirme en inmunólogo. Durante mi tesis de diploma bajo la supervisión del Dr. Sven Burgdorf en el grupo del Dr. Christian Kurts, tuve la oportunidad de estudiar los mecanismos de presentación cruzada en células presentadoras de antígenos profesionales.

Para mi tesis doctoral, me uní al laboratorio del Dr. Winfried Barchet en el Instituto de Química Clínica y Farmacología Clínica en Bonn, dirigido por el Dr. Gunther Hartmann. Estudié el mecanismo y la función biológica de varios estímulos inmunológicos innatos generados enzimáticamente y sintéticos a base de ácidos nucleicos. Además, establecí una vacuna contra el cáncer en un modelo de cáncer de ovario y desentrañé su modo de acción.

Ahora, estoy emocionado de enfocarme en la inmunidad antitumoral y el uso de señales inmunes innatas para combatir el cáncer. El ejemplo de fármacos inmunomoduladores como los inhibidores de puntos de control que cambian el tratamiento del cáncer en las clínicas ya hoy es una gran motivación para mí para encontrar nuevos enfoques para ampliar nuestro conjunto de herramientas en la lucha contra el cáncer en las clínicas.

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Sabrina ErgunEstudiante de Posgrado - Bioquímica

Crecí en Boulder, Colorado, donde aprendí a apreciar el aire libre y desarrollé un interés en el mundo físico. Obtuve mi licenciatura en Bioquímica en la Universidad de Brown, donde investigué los patrones moleculares de la resistencia emergente a los antibióticos, particularmente en los ribosomas bacterianos. Después de terminar mi carrera, me tomé un año libre para viajar antes de comenzar mi doctorado en Stanford. Me interesa principalmente el estudio de los mecanismos moleculares de la señalización celular, particularmente en el contexto del sistema inmunológico y la enfermedad.

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Jackie CarozzaEstudiante de posgrado - Química

Crecí en el sureste de Michigan, cerca de Detroit, e hice mi licenciatura en química en la Universidad de Cornell. Como estudiante, investigué sobre polímeros orgánicos y completé pasantías estudiando metabolómica y biología de células cancerosas. A medida que aumentaba mi interés por los sistemas biológicos y las preguntas, crucé el charco hasta la Universidad de Cambridge, donde escribí mi tesis de maestría sobre la cuantificación de las interacciones proteína-proteína medidas mediante técnicas de microfluidos. Me interesa estudiar los mecanismos moleculares de las enfermedades y, en particular, el papel que desempeñan los mensajeros de moléculas pequeñas.

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Lauren LaheyEstudiante de posgrado - Biofísica

Como estudiante, me sorprendió descubrir una pasión por la ciencia en lo que pensé que sería solo un curso obligatorio a lo largo de la carrera pre-médica. Encontré el desafío, la lógica y la belleza simultáneos en la química orgánica; fue entonces cuando supe que estaba enganchado. Comencé a trabajar en el laboratorio del Dr. David Son en la síntesis de núcleos de dendrímero de organosulfuro multifuncionales y obtuve un B.S. en Química en la Universidad Metodista del Sur.

También vi a un ser querido luchar contra los efectos devastadores de una enfermedad autoinmune rara e intratable durante este tiempo. Esto motivó mi interés por la inmunología. Después de graduarme de la universidad, comencé a trabajar como asistente de investigación en el laboratorio de William H. Robinson en Stanford. Allí dirigí la identificación de biomarcadores mecánicos para enfermedades autoinmunes mediante la detección de autoanticuerpos y citocinas de alto rendimiento. Además, desarrollé un diagnóstico de múltiples antígenos para Borrelia burgdorferi Infección en la enfermedad de Lyme temprana.

Ahora me pongo a trabajar en la emocionante intersección de mis dos caminos de investigación diferentes como estudiante de posgrado en Biofísica en el laboratorio de Lingyin Li. Combinando la precisión química con el interrogatorio inmunológico, estoy investigando los mecanismos moleculares de la activación inmune innata y desarrollando enfoques para la regulación terapéutica.


Entrega de fármacos mediante liposomas

Los liposomas son vehículos exitosos de administración de fármacos recetados para varios tipos de cáncer, pero también para el tratamiento de infecciones fúngicas o el manejo del dolor. Ahora, investigadores de la Universidad Médica de Viena muestran un método sencillo para funcionalizar los liposomas para una focalización específica, lo que podría allanar el camino hacia la medicina personalizada. El estudio se ha publicado ahora en Nanomedicine-Nanotechnology, Biology, and Medicine.

El concepto de administración de fármacos liposomales ha revolucionado el campo farmacéutico y entró en la práctica hace unos 20 años cuando se aprobó la primera formulación liposomal del fármaco anticanceroso doxorrubicina para uso clínico. Los liposomas, vesículas de fosfolípidos de & lt200 nm, se retienen por más tiempo en la circulación sanguínea y se acumulan en sitios patológicos (tumores o tejidos inflamados), lo que conduce a una mayor eficacia y menor toxicidad sistémica en comparación con los fármacos libres que encapsulan. Para dirigir los liposomas a ciertos tejidos o células, como las células tumorales, se debe unir a la superficie del liposoma un aglutinante específico de una proteína única (un antígeno) en la célula diana, conocida como anticuerpo monoclonal. Este acoplamiento se denomina funcionalización del liposoma y se realiza químicamente, a menudo en las etapas finales de la producción de liposomas y puede dañar potencialmente el liposoma o el anticuerpo dirigido.

El nuevo estudio de Anna Ohradanova-Repic y sus colegas del Instituto de Higiene e Inmunología Aplicada, Centro de Fisiopatología, Infectiología e Inmunología de la Universidad Médica de Viena en colaboración con la Universidad de Minho, Braga, Portugal, muestra no solo un inteligente sino También es una forma fácil de funcionalizar los liposomas: unieron el pequeño fragmento específico del anticuerpo, llamado Fab, mediante tecnología genética con un ancla hidrófoba. A través de este anclaje hidrófobo, el fragmento Fab se insertó naturalmente en la parte de la membrana liposomal hidrófoba durante la preparación del liposoma. "Fue bastante fascinante ver lo fácil que era la funcionalización de los liposomas. Probamos dos fragmentos Fab diferentes y ambos funcionaron muy bien. Observamos una orientación específica no solo a las células positivas al antígeno en la placa de laboratorio, sino también a los ratones, donde nuestro Los liposomas reconocieron con precisión los tumores humanos que habíamos implantado ”, dice Anna Ohradanova-Repic, investigadora principal detrás del estudio.

Hannes Stockinger, el autor principal del estudio, agrega: "Si unimos este método de administración con la detección de los tumores del paciente para detectar la presencia de una proteína de superficie única, a la que podemos apuntar con los liposomas funcionalizados con fragmentos Fab, podríamos ser capaces de tratar los tumores de manera más eficiente y disminuir sustancialmente los efectos secundarios de los medicamentos contra el cáncer suministrados. Preveo esto como una medicina personalizada del futuro. Sin embargo, queda mucho trabajo por delante para implementar esta estrategia de tratamiento en la práctica clínica ".


The Minnes Lab - laboratorio de bioelectromagnetismo

Una arquitectura de dispositivo multicapa única para lograr células solares de nanocristales de ultra alta eficiencia.

Explorando el mecanismo de las interacciones célula-célula en las células nerviosas

Investigar la arquitectura de la red neuronal para aprender sobre el mecanismo de las interacciones célula-célula en las células nerviosas

Miembros del laboratorio

Refael Minnes, PhD.

Michal Amar Sharon

Ayan Barbora

Svetlana Lysenko

Publicaciones

  • Ayan Barbora, Oryan Bohar, Ariel Alexander Sivan, Eyal Magory, Ariel Nause y Refael Minnes, 2021, "La frecuencia de pulso más alta de la irradiación láser del infrarrojo cercano aumenta la profundidad de penetración para aplicaciones biomédicas novedosas". PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0245350

Posiciones abiertas

Doctor. estudiante

Requisitos

  • Debes tener una maestría en física, química o biología. La experiencia en métodos espectroscópicos, procesamiento de imágenes, programación y / o estadísticas es ventajosa.
  • Estás listo para trabajar en un entorno interdisciplinario
  • Está interesado en aplicar métodos físicos en la investigación biológica y médica.
  • Habla inglés con fluidez, tanto al escribir como al hablar
  • Tiene una personalidad independiente y práctica y capacidad para tomar iniciativas.

Bonificaciones

Somos un equipo de investigación multidisciplinar que explora las interacciones de las ondas electromagnéticas, específicamente en el rango UV-Vis-IR, con tejidos y células biológicas.
Todas las oportunidades que puede ofrecer un departamento universitario, como la colaboración científica, la educación y la formación, están disponibles.

Para obtener información adicional sobre un doctorado. en la Universidad de Ariel, visite:
https://www.ariel.ac.il/wp/graduate-school/en/#.

Envíe su solicitud completa electrónicamente al Dr. Refael Minnes. Solicitamos una carta de motivación y su CV más transcripciones de grados BSc, MSc o equivalentes.

Investigador postdoctoral

Requisitos

  • Deberías tener un doctorado. Licenciada en física, química o biología con experiencia en métodos espectroscópicos.
  • La experiencia en terapia fotodinámica (TFD) es una ventaja.
  • Estás listo para trabajar en un entorno interdisciplinario.
  • Está interesado en aplicar métodos físicos en la investigación biológica y médica.
  • Habla inglés con fluidez, tanto al escribir como al hablar
  • Tiene una personalidad independiente y práctica y capacidad para tomar

Bonificaciones

Somos un equipo de investigación multidisciplinar que explora las interacciones de las ondas electromagnéticas, específicamente en el rango UV-Vis-IR, con tejidos y células biológicas.
Todas las oportunidades que puede ofrecer un departamento universitario, como la colaboración científica, la educación y la formación, están disponibles.

Para obtener información adicional sobre un empleo en la Universidad de Ariel, visite https://www.ariel.ac.il/wp/graduate-school/en/#.

Envíe su solicitud completa electrónicamente al Dr. Refael Minnes. Solicitamos una carta de motivación y su CV más las transcripciones de las calificaciones de BSc, MSc y PhD o equivalentes.

Doctor. estudiante

Requisitos

  • Debe tener una maestría en física, química o biología con experiencia en métodos espectroscópicos.
  • La experiencia en microscopía FTIR es una ventaja.
  • Estás listo para trabajar en un entorno interdisciplinario.
  • Está interesado en aplicar métodos físicos en la investigación biológica y médica.
  • Habla inglés con fluidez, tanto al escribir como al hablar
  • Tiene una personalidad independiente y práctica y capacidad para tomar iniciativas.

Bonificaciones

Somos un equipo de investigación multidisciplinario que explora las interacciones de las ondas electromagnéticas, específicamente en el rango UV-Vis-IR, con tejidos y células biológicas. Todas las oportunidades que puede ofrecer un departamento universitario, como la colaboración científica, la educación y la formación, están disponibles.

Para obtener información adicional sobre un doctorado. en la Universidad de Ariel, visite:
https://www.ariel.ac.il/wp/graduate-school/en/#.

Envíe su solicitud completa electrónicamente al Dr. Refael Minnes. Solicitamos una carta de motivación y su CV más transcripciones de grados BSc, MSc o equivalentes.


Abstracto

Los liposomas son estructuras vesiculares compuestas por lípidos que se forman en soluciones acuosas. Estructuralmente, se parecen a la membrana lipídica de las células vivas. Por lo tanto, se han investigado ampliamente, desde la década de 1960, como modelos para estudiar la membrana celular y como portadores de protección y / o liberación de agentes bioactivos. Se han utilizado en diferentes áreas de investigación, incluidas vacunas, imágenes, aplicaciones en cosmética e ingeniería de tejidos. La ingeniería de tejidos se define como una estrategia para promover la regeneración de tejidos para el cuerpo humano. Esta estrategia puede implicar la aplicación coordinada de tipos celulares definidos con andamios de biomateriales estructurados para producir estructuras vivas. Para crear un nuevo tejido, basado en esta estrategia, se necesita una estimulación controlada de células cultivadas, mediante una combinación sistemática de agentes bioactivos y señales mecánicas. En esta revisión, destacamos el papel potencial de los liposomas como plataforma para la entrega sostenida y local de agentes bioactivos para enfoques de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

1. Introducción

Los lípidos son moléculas pequeñas hidrófobas o anfifílicas [1]. Por tanto, se pueden clasificar en acilos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, lípidos de esterol, lípidos prenol, sacarolípidos y policétidos [2,3]. La naturaleza anfifílica de algunos lípidos les permite formar estructuras organizadas, como vesículas o membranas, cuando se sumergen en un ambiente acuoso. Pueden extraerse de tejidos derivados de plantas o animales mediante disolventes de baja polaridad como el cloroformo.

Los lípidos juegan un papel vital en los eventos fisiológicos y fisiopatológicos de los sistemas vivos [4]. Se cree que la vida comenzó cuando los ácidos nucleicos estaban encerrados dentro de una membrana. La membrana biológica separa los ácidos nucleicos del entorno externo y controla la transferencia de información y el transporte de iones y moléculas entre el interior y el exterior de la membrana celular. Una membrana celular es un sistema complejo y dinámico que consta de dos moléculas lipídicas que se mantienen unidas por interacciones hidrófobas y se autoensamblan como una bicapa continua con proteínas incrustadas dentro de la membrana o asociadas transitoriamente con ella (figura 1) [6].

Figura 1. Una membrana celular es un fluido con varias proteínas adheridas a la bicapa lipídica. Adaptado de [5]. (Versión online en color).

Este sistema dinámico es obviamente necesario para la vida. La parte interna de la membrana celular agrega los restos hidrófobos de los lípidos y la parte exterior es hidrófila. Las proteínas integrales suelen estar en el núcleo hidrofóbico de la bicapa [5]. Las proteínas periféricas están unidas a la superficie de la membrana. El modelo de mosaico fluido plantea la hipótesis de que la membrana plasmática y las membranas de los orgánulos consisten en proteínas incrustadas en una bicapa de fosfolípidos fluidos. La posición de las proteínas no es estática. Al igual que los fosfolípidos de la bicapa, las proteínas de membrana están en constante movimiento [5]. Por lo tanto, la membrana celular permite que las reacciones químicas ocurran de manera mucho más eficiente en un área cerrada y protege la información genética. El principal orgánulo biosintético de lípidos es el retículo endoplásmico que produce la mayor parte de los fosfolípidos estructurales y el colesterol [7]. La función lipídica más importante del organismo es su papel en la membrana plasmática.

Los glicerofosfolípidos, o fosfolípidos, son componentes clave de la bicapa lipídica de las células [8-10]. Los fosfolípidos, junto con las proteínas de membrana y el colesterol, están involucrados en muchas funciones celulares como el control de la forma celular, la compartimentación, el almacenamiento de compuestos, el transporte de iones, el metabolismo, los procesos de señalización celular y los procesos de fusión celular [10]. Los fosfolípidos consisten en un glicerol que está unido a un grupo fosfato (PO4 2−) y a dos ácidos grasos. En algunos casos, el grupo fosfato está unido a otra molécula orgánica pequeña, como la colina. La figura 2 muestra un ejemplo de un fosfolípido y las partes principales de su composición. En §2.1 se comentarán más detalles sobre los lípidos y sus propiedades.

Figura 2. Estructura química, tridimensional y esquemática de L-α-fosfatidilcolina hidrogenada (soja) (HSPC) compuesta por cadenas de ácidos grasos, esqueleto de glicerol y grupo de cabeza (colina). Adaptado de [11]. (Versión online en color).

Los fosfolípidos pueden clasificarse en naturales o sintéticos. Los fosfolípidos naturales pueden obtenerse de diversas fuentes, como la soja o la yema de huevo. En términos de los grupos de cabeza polares, los fosfolípidos se clasifican en fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilglicerol (PG) y ácido fosfatídico (PA). El PC y el PE son los fosfátidos más abundantes en plantas y animales y también son los más utilizados para producir liposomas [12]. Sin embargo, los fosfolípidos naturales son menos estables que los fosfolípidos sintéticos [13]. Los fosfolípidos sintéticos se pueden producir a partir de lípidos naturales. La modificación de las regiones polares y no polares de las moléculas de fosfolípidos permite la creación de una variedad ilimitada de fosfolípidos bien definidos y caracterizados [13]. Ejemplos de lípidos sintéticos son dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC) y fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), ( 1-palmitoil-2-estearoil (5-DOXYL) -sn-glicero-3fosfocolina (SLPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3 -fosfo- (1'-rac-glicerol) (DSPG), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfato (DSPA).

Los lípidos de esteroles, como el colesterol (Chol) y sus derivados, son lípidos hidrófobos que tienen un papel importante en la membrana celular animal [7]. Los esteroides son una familia de lípidos que se distingue por la estructura de cuatro anillos que se muestra en la figura 3. Los diversos esteroides se diferencian entre sí por los grupos funcionales o grupos laterales unidos a esos anillos. El chol se distingue por una "cola" de hidrocarburo formada por subunidades de isopreno. Es un componente importante de las membranas plasmáticas en muchos organismos. En los mamíferos, también se utiliza como punto de partida para la síntesis de varias de las moléculas de señalización llamadas hormonas. El estrógeno, la progesterona y la testosterona son ejemplos de hormonas derivadas de Chol [14].

Figura 3. Estructura química, tridimensional y esquemática del colesterol (Chol). Adaptado de [14]. (Versión online en color).

Los compuestos que contienen elementos tanto hidrófilos como hidrófobos se denominan anfifílicos. La naturaleza anfifílica de los fosfolípidos es de suma importancia para su función biológica [14]. En concreto, esta estructura es responsable de su presencia y papel funcional en las membranas celulares. Los fosfolípidos se autoensamblan espontáneamente en fases cristalinas líquidas liotrópicas ordenadas en presencia de agua [10]. La formación de estas estructuras a base de lípidos depende de los factores intrínsecos de los fosfolípidos, como la naturaleza y el tamaño del grupo de lípidos, la longitud y el grado de insaturación de las cadenas de acilo, y de los factores extrínsecos, como la temperatura, el pH y la concentración. y la presencia de solutos y otros lípidos [7,10]. Ejemplos de estructuras basadas en lípidos son monocapas, bicapas lipídicas, micelas, liposomas y túbulos [7, 15]. A continuación, revisaremos el uso de lípidos para formar liposomas y discutiremos algunas de sus aplicaciones, centrándonos principalmente en la ingeniería de tejidos (TE) y la medicina regenerativa.

2. Liposomas

Los liposomas son vesículas autoensambladas que tienen la capacidad de encapsular soluciones acuosas y compuestos hidrófobos. Se consideran los sistemas nanoportadores más antiguos, que fueron descubiertos por primera vez a mediados de la década de 1960 por A. D. Bangham [16]. Bangham realizó experimentos para determinar cómo se comportan los lípidos cuando se sumergen en agua. Cuando se dispuso de microscopios electrónicos de transmisión, Bangham pudo obtener imágenes de alta resolución de las mezclas de lípidos y agua. Las imágenes mostraron que los lípidos forman vesículas llenas de agua, parecidas a células, a las que llamó liposomas [14]. Para más detalles sobre el desarrollo de los liposomas, se remite al lector a una revisión reciente que cita las importantes contribuciones de los primeros pioneros en el campo de los liposomas [17]. Desde su descubrimiento, se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios para comprender sus propiedades biofísicas y bioquímicas y sus posibles aplicaciones. Se han utilizado como: sistemas de membranas modelo para estudiar la naturaleza básica de las membranas celulares [6], en bioquímica y biología molecular [6,18], en métodos analíticos [18], en tecnologías de microfluidos [19], como plantilla para la producción de nanogeles [20], en cosmética y tecnología alimentaria [21,22], en imágenes [23], como sistemas de administración de fármacos en farmacología [24-26] y en TE [27]. En esta sección, revisaremos las propiedades de los liposomas, su formulación / funcionalización, métodos de preparación y estabilidad.

2.1. Propiedades de los liposomas

Los liposomas son bicapas lipídicas esféricas con diámetros que van desde la escala nanométrica hasta la micrométrica [28]. Los liposomas tienen diferentes ventajas en comparación con otros sistemas de transporte alternativos [29, 30]. Una de las principales ventajas es el hecho de que están hechos de materiales naturales, es decir, lípidos, y se pueden sintetizar fácilmente en el laboratorio.

Las propiedades de los liposomas dependen principalmente de las características de los lípidos. Un fosfolípido tiene un grupo de cabeza, un esqueleto de glicerol y dos cadenas de ácidos grasos (las llamadas colas), como se describe anteriormente y se muestra en la figura 2. Uno de los grupos de oxígeno del ácido fosfórico puede esterificarse a una variedad de moléculas orgánicas, incluido el glicerol. , colina, etanolamina, serina e inositol. Ejemplos de lípidos negativos son PG, PS, PI y PA. Otros lípidos, como el 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) y el 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), se mezclan con fosfolípidos neutros para producir liposomas cargados positivamente [3]. La naturaleza del fosfolípido también está relacionada con la longitud de las cadenas de ácidos grasos. Por tanto, los ácidos grasos difieren en el número de átomos de carbono y el grado de insaturación [3]. Cuando existe un doble enlace entre dos átomos de carbono (C = C) en una cadena de hidrocarburo, se dice que la cadena está insaturada, mientras que las cadenas de hidrocarburos sin dobles enlaces (es decir, C - C) se dice que están saturadas. La longitud y el grado de saturación de la cadena lipídica influyen en la temperatura de transición de la fase cristalina líquida del gel, TC (tabla 1). Teniendo en cuenta el número de átomos de carbono, el ácido graso puede denominarse láurico (C12), mirístico (C14), palmítico (C16) y esteárico (C18). En general, los ácidos grasos insaturados se encuentran en fosfolípidos naturales como el PC. DPPC, DMPC, DSPC y HSPC son los fosfolípidos sintéticos más comunes.

Tabla 1. Transición de fase cristalina (TC) de algunos fosfolípidos. Adaptado de [31].

En ambientes acuosos, los lípidos tienden a autoensamblarse en vesículas. Las interacciones entre ellos, las interacciones hidrofílicas entre grupos de cabeza polares, las interacciones de van der Waals entre cadenas de hidrocarburos y también con el agua (interacciones hidrofílicas y efecto hidrofóbico) conducen a la formación de estructuras lipídicas como liposomas y micelas (figura 4) [32]. Las micelas son gotitas diminutas que se crean cuando las cabezas hidrófilas de los fosfolípidos miran hacia el agua, y las colas hidrófobas se agrupan para esconderse de las moléculas de agua. Los fosfolípidos con colas compactas y cortas tienden a formar micelas. Los fosfolípidos con colas más largas tienden a formar liposomas (bicapa lipídica con dos láminas de moléculas de fosfolípidos). La cabeza del fosfolípido podría contener enlaces covalentes altamente polares, así como cargas positivas y negativas. Por lo general, estas cargas y enlaces polares de la cabeza interactúan con las moléculas de agua, cuando se coloca un fosfolípido en una solución, mientras que las colas de ácido graso de un fosfolípido no interactúan con el agua (no polar), lo que significa que no se forman. enlaces de hidrógeno con la cola de hidrocarburo [14].

Figura 4. Partículas alternativas a base de lípidos: micela y liposoma. (Versión online en color).

La relativa fluidez y la movilidad de cada molécula lipídica dentro de la bicapa constituyen propiedades importantes de los liposomas. La bicapa lipídica tiende a permitir que una sustancia determinada la atraviese, la denominada permeabilidad selectiva [32].Esto significa que el entorno interno de un liposoma puede volverse diferente del espacio exterior. De hecho, esta capacidad de mantener diferentes ambientes entre el espacio externo e interno es también una de las principales características de las células [14, 15].

Como se mencionó anteriormente, los liposomas comprenden membranas altamente selectivas (figura 5). Las pequeñas moléculas no polares se mueven rápidamente a través de la bicapa lipídica, mientras que las moléculas grandes y las sustancias cargadas cruzan la membrana lentamente [14, 33]. Además, las moléculas de agua y los iones también pueden moverse a través de la bicapa lipídica. Básicamente, el agua se mueve a través de las bicapas lipídicas desde regiones de alta concentración a regiones de baja concentración por ósmosis. Los solutos se mueven por difusión desde una región de alta concentración a una región de baja concentración [14]. Una comparación entre la permeabilidad de la glucosa y la sacarosa indica que las moléculas más pequeñas (glucosa) se difunden más rápido que las moléculas más grandes (sacarosa) en dos órdenes de magnitud [33]. Comparando la difusión de glucosa e iones, siendo la glucosa una molécula más grande, su coeficiente de permeabilidad es aproximadamente de 6,40 a 250 veces mayor que el de Cl -, K + y Na +. La permeabilidad de la bicapa lipídica es muy sensible a la carga del ion, siendo mayor en el caso del Cl - en más de un orden de magnitud en comparación con los cationes monovalentes [33]. Además, los liposomas tienen una baja permeabilidad a las moléculas hidrófilas y una alta permeabilidad a las moléculas hidrófobas [17]. En la sección "Liberación de agentes bioactivos a partir de liposomas" se discutirán más detalles sobre la cinética de liberación de agentes bioactivos de los liposomas.

Figura 5. Permeabilidad selectiva de las bicapas lipídicas. Adaptado de [14]. (Versión online en color).

El grado de saturación de ácidos grasos también afecta la permeabilidad de las bicapas lipídicas a moléculas específicas (figura 6) [15]. Debido a que los enlaces C - H tienen más energía libre que los enlaces C = C, las grasas saturadas tienen mayor energía química que las grasas insaturadas [14]. Los dobles enlaces crean espacios entre las colas apretadas. En consecuencia, las bicapas lipídicas que contienen muchos ácidos grasos insaturados tienen más espacios y pueden ser más permeables que las bicapas con menos ácidos grasos insaturados [14].

Figura 6. Hidrocarburos saturados e insaturados. Un doble enlace en una cadena de hidrocarburos crea espacios en la doble capa. Adaptado de [14]. (Versión online en color).

Otro parámetro que puede afectar la movilidad de los lípidos dentro de la bicapa es la temperatura [34]. A una temperatura determinada, puede existir una bicapa lipídica en fase gelificada o líquida (figura 7). Dependiendo del lípido TC, las membranas compuestas por diferentes lípidos pueden exhibir diferentes niveles de fluidez a la misma temperatura. los TC de fosfolípidos depende de lo siguiente: (i) la longitud de la cadena de acilo en el lípido (ii) el grado de saturación de las cadenas de hidrocarburos en el lípido (iii) la fuerza iónica del medio de suspensión y (iv) el tipo de el grupo de cabeza polar [36].

Figura 7. Efecto de la temperatura y el Chol sobre la permeabilidad de la bicapa de fosfolípidos. Chol elimina la fase de transición de la bicapa lipídica. El Chol aumenta la permeabilidad de la bicapa lipídica en la fase de gel y la disminuye en la fase fluida. Adaptado de [15,35]. (Versión online en color).

Las bicapas lipídicas dominadas por fosfolípidos con colas de hidrocarburos largas y saturadas deben ser más rígidas y menos permeables, porque las interacciones entre las colas son más fuertes, lo que lleva a una alta TC. De hecho, las interacciones hidrofóbicas se vuelven más fuertes a medida que las colas de hidrocarburos saturados aumentan de longitud [37]. Además, los lípidos de la cola más largos tienen más área para interactuar [31,35,38]. Por el contrario, los lípidos insaturados tienen un nivel significativamente más bajo TC que los lípidos saturados [32].

Después de la formación de los liposomas, el movimiento de las moléculas dentro y a través de la bicapa lipídica está influenciado por la temperatura y la estructura de las colas de hidrocarburos [14]. Como se ilustra en la figura 7, a una temperatura por debajo de la TC, los fosfolípidos se encuentran en fase de gel, presentando baja fluidez y permeabilidad a los cationes monovalentes y divalentes encapsulados [15]. A esta temperatura, las moléculas individuales dentro de la bicapa se mueven lentamente. Como resultado, las colas hidrófobas en el interior de la bicapa lipídica se compactan más estrechamente [14]. A una temperatura superior a la TC, los fosfolípidos están en fase líquida y tienen una gran fluidez, pero también una permeabilidad relativamente baja [15]. Por lo tanto, las moléculas individuales dentro de la bicapa lipídica se mueven rápidamente. A una temperatura igual a TC, la bicapa lipídica aumenta la permeabilidad en varios órdenes de magnitud. Este fenómeno se atribuye a la presencia de regiones interfaciales altamente permeables entre los dominios de bicapa de fluido y gel coexistentes [15,39].

Como se describió anteriormente, el colesterol y sus derivados se incluyen típicamente en la preparación de liposomas. Por tanto, la presencia de Chol tiene una gran influencia en las propiedades de las bicapas lipídicas [31,33]. Específicamente, la adición de Chol a una bicapa lipídica disminuye su fluidez y permeabilidad al agua dentro de la fase fluida. La molécula de Chol se orienta entre las moléculas de fosfolípidos, con su grupo hidroxilo frente a la fase acuosa, el anillo tricíclico intercalado entre los primeros carbonos de las cadenas de acilo graso, en el núcleo de hidrocarburo de la bicapa lipídica [3]. Debido a que los anillos de esteroides de Chol son densos, la adición de Chol a una bicapa lipídica debería aumentar la densidad de la sección hidrófoba. Esto disminuye la flexibilidad de las cadenas lipídicas circundantes, aumenta la rigidez mecánica de las bicapas fluidas y disminuye su difusión lateral (figura 7). Además, el Chol puede inhibir la cristalización de las cadenas de hidrocarburos de los lípidos saturados para formar un sistema en estado de gel [33,36]. Se observó que el efecto de Chol en la disminución de la permeabilidad de Na +, K +, Cl - y glucosa a 36 ° C es independiente de la carga superficial y de los grupos de cabeza [33]. La permeabilidad se redujo en un factor de 4 a 18 para los cationes y solo en 2 para la glucosa y el Cl -. Los autores concluyeron que el chol afecta el proceso de disolución más que el proceso de difusión [33]. Por tanto, la adición de Chol a la bicapa lipídica modifica su empaquetamiento molecular. La bicapa lipídica se vuelve más condensada en comparación con los fosfolípidos puros por encima de la TC, y más líquido en comparación con los fosfolípidos puros por debajo de la TC [33].

2.2. Formulación y funcionalización

Una de las principales preocupaciones en el diseño de una formulación de liposomas es la estabilidad del agente bioactivo y de los componentes lipídicos, que pueden verse afectados por la concentración de lípidos, el medio ambiente, el pH y la temperatura, y también su susceptibilidad a la degradación enzimática. Además, la formulación de liposomas depende del agente bioactivo a encapsular, el método de preparación, la composición de fosfolípidos y la aplicación pretendida. Las formulaciones de liposomas compuestas por fosfolípidos y Chol se definen como "liposomas convencionales" (figura 8a). La farmacología convencional de los liposomas y la distribución tisular dependen del tamaño, la carga superficial y la densidad de empaquetamiento de la membrana [31]. Para la encapsulación de agentes bioactivos hidrófilos, el col y los fosfolípidos saturados son los factores más importantes que permiten reducir la permeabilidad de la membrana [31]. El colesterol se usa comúnmente en combinación con fosfolípidos, porque el Chol puede fortalecer las membranas de los liposomas, como se explicó anteriormente. El porcentaje molar de Chol dentro de la composición de liposomas no suele ser superior al 50% [12]. Las interacciones hidrofóbicas del Chol con los lípidos de la membrana obligan a los grupos de cabeza de fosfolípidos a proteger al Chol del agua [40]. El colesterol es necesario para la estabilización y el mantenimiento del agente bioactivo en el núcleo del liposoma, y ​​este efecto disminuye con el aumento de la temperatura [33].

Figura 8. Sección transversal de un liposoma: (a) liposoma convencional (B) SSL (C) liposoma dirigido a ligando (D) liposomas fluorescentes y liposomas cargados. (Versión online en color).

El descubrimiento en 1990 de la estabilización estérica fue uno de los principales avances en el desarrollo de liposomas [17]. El recubrimiento de los liposomas con polímeros hidrófilos como el polietilenglicol (PEG) cambia sus propiedades superficiales [41]. Las formulaciones de liposomas compuestas por fosfolípidos, Chol y PEG se definen como "liposomas estabilizados estéricamente" (SSL), también llamados liposomas "furtivos" o liposomas PEGilados (figura 8).B) [31,42]. Se sabe que las cadenas de PEG injertadas sobre membranas lipídicas actúan como cadenas poliméricas injertadas sobre superficies sólidas, que se estiran en cepillos con una densidad de superficie creciente. Sobre la base de este concepto, se cree que la superficie PEGilada proporciona una barrera estérica que evita la adsorción de proteínas en la superficie del liposoma [31,42]. Se han descrito numerosas formulaciones de SSL para la administración sistémica de agentes bioactivos [25]. Sin embargo, esta modificación de la superficie reveló algunas limitaciones debido a su degradación bajo estrés mecánico como resultado de su estructura etérea y su no biodegradabilidad, así como la posible acumulación resultante en el cuerpo [43]. Inicialmente, se creía que los SSL podrían ser no inmunogénicos, pero se puede provocar una respuesta inmune después de administraciones posteriores de liposomas PEGilados, lo que conduce a un rápido aclaramiento de la sangre o efectos secundarios indeseables [25,44]. Por lo tanto, los SSL deben diseñarse de manera que se eviten las limitaciones asociadas con el PEG, que afectan principalmente a la vida media de la circulación sanguínea y la biodisponibilidad intracelular [25,43,45]. También se propuso una variedad de polímeros sintéticos y naturales como poli (aminoácidos), heparina, dextrano y quitosano para reemplazar al PEG [43].

El suministro eficaz de agentes bioactivos a las células diana sigue representando un enorme desafío. Una de las estrategias más prometedoras implica la unión covalente de un ligando en el extremo de las cadenas de PEG injertadas en la superficie del liposoma, que pretende interactuar con antígenos o receptores sobreexpresados ​​en la superficie de las células diana [46,47]. Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos son los restos / ligandos más utilizados debido a la alta especificidad por sus antígenos diana [28]. Esto ha dado lugar a una nueva clase de nanoportadores denominados liposomas dirigidos a ligandos [48,49]. La conjugación de anticuerpos puede realizarse directamente a la bicapa lipídica de los liposomas en presencia o ausencia de cadenas de PEG o al extremo distal de la cadena de PEG (figura 8C). Los primeros, los liposomas dirigidos a anticuerpos se eliminan rápidamente de la circulación, lo que limita su en vivo biodistribución. El PEG podría eventualmente usarse para superar esta limitación. Sin embargo, cuando los anticuerpos se unen a la superficie del liposoma, su unión al antígeno puede estar enmascarada por la presencia de PEG en el mismo liposoma, especialmente cuando se usan moléculas de PEG de cadena más larga. Por tanto, la última estrategia, el acoplamiento de ligandos al terminal de moléculas de PEG injertadas en la superficie del liposoma, es la más utilizada [17]. Los liposomas de caballo de Troya son vectores de transporte cerebral que incluyen péptidos endógenos, proteínas modificadas y anticuerpos monoclonales peptidomiméticos [49]. Estos liposomas se dirigen a receptores / sistemas de transporte específicos del endotelio capilar cerebral y experimentan transcitosis mediada por receptores a través de la barrera hematoencefálica.

Los lípidos fluorescentes también se utilizan en las formulaciones de liposomas (figura 8D). Los liposomas que llevan fluoróforos encapsulados se han sintetizado como nuevos marcadores fluorescentes para visualizar perfiles de flujo en estructuras microfabricadas [19]. Los lípidos marcados con fluorescencia se incorporan dentro de la bicapa lipídica y tienen la siguiente función: desencadenar una fusión rápida de membranas, permitir la obtención de imágenes de fluorescencia de las membranas celulares y los procesos de tráfico de membranas [50]. Además, los lípidos cargados negativa y positivamente también se añaden a la formulación de liposomas para ayudar en la estabilización de los liposomas y evitar la aglomeración [51].

Los liposomas de DSPC / Chol (3: 2) extruidos a través de filtros de 400 nm se aclararon 7,5 veces más rápido que los liposomas extruidos a través de filtros de 200 nm, que a su vez se aclaran cinco veces más rápido que las pequeñas vesículas unilaminares (ULV) [52]. Se investigó la depuración de liposomas que contienen PEG-PE de diferentes tamaños (menos de 70 nm, 150-200 nm y más de 300 nm) [53]. Se encontró que los liposomas más grandes (más de 300 nm) y los liposomas pequeños (menos de 70 nm) se eliminaban más rápidamente de la circulación que los liposomas de tamaño 150-200 nm [53]. En otro estudio, el aclaramiento no se vio afectado por el contenido de Chol de los liposomas [54]. Se prepararon liposomas de diferente composición con un tamaño de partícula de aproximadamente 90 nm utilizando DSPC, Chol y colesten-5-iloxi-norte- (4 - ((1-imino-2- d-tiogalactosiletil) amino) butil) formamida (Gal-C4-Chol), y marcado con [3 H] colesterol hexadecil éter [55]. Los liposomas DSPC / Chol / Gal-C4-Chol (60: 35: 5) exhiben una captación hepática extensa en comparación con los liposomas DSPC / Chol (60: 40) [55]. Kawakami et al. [56,57] sintetizaron un derivado de colesterol manosilado (Man-C4-Chol) para la transfección de genes a macrófagos mediada por el receptor de manosa, y estudiaron el efecto de la composición lipídica de los liposomas catiónicos manosilados en en vivo transfección de ADN plasmídico (ADNp). El ADNp complejado con liposomas Man-C4-Chol mostró una mayor actividad de transfección que la complejada con liposomas catiónicos convencionales usando macrófagos peritoneales de ratón. Por lo tanto, la eficacia de transfección de pDNA complejado con liposomas Man-C4-Chol se inhibió en presencia de manosa, lo que sugiere que los complejos de pDNA y liposomas catiónicos manosilados son reconocidos y captados por los receptores de manosa en macrófagos. Las formulaciones de liposomas, Man-C4-Chol (1 / 0.5 / 0.5), Man-C4-Chol / DOPE (3/2) y DOTMA / Chol (1/1), complejadas con el gen de luciferasa que codifica el pDNA (pCMV-Luc ) se compararon mediante inyecciones intravenosas e intraportales en ratones. La expresión génica más alta se observó en el pulmón utilizando los liposomas catiónicos DOPE / Chol de control con ambas rutas. Los complejos de liposoma / ADN Man-C4-Chol / DOPE mostraron la expresión génica más alta en el hígado después de la inyección intravenosa e intraportal. El liposoma DOTMA / Chol / Man-C4-Chol mostró la mayor expresión génica en el hígado mediante inyección intravenosa, pero la inyección intraportal mostró una alta expresión en el pulmón [56,57].

2.3. Clasificación

Los liposomas podrían clasificarse según el método de preparación, el número de bicapas presentes en la vesícula o su tamaño [3]. Sin embargo, la clasificación de los liposomas por el número de bicapas y el tamaño son las más utilizadas, más que por el método de preparación. Según el número de bicapas y vesículas, los liposomas se clasifican como ULV (25 nm a 1 µm), vesículas multilamelares (MLV, 0,1 a 15 µm) o vesículas multivelesiculares (MVV, 1,6 a 10,5 µm). . Además, según su tamaño, los liposomas unilaminares se clasifican en vesículas unilaminares grandes (LUV, 100 nm a 1 µm) y vesículas unilaminares pequeñas (SUV, 25-50 nm) (figura 9) [18].

Figura 9. Estructura de la bicapa lipídica y tipos de liposomas: MLV, MVV, ULV. Además, los ULV se pueden subclasificar como LUV y SUV. Adaptado de [18]. (Versión online en color).

2.4. Métodos de preparación

En la bibliografía se pueden encontrar muchos informes sobre la producción de liposomas [3,16,37,58-62]. Los métodos habituales de producción de liposomas incluyen: hidratación de película fina, evaporación en fase inversa, inyección de etanol, dilución de poliol, congelación-descongelación, emulsiones dobles, método proliposoma, extrusión de prensa francesa, eliminación de detergente y homogeneización a alta presión [12,37,51] . Estos métodos suelen producir LUV o MLV, según el método seleccionado. Aunque todos estos métodos se pueden utilizar para fabricar liposomas, sólo se utilizan normalmente tres de ellos [63]: la hidratación de película fina, la evaporación en fase inversa y el método de inyección de etanol, que se describen a continuación. Una de las principales preocupaciones en la fabricación de liposomas es la toxicidad relacionada con los disolventes orgánicos utilizados. Se han sugerido varias técnicas para eliminar las trazas de detergente y disolvente de los liposomas. Estas técnicas incluyen la filtración en gel, el vacío, la centrifugación y la diálisis [51]. Se ha descrito un nuevo método para la producción rápida de liposomas sin el uso de productos químicos o procesos peligrosos. Este método implica la hidratación de los componentes del liposoma en un medio acuoso, seguido del calentamiento (hasta 120 ° C) de estos componentes en presencia de glicerol (3% v / v) [64,65]. Para más detalles sobre este método para la preparación de liposomas, se remite al lector a la revisión en [51].

2.4.1. Hidratación de película fina

El método original de Bangham es el más simple en comparación con los otros métodos mencionados anteriormente [16,61]. Implica el uso de disolventes orgánicos volátiles, principalmente cloroformo, éter o metanol, para disolver o solubilizar los lípidos. Los lípidos se depositan como una fina película en la pared del fondo de un matraz redondo, mientras que el disolvente se evapora mediante una técnica de evaporación rotatoria, bajo presión reducida o una corriente de nitrógeno. A los lípidos depositados se les añade un tampón acuoso, permitiendo su hidratación, a una temperatura superior a la TC del lípido o del componente de mayor punto de fusión de la mezcla [66]. Se pueden producir diferentes MLV dependiendo del tiempo de hidratación, el método de resuspensión, la concentración y composición de lípidos y el volumen de suspensión de la fase acuosa [12]. Al comparar los métodos de hidratación de película fina, evaporación en fase inversa y de inyección de etanol para preparar liposomas catiónicos, los resultados mostraron que los liposomas preparados por el método de película fina eran de la mejor calidad y estabilidad [63]. Este método de preparación de liposomas también presenta algunas limitaciones, como la baja capacidad de encapsulación y la dificultad para producir liposomas de tamaño nanométrico. Sin embargo, se puede emplear la sonicación o extrusión a través de membranas de policarbonato para obtener ULV [12,18,51].

2.4.2. Evaporación de fase inversa

En este método, los liposomas se forman a partir de emulsiones de fosfolípidos y tampón de agua en aceite, en un exceso de una fase orgánica. Los fosfolípidos se disuelven primero en disolventes orgánicos para formar una película, luego los disolventes se eliminan por evaporación. La película delgada se resuspende en éter dietílico, seguido de la adición de agua. A continuación, la preparación se somete a ultrasonidos durante un breve período de tiempo, formando una emulsión homogénea. Los disolventes orgánicos se eliminan a presión reducida mediante evaporación rotatoria continua, dando como resultado la formación de una fase intermedia viscosa similar a un gel caracterizada por una dispersión LUV. Este método puede encapsular grandes macromoléculas, con alta eficiencia de encapsulación (EE) (20-68%).La principal desventaja de este método es la exposición del material a encapsular a disolventes orgánicos y condiciones de sonicación, que pueden resultar en la desnaturalización de moléculas sensibles [12,66].

2.4.3. Inyección de etanol

En este método, los lípidos disueltos en etanol se inyectan rápidamente en una solución tampón, donde forman espontáneamente SUV, con un diámetro de 30 nm [67]. Sin embargo, el tamaño de los liposomas se puede incrementar aumentando la concentración de lípidos [66]. Este método de preparación de liposomas tiene la ventaja de evitar el tratamiento químico o físico de los lípidos. Sin embargo, la concentración de vesículas producidas es baja e implica un paso adicional para eliminar el etanol [12].

2.5. Técnicas de caracterización de liposomas

Se requieren métodos de caracterización de los liposomas después de la producción y durante el almacenamiento para un control de calidad adecuado [3]. Además, las características químicas y físicas de los liposomas permiten su in vitro y en vivo comportamiento a predecir [31,68,69]. Las principales propiedades utilizadas para caracterizar los liposomas incluyen el diámetro medio y el índice de polidispersidad, el EE, la relación de fosfolípidos a concentración de fármaco y la determinación de lamelaridad [69]. El tamaño medio y la distribución del tamaño de los liposomas son parámetros importantes, especialmente cuando los liposomas están destinados a un uso terapéutico por vía inhalatoria o parenteral [69]. Por ejemplo, los liposomas pequeños pueden atravesar las fenestras de los sinusoides del hígado y pueden circular por el cuerpo durante períodos prolongados. Por el contrario, los macrófagos eliminan rápidamente los liposomas grandes [31]. Por tanto, la posible aplicación terapéutica de un liposoma dado está muy influenciada por su tamaño medio y, en consecuencia, por las posibles interacciones liposoma-célula en los sitios de acción diana.

La Tabla 2 enumera algunas técnicas utilizadas para caracterizar físicamente los liposomas, en términos de distribución de tamaño y potencial zeta. La dispersión de luz dinámica (DLS), a veces denominada espectroscopia de correlación de fotones o dispersión de luz cuasi elástica, es una técnica que permite medir el tamaño de las partículas en el rango submicrométrico [72]. Normalmente, las mediciones del tamaño de partículas se toman entre 2 y 5 minutos, lo que permite clasificar la DLS como una técnica rápida. Para proceder con el análisis DLS, las partículas (hasta decenas de miles) se suspenden en una solución y se iluminan con luz para que las partículas dispersen la luz en un índice de refracción determinado, diferente al del disolvente de suspensión [3]. Por tanto, los liposomas se miden en su estado natural, sin necesidad de deshidratación o tinción.

Tabla 2. Técnicas de caracterización física de liposomas.

Las técnicas microscópicas como la microscopía de fuerza atómica (AFM), la microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) pueden proporcionar más información sobre las estructuras a nanoescala de los liposomas. Pueden proporcionar información sobre forma y morfología (es decir, por AFM y TEM), dimensiones (por AFM, ESEM, TEM y CLSM), propiedades de la superficie (solo por AFM) y estructura interna (solo por CLSM) [70]. Al comparar todas estas técnicas basadas en microscopía, la microscopía electrónica (es decir, ESEM o TEM) requiere la técnica de congelación-fractura especializada, que es propensa a introducir distorsiones y artefactos en la preparación de muestras, y la necesidad de tener cientos de fotografías para proporcionar estadísticas comparables. , que constituyen técnicas que requieren mucho tiempo [69].

El potencial zeta (ζ) se utiliza para medir la intensidad de la interacción electrostática repulsiva entre partículas coloidales cargadas naturalmente [73]. De hecho, las mediciones del potencial zeta se utilizan comúnmente para predecir la estabilidad de los sistemas coloidales. Si todas las partículas en una suspensión tienen un gran potencial zeta negativo o positivo, tenderán a repelerse entre sí y, por lo tanto, no habrá tendencia a agregarse. Normalmente, las partículas con potenciales zeta más positivos que +30 mV o más negativos que -30 mV se consideran estables [69]. Sin embargo, si las partículas tienen valores de potencial zeta bajos, entonces no habrá fuerza para evitar que las partículas floculan [69].

La electroforesis láser Doppler (LDE) es la técnica más utilizada para medir el potencial zeta. En esta técnica, se usa un láser para proporcionar una fuente de luz, iluminando partículas dentro de las muestras. El rayo láser incidente atraviesa el centro de la celda de muestra y la luz se dispersa en un ángulo determinado, que se detecta. Cuando se aplica un campo eléctrico a la celda, cualquier partícula que se mueva a través del volumen de medición provocará una fluctuación de la luz detectada con una frecuencia proporcional a la velocidad de la partícula. Esta información se pasa a un procesador de señales digitales y, a continuación, se calcula el potencial zeta [69]. Esta técnica se ha utilizado para investigar cómo cambia el tamaño de las partículas en función de cualquier parámetro de la preparación. Se utiliza para monitorear el efecto de cambios de medio, p. Ej. pH, temperatura, surfactante, suero sanguíneo, adsorción de proteínas y para desarrollar formulaciones que resistan la agregación / floculación. También permite medir el espesor de los recubrimientos en la superficie de los liposomas. Se ha utilizado ampliamente para predecir la eficacia del recubrimiento de los liposomas contra la opsonización. en vivo [74]. Además, proporciona información sobre si el agente activo utilizado está encapsulado o adsorbido en la superficie de los liposomas. Por ejemplo, se puede obtener información sobre las interacciones ADN-liposoma, las interacciones ADN-péptido y la condensación del ADN durante la encapsulación liposomal, rastreando los cambios en el tamaño de los complejos liposoma-fármaco [74-76]. Sin embargo, existen varios factores que pueden afectar el potencial zeta, como el pH, la conductividad y la concentración de un componente de la formulación.

2.6. Limitaciones de los liposomas

Los liposomas se han utilizado ampliamente como vehículos para encapsular y proteger a los agentes bioactivos de los entornos circundantes. De hecho, los productos farmacéuticos liposómicos fueron el primer tipo de nanopartículas terapéuticas que se introdujeron en el mercado [77]. Por ejemplo, Doxil, un liposoma cargado de doxorrubicina, fue aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos en 1995 para el tratamiento del sarcoma de Kaposi [77]. A pesar de la exitosa aplicación clínica y de las ventajas de este fármaco portador, los liposomas también presentan limitaciones, a saber, su baja estabilidad, baja solubilidad, vida media de circulación corta, susceptibilidad a la oxidación e hidrólisis de lípidos, fugas y fusión, reproducibilidad, dificultades en ampliación, altos costos de producción y problemas de esterilización [62,78].

La estabilidad es la principal preocupación en todos los pasos de la producción, el almacenamiento y la administración de liposomas, e incluye el examen de: (i) la estabilidad química de los lípidos (ii) el mantenimiento del tamaño y la estructura de la vesícula (iii) la retención del contenido atrapado y (iv) la influencia de los fluidos biológicos sobre las propiedades de integridad y permeabilidad de los liposomas [66]. La estabilidad química y física son parámetros importantes que afectan el rendimiento biológico de los liposomas [12]. La estabilidad física de los liposomas está relacionada principalmente con una posible agregación / aglomeración, fusión y su contenido de fuga al entorno circundante [31]. Los liposomas almacenados en condiciones estériles, en solución salina tamponada con fosfato bajo nitrógeno, pueden retener su agente bioactivo atrapado durante períodos prolongados de tiempo [66]. La retención relativa de un agente bioactivo depende del tipo de liposoma (es decir, MLV & gt vesícula de evaporación en fase inversa & gt SUV), la temperatura (es decir, 4 ° C & gt 25 ° C & gt 35 ° C) y la composición lipídica (es decir, fosfolípidos saturados y gt fosfolípidos saturados con colesterol equimolar y gt fosfolípidos insaturados con colesterol equimolar y gt fosfolípidos insaturados) [66]. Los lípidos pueden sufrir una autooxidación, que suele ser inducida por la luz, los iones metálicos o la temperatura. Además, la hidrólisis de los fosfolípidos a ácidos grasos y 1- y 2-acil-lisofosfolípidos conduce a la producción de compuestos de fósforo de glicerol y provoca la degradación química de los liposomas durante el almacenamiento [79]. Los antioxidantes, los agentes complejantes (por ejemplo, EDTA) y la atmósfera inerte (por ejemplo, nitrógeno) se utilizan comúnmente para evitar la hidrólisis de los fosfolípidos. Otras formas de superar los problemas relacionados con la descomposición química de los liposomas es su almacenamiento en estado seco (es decir, liofilizado), utilizando un crioprotector. Por ejemplo, la adición de trehalosa, que reemplaza el agua durante la liofilización, es eficaz para prevenir el daño por fusión y deshidratación en las vesículas de fosfolípidos [80].

Inicialmente, se asumió que, dado que los liposomas estaban hechos principalmente de lípidos naturales como el PC, evitarían el aclaramiento del sistema de fagocitos mononucleares y no serían reconocidos como un antígeno. Sin embargo, se advirtió que los liposomas se acumularían en órganos como el hígado y el bazo, y los macrófagos (sistema inmunológico) los eliminarían, y el aclaramiento estaba relacionado con la composición y el tamaño de los liposomas [31]. Por lo tanto, esto podría ser una ventaja cuando esos órganos o poblaciones de células son el objetivo previsto [36]. Sin embargo, cuando el objetivo son otros órganos y poblaciones de células, esto representa un obstáculo principal. Desde este descubrimiento, el objetivo ha sido diseñar nuevas formulaciones de liposomas para evitar el sistema inmunológico. Por lo tanto, las condiciones fisiológicas del cuerpo deben tenerse en cuenta al diseñar una formulación de liposomas para una célula u órgano diana específico cuando los liposomas se inyectan por vía intravenosa [29].

Actualmente, existen numerosos métodos disponibles para la producción a escala de laboratorio (§2.4), pero solo se encuentran disponibles unas pocas técnicas de fabricación a gran escala [62]. La fabricación de liposomas implica numerosas operaciones unitarias que no son fáciles de escalar a niveles de producción comercial [78]. Por lo tanto, todas las técnicas de fabricación a gran escala tienen serias limitaciones en términos de atrapamiento de moléculas sensibles, exposición a estrés mecánico y / o químico, temperatura y condiciones de esterilización. En [62] se puede encontrar una revisión detallada de la tecnología de los liposomas dirigida a la producción a escala industrial. Actualmente, no existe un consenso establecido con respecto a los métodos de fabricación de liposomas. Los sistemas de extracción por solventes requieren una inversión significativa y son muy costosos de operar y mantener. El método más utilizado para lograr la esterilidad de los productos farmacéuticos es la filtración estéril mediante una membrana de policarbonato [78]. Sin embargo, este método tiene desventajas, por ejemplo, debe realizarse en condiciones asépticas, es relativamente caro ya que funciona a alta presión, requiere mucho tiempo y no es eficaz para eliminar virus [78].

3. Entrega de agentes bioactivos

3.1. Carga de liposomas con agentes bioactivos

Las principales ventajas de los liposomas como sistema de administración de agentes bioactivos son: (i) tienen una estructura versátil que se puede adaptar para cada aplicación (ii) pueden acomodar cualquier tipo de agentes bioactivos ya sea en su compartimento interno (es decir, moléculas hidrófilas) o dentro de la bicapa lipídica (es decir, moléculas lipofílicas) o ambas (moléculas anfifílicas) (iii) sus propiedades a nanoescala determinan la solubilidad, difusividad, biodistribución y destino biológico (iv) son mínimamente tóxicas, no inmunogénicas y completamente biodegradables (v) son flexibles para enlazarse con ligandos específicos del sitio para lograr un direccionamiento activo y (vi) aumentan la eficacia y el índice terapéutico de los agentes bioactivos [12,37]. Por lo tanto, la retención de agentes bioactivos dentro de los liposomas es especialmente importante, no solo durante el almacenamiento sino también durante en vivo administración [17].

El ensamblaje de fosfolípidos en una estructura de bicapa hidratada se acopla con el atrapamiento de una porción del medio acuoso dentro de la bicapa cerrada continua. Por tanto, puede parecer que la encapsulación de agentes bioactivos en liposomas debería ser un proceso trivial. Sin embargo, existen algunas limitaciones para la encapsulación de moléculas en liposomas, como el tipo de agente bioactivo (es decir, el peso molecular y las propiedades químicas), el liposoma (es decir, el tamaño y la composición de lípidos) y el método de fabricación. La selección de agentes bioactivos con características físicas que los hagan susceptibles de retención en los liposomas es otro enfoque para controlar la velocidad de carga y liberación [17]. Hay dos formas de encapsular agentes bioactivos en liposomas: pasivamente, cuando el agente bioactivo se encapsula durante la formación del liposoma o activamente, cuando el agente bioactivo se encapsula después de la formación del liposoma [37]. La ventaja de la encapsulación activa es que la carga del agente bioactivo se puede realizar independientemente del momento y el lugar de producción de liposomas [3, 17]. Sin embargo, solo pueden aplicarse a un pequeño número de agentes bioactivos con propiedades físico-químicas específicas [12].

Carga útil (PL) y EE son los términos utilizados para determinar la cantidad de agente bioactivo incorporado en los liposomas. PL es la relación agente bioactivo-lípido (mol mol -1) y EE es el PL en la formulación de liposomas final en comparación con el PL inicial utilizado para la preparación de liposomas. A veces, el EE se usa para indicar el porcentaje de agente bioactivo encapsulado en relación con la cantidad de agente bioactivo ofrecida para encapsular durante la preparación de liposomas, pero la cantidad de lípido no se cuantifica. Este método de cuantificación es engañoso, ya que depende en gran medida de la cantidad inicial de agente bioactivo ofrecida a una cantidad específica de lípidos [12] (figura 10).

Figura 10. Representación de la encapsulación de fármacos hidrófilos y lipófilos en el liposoma. El fármaco hidrófilo se encapsula en el núcleo interno del liposoma. El fármaco lipófilo se encapsula en la bicapa lipídica. El col y el fármaco lipófilo compiten por el mismo espacio en la bicapa lipídica. (Versión online en color).

3.1.1. Agentes bioactivos hidrofílicos

Estos se disuelven en la fase acuosa externa, durante la preparación de los liposomas, y quedan atrapados dentro del compartimiento interno del liposoma después de la evaporación del solvente [81]. La hidratación de película delgada es el método más simple para la encapsulación de agentes bioactivos hidrófilos. La encapsulación se vuelve más difícil e ineficaz a medida que aumenta el tamaño del agente bioactivo, p. plásmidos grandes [36]. Además, las proporciones de EE y de agente bioactivo a lípido (es decir, PL) logradas mediante la hidratación de película delgada son bajas [36]. El porcentaje de encapsulación del agente bioactivo hidrófilo depende del tamaño de los liposomas: MLV & gt LUV & gt SUVs [82]. Además, la carga del liposoma afecta el atrapamiento del agente bioactivo hidrófilo: liposomas neutros & gt cargados positivamente & gt cargados negativamente [83]. La preparación de liposomas utilizando fosfolípidos insaturados (por ejemplo, DOPC) demostró un EE más alto que los liposomas que utilizan fosfolípidos saturados (por ejemplo, DPPC) [84]. El EE era más dependiente del número de enlaces insaturados que de la longitud de la cadena de alquilo de la molécula de fosfolípido [84].

Para mejorar el EE de los agentes bioactivos hidrófilos, es necesario utilizar diferentes métodos de preparación de liposomas, como la evaporación en fase inversa, la deshidratación-rehidratación de liposomas vacíos y el ciclo de congelación-descongelación [36]. Existen otras estrategias para aumentar el EE de los agentes bioactivos hidrófilos en liposomas: cambiando el pH y los iones y creando gradientes de sulfato de amonio (también llamado carga activa) [3,17,85]. El desarrollo de estas estrategias para mejorar la encapsulación y retención de agentes bioactivos en los liposomas se basa en estudios experimentales destinados a comprender los factores moleculares que gobiernan las propiedades de barrera [85]. Por ejemplo, los agentes bioactivos que son base / ácido débiles pueden difundirse a través de la membrana lipídica y acumularse en el compartimento interno del liposoma [85,86]. El método de gradiente de sulfato de amonio difiere de la mayoría de los otros métodos químicos, ya que no requiere liposomas con un interior ácido o una fase extraliposómica alcalina [86]. Este enfoque se ha utilizado para encapsular agentes bioactivos dentro de los liposomas con alta eficiencia (más del 90%) [86]. Además, para resolver el problema de la estabilización de los agentes bioactivos, se puede incrementar la rigidez de la membrana del liposoma, mientras que al mismo tiempo se disminuye su tendencia a la agregación seleccionando adecuadamente los componentes lipídicos del liposoma [12]. El uso de una fina capa polimérica hecha de quitosano o alginato puede ser una estrategia para aumentar la estabilidad de los agentes bioactivos en los liposomas [87-89]. Sin embargo, los revestimientos poliméricos pueden aumentar el tamaño de los liposomas y también pueden interactuar con la bicapa de fosfolípidos. Otra estrategia es reticular covalentemente bicapas inter-lipídicas. Por ejemplo, las MLV reticuladas pueden reducir la toxicidad sistémica y mejorar la eficacia terapéutica [90].

3.1.2. Agentes bioactivos lipofílicos

Para maximizar la asociación de agentes bioactivos lipofílicos con liposomas, la práctica más común es mezclar los lípidos con el agente bioactivo lipofílico y evaporar el solvente para formar una película delgada de lípidos. Esta mezcla se rehidrata en el tampón y el agente bioactivo asociado a liposomas se separa del agente bioactivo libre [66]. La interacción de dichos agentes bioactivos dentro de la bicapa lipídica depende de la cantidad y estructura del agente bioactivo lipófilo, lo que produce alteraciones en las propiedades de la vesícula como la permeabilidad, el tamaño y la estabilidad de la bicapa [91]. La encapsulación de agentes bioactivos lipofílicos disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena lipídica y puede desestabilizar los liposomas [92]. Por el contrario, la adición de Chol aumenta la rigidez y la estabilidad de las membranas de los liposomas, como se mencionó en la sección "Propiedades de los liposomas". Sin embargo, si el agente bioactivo es lipofílico, podría desplazarse añadiendo Chol en la bicapa lipídica. Por tanto, la presencia de Chol disminuye la encapsulación de agentes bioactivos lipofílicos [91,92]. Se ha propuesto un sistema para mejorar la EE de agentes bioactivos lipofílicos [93]. Consiste en combinar liposomas y complejos ciclodextrina-agente bioactivo formando agente bioactivo en ciclodextrinas en liposomas [93]. Las ciclodextrinas son hidrofóbicas por dentro y hidrofílicas por fuera, formadores de cavidades, oligosacáridos solubles en agua que pueden acomodar agentes bioactivos insolubles en agua en sus cavidades, aumentando su solubilidad en agua. Por lo tanto, el complejo de ciclodextrina-agente bioactivo soluble en agua puede encapsularse dentro de los compartimentos acuosos de los liposomas. Se logró un EE de 32,3 ± 11,9% para la dehidroepiandrosterona y 31,9 ± 11,8% para la hidroxipropil-β-ciclodextrina utilizando este método [12,93].

3.2. Liberación de agentes bioactivos de los liposomas.

Otro tema crítico al diseñar liposomas como portadores de agentes bioactivos es el control de la liberación de los agentes bioactivos, que puede dictar su seguridad y eficacia terapéuticas.La cinética de liberación se ve afectada por la naturaleza del agente bioactivo, la composición de liposomas, el método de encapsulación (es decir, pasivo o activo) y la aplicación pretendida [12,94]. Para comprender la liberación de agentes bioactivos de los liposomas, debemos comprender la estructura del liposoma y las posibles interacciones entre el agente bioactivo, la bicapa lipídica y el entorno circundante. Por ejemplo, la encapsulación de dexametasona (Dex) es mayor en los liposomas DSPC que en los liposomas PC, y Dex se desplaza de los liposomas a medida que aumenta el contenido de Chol de las membranas de los liposomas [55,91]. Además, un estudio de liberación cinética realizado en tampón o medio de suero mostró que la liberación de Dex fue provocada por la dilución de liposomas [91]. En otro estudio, el perfil de liberación de Dex de los liposomas recubiertos con DSPE-PEG se realizó en solución salina tamponada con fosfato utilizando tubos de diálisis durante 21 días [55]. El perfil de liberación de Dex mostró una liberación de ráfaga inicial dentro de las 12 h. Después de la liberación inicial, se observó una liberación más lenta hasta el día 6. Posteriormente, Dex continuó liberándose a un ritmo más lento pero constante hasta el día 21 [55].

Los agentes bioactivos (es decir, moléculas o iones) encapsulados en los liposomas tienden a moverse espontáneamente al entorno exterior de la bicapa lipídica. El movimiento de moléculas e iones que resulta de su energía cinética se conoce como difusión [14]. Por lo tanto, el agente bioactivo tiende a moverse de una región de alta concentración a una región de baja concentración. Este proceso depende del tipo de agente bioactivo y de la composición lipídica [15,36,39]. Por ejemplo, cuando la concentración inicial de Ca 2+ es alta en el interior del liposoma, pero baja en el exterior, se calienta a TC da como resultado la difusión inmediata del Ca 2+ en el medio [15,39]. Por lo tanto, los fosfolípidos con alto TC puede reducir la difusión de iones y moléculas de bajo peso molecular. Se investigó la influencia de la composición liposomal sobre la liberación de ibuprofeno [95]. El lípido de cadena de alquilo larga mejoró el ibuprofeno EE y la retención a 37 ° C: dilignoceroilfosfatidilcolina (C24PC) y gt DSPC y gt DMPC y gt PC. Después de 30 min de incubación, los liposomas de PC liberaron el 15,5% de la carga de ibuprofeno en comparación con el 1,5% de C24Los liposomas de PC y las principales diferencias en la liberación fueron evidentes después de 24 h de incubación [95]. A 37 ° C, tanto PC (TC & lt 0 ° C) y DMPC (TC = 23 ° C) los liposomas estaban en estado fluido, lo que resultó en una cantidad creciente de fármaco liberado en comparación con los lípidos de temperatura de transición más alta DSPC (TC = 55 ° C) y C24PC (TC = 80 ° C). Por lo tanto, C24Los liposomas de PC liberaron menos ibuprofeno que los liposomas de DSPC a pesar de que ambos sistemas se encontraban en la fase de gel ordenada. Este comportamiento puede explicarse por el aumento de las interacciones de van der Waals entre las cadenas lipídicas más largas y el aumento del área de la fase lipídica dentro de los liposomas, lo que mejora la unión al fármaco y la estabilidad de la bicapa [95]. Además, la inclusión de lípidos cargados en las formulaciones de liposomas puede influir en la liberación de agentes bioactivos. La adición de 2 moles del lípido aniónico dicetilfosfato (DCP) redujo el EE y aumentó la liberación de ibuprofeno (69,0 ± 3,7%), y esto se explicó por las fuerzas repulsivas electrostáticas entre el grupo carboxilo del ibuprofeno y el grupo de cabeza aniónico del DCP. [95]. La adición de 2 mol del lípido estearilamina catiónico (SA) a la formulación de liposomas (PC: Chol — 16 mol: 4 mol) aumentó el EE en aproximadamente un 8–47% y también aumentó la liberación de ibuprofeno (71,2 ± 2,8%) en comparación con PC: Chol [95]. Los autores sugirieron que la atracción electrostática entre el grupo de cabeza con carga positiva en SA y el grupo carboxilo presente en el ibuprofeno disociado parece tener poco efecto sobre la asociación del ibuprofeno con MLV. Además, la adición de SA a la formulación de liposomas también dio como resultado una inversión de la carga superficial (debido al grupo de cabeza catiónico de SA) y un aumento en el tamaño de la vesícula de aproximadamente 0,8 µm en comparación con la formulación de PC: Chol sin modificar. Esta podría ser la razón del aumento en la liberación de la droga. Estos resultados indican que la presencia de lípidos cargados (aniónicos o catiónicos) dentro de la bicapa de liposomas aumenta la permeabilidad de la bicapa de lípidos y la unión entre lípidos y fármacos.

Un tratamiento exitoso usando liposomas cargados con agentes bioactivos depende también de la vía de administración (por ejemplo, subcutánea, oral e intravenosa). Los liposomas convencionales, administrados por vía subcutánea, tienen como objetivo el sistema linfático para la obtención de imágenes, la distribución de agentes terapéuticos o la vacunación [12]. Además, se pueden desarrollar liposomas convencionales para eludir el sistema reticular endoplásmico o para enmascarar los efectos secundarios tóxicos de los agentes bioactivos [12]. Los liposomas administrados por vía intravenosa enfrentan barreras como el revestimiento endotelial de la vasculatura y la barrera hematoencefálica. En esas situaciones particulares, es importante mantener el agente bioactivo en los liposomas hasta que alcancen el sitio objetivo [36]. Si el agente bioactivo se escapa del liposoma a un ritmo rápido, se perderá antes de llegar al sitio de acción y no se obtendrá ningún beneficio terapéutico. Por otro lado, si el agente bioactivo se escapa lentamente de los liposomas, podrá alcanzar el sitio de acción, pero los niveles de agente bioactivo liberado nunca alcanzarán las concentraciones terapéuticas deseadas [36]. La baja integridad de los liposomas, después en vivo La administración y en contacto con los componentes sanguíneos, puede resultar en la eliminación de algunas moléculas de lípidos y la consiguiente apertura de poros en la bicapa de liposomas, a través de la cual el agente bioactivo cargado puede filtrarse. Además, la inestabilidad física de los liposomas que da como resultado la agregación y la fusión puede liberar el agente bioactivo de los liposomas [36]. Por ejemplo, los liposomas neutros tienden a agregarse y aumentar el tamaño de los liposomas [96].

La interacción de los liposomas con las células es un aspecto crítico de la eficacia de los agentes bioactivos. En algunas aplicaciones clínicas, el agente bioactivo debe liberarse dentro de las células (por ejemplo, células tumorales) para tener un efecto terapéutico beneficioso. In vitro y en vivo Los estudios han demostrado que las principales interacciones de los liposomas con las células son la adsorción simple (mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular, fuerzas electrostáticas o fuerzas hidrófobas débiles no específicas) o después de la endocitosis [37]. Se han descrito muchos intentos de activar la liberación de agentes bioactivos de los liposomas en las proximidades o en el interior de las células [17,97]. La liberación activa se basa en el desarrollo de mecanismos para aumentar la permeabilidad o desestabilizar la bicapa del liposoma una vez que llega al sitio objetivo. Actualmente se están investigando una variedad de estímulos como pH [46,98], temperatura [39,99], ondas ultrasónicas [100], campos magnéticos [101,102] y luz [103,104] para mejorar la liberación de agentes bioactivos. Aunque el concepto de liberación desencadenada es muy prometedor, se deben realizar más estudios para probar su aplicación en humanos [17].

4. Aplicaciones de los liposomas en la ingeniería de tejidos

En los organismos vivos, los lípidos se consideran bloques de construcción básicos, porque están formados por un grupo de cabeza polar, una o más regiones de la cola hidrófobas y una estructura de columna vertebral que conecta los dos [15]. Por tanto, los investigadores han estado aprovechando las características y versatilidad de los lípidos para encontrar nuevas aplicaciones [12,15]. Los liposomas y las micelas son las nanopartículas basadas en lípidos más utilizadas [105]. Pueden obtenerse otras estructuras lipídicas, como estructuras en fase cúbica, hexagonal o esponjosa [106]. Ofrecen la ventaja de la estabilidad y podrían usarse como nuevos biomateriales que imitan membranas biológicas. Se cree que los materiales basados ​​en fosfolípidos pueden utilizarse cada vez más como herramientas para la manipulación de las respuestas de células y tejidos a los biomateriales, es decir, para la liberación controlada de agentes bioactivos y para la cirugía reconstructiva [15].

Hoy en día, las aplicaciones más utilizadas clínicamente de la terapia basada en liposomas se encuentran en el tratamiento del cáncer y de las infecciones fúngicas sistémicas [36]. Sin embargo, el futuro de los liposomas no se limita a esas aplicaciones terapéuticas. Los liposomas, al ser una plataforma muy flexible, se han utilizado en diferentes áreas de investigación, incluida la producción de vacunas, imágenes, cosméticos y TE [27,36]. A continuación, nos centraremos en los lípidos como biomaterial y revisaremos algunas aplicaciones de los liposomas, principalmente en TE y medicina regenerativa. Se espera que las nanopartículas terapéuticas, como los liposomas, ofrezcan el potencial de mejorar drásticamente la eficacia y el perfil de efectos secundarios de agentes bioactivos nuevos y existentes [77]. Además, muchos andamios de ingeniería de tejidos ya han sido aprobados para uso humano [27]. Por lo tanto, la combinación de liposomas con armazones tiene el potencial de traducción clínica en un futuro próximo.

4.1. Combinando liposomas con andamios

El campo de los biomateriales ha ido avanzando hacia el diseño a nanoescala de sistemas bioactivos de liberación de fármacos o andamiaje, orientados a estrategias de TE y medicina regenerativa [107]. La combinación de nanopartículas cargadas de fármaco con andamios se puede utilizar para controlar espacial y temporalmente la liberación de agentes bioactivos, lo que conduce a una liberación local y sostenida [108]. En los últimos años, ha habido un número creciente de estudios con el objetivo de dirigir el destino de las células madre a través de la entrega de factores de crecimiento / diferenciación, ADN o ARN de interferencia (ARNi). La encapsulación de los agentes bioactivos en nanopartículas como los liposomas tiene muchas ventajas, como se describe en la sección "Carga de los liposomas con agentes bioactivos". Sin embargo, el uso único de liposomas está limitado debido a la ausencia de un soporte mecánico tridimensional que se requiere con frecuencia para promover la regeneración tisular [107].

Se pueden fabricar muchos tipos de andamios de polímeros naturales y / o sintéticos, utilizando diferentes técnicas de procesamiento. Para un análisis extenso del tema, se remite al lector a las revisiones del andamiaje TE en [109-112]. Los andamios de TE pueden diseñarse para controlar física y químicamente el patrón de liberación de cualquier agente bioactivo incorporado [27]. En particular, los hidrogeles son un conjunto de andamios que presentan un enorme potencial para su aplicación como biomateriales inteligentes y sensibles a los estímulos [113]. La entrega de agentes bioactivos desde los andamios para promover la regeneración a menudo es un desafío debido a los complejos procesos de fabricación. Por ejemplo, los agentes bioactivos pueden incorporarse en la matriz o encapsularse en nanofibras huecas [114]. Cuando el agente bioactivo se incorpora a la matriz, se produce una fuerte explosión en las primeras horas [115]. Por lo tanto, cuando el agente bioactivo se encapsula en nanofibras huecas, existe un mejor control del perfil de liberación del agente bioactivo, pero algunas de las complicaciones durante la preparación de nanofibras no permiten una fácil producción a gran escala [116].

La combinación de liposomas con andamios ya se ha revisado en otro lugar [15,27,108,117]. Todas estas estrategias aspiran a combinar las propiedades ventajosas de los liposomas y las matrices poliméricas, con el objetivo de desarrollar materiales que puedan secuestrar y mantener los liposomas en un sitio de tejido local. Los liposomas sensibles a estímulos también se han utilizado como dispositivos para controlar reacciones químicas, que dan como resultado la formación rápida de un biomaterial como el en el lugar formación de minerales, polímeros o biomateriales compuestos de minerales / polímeros [15,118-121]. Esto aprovecha la liberación de sustancias atrapadas de los liposomas a temperaturas cercanas al lípido. TC (es decir, aproximadamente 37 ° C) (consulte la figura 7, consulte también la sección "Propiedades de los liposomas") [39]. La estructura del liposoma es muy sensible a los disolventes orgánicos, la temperatura y el pH. Por lo tanto, se han propuesto muchas formas de inmovilizar los liposomas en la superficie del andamio [27,122-125]. Hay dos formas de inmovilizar liposomas en la superficie de los andamios: (i) inmovilización no específica, lo que significa que los liposomas se adsorben en la superficie del andamio y se eliminan fácilmente durante el cultivo celular en cada intercambio de medio (ii) inmovilización específica, lo que significa que los liposomas se unen covalentemente en la superficie del armazón, aumentando su estabilidad. Se utilizó un sistema de andamio que utiliza interacciones naturales entre los liposomas y el fibrinógeno para evitar la necesidad de conjugación química [126]. Para facilitar la adsorción de los liposomas, las superficies del andamio se recubrieron con varias proteínas de la matriz extracelular, que fueron capaces de transfectar un mayor número de células y, al mismo tiempo, reducir la cantidad de ADN necesaria [127]. Recientemente, se informó de una modificación química de las mallas de nanofibras (NFM) de policaprolactona electrohilada (PCL) que permite la inmovilización de liposomas con carga bioactiva en sus superficies [124, 125]. Para lograr esto, se utilizó irradiación inicial de ozono UV para generar radicales libres reactivos que fueron inmediatamente sometidos a aminólisis. Estas superficies modificadas se hicieron reaccionar con 2IT para generar grupos colgantes de sulfuro (SH). Los liposomas cargados con RUNX2 que codifican dexametasona y pDNA se unieron covalentemente a los grupos SH presentes en la superficie de los NFM electrohilados [124, 125]. La disponibilidad del vehículo de liberación de fármaco en la superficie de los NFM (donde se produce el contacto celular inicial) permite una liberación sostenible de Dex en las proximidades de las células en cultivo y, en consecuencia, aumenta su eficacia y biodisponibilidad [125]. Se concluyó que la cantidad de liposomas inmovilizados está específicamente controlada por la cantidad de grupos SH disponibles en la superficie de las nanofibras [124, 125]. Otra estrategia para combinar liposomas y nanofibras es utilizar electrohilado coaxial. Esta técnica permite la incorporación de liposomas en nanofibras [128]. La Tabla 3 muestra las aplicaciones de liposomas combinados con andamios para enfoques TE.

Tabla 3. Ejemplos de estrategias basadas en lípidos / liposomas para la liberación de agentes bioactivos en TE y enfoques de medicina regenerativa. Transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT), células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBMSC), luciferasa (Luc), proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), que codifica la β-galactosidasa (βGal), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , proteína morfogenética ósea humana 2 (hBMP-2), sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), proteína 1 relacionada con Dickkopf (DKK1), factor de crecimiento transformante β1 (TGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), doxorrubicina (DOX) ), lisozima de proteína modelo (LYZ), hidroxiapatita (HA), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), matriz activada por genes (GAM).

La regeneración tisular depende no solo del agente bioactivo en sí, como los factores de crecimiento (FG), sino también de los diversos parámetros asociados con su presentación, incluida la concentración, los gradientes espacio-temporales, la combinación con otros FG y el tipo de célula diana [151-154 ]. Los liposomas cargados con agentes bioactivos combinados con armazones ofrecen varios beneficios intrínsecos tales como: (i) concentración eficaz (ii) gradientes de concentración estables (iii) administración de agentes bioactivos múltiples y (iv) patrones espaciales [27]. El agente bioactivo suministrado por el dispositivo de andamio de liposomas puede ser de dos tipos: (i) factor de crecimiento / diferenciación, mediante la incorporación de los liposomas cargados con el agente bioactivo adecuado en el andamio y (ii) suministro de ácido nucleico, mediante la incorporación de el ADN (o ARNi) en liposomas que codifica (o silencia) una proteína específica o por suministro celular, en el que las células actúan como 'fábricas de GF'. Estos tipos de sistemas de liberación de agentes bioactivos locales se analizarán en §4.2.

4.2. Entrega de factores de crecimiento / diferenciación

El proceso de regeneración de tejidos implica complejas cascadas de agentes bioactivos como GF, citoquinas y otras moléculas. Los GF son polipéptidos endógenos que actúan a través de los receptores de la superficie celular para regular actividades celulares como la proliferación, migración y diferenciación [155]. El resultado de la terapéutica GF depende principalmente de su modo de administración debido a su rápida eliminación. en vivo [156]. Además, uno de los principales desafíos en TE es encontrar la mejor manera de inducir la correcta diferenciación de las células madre. Hasta ahora, el enfoque más común se basa en el uso de combinaciones de factores de crecimiento / diferenciación complementados en el medio de cultivo. Por ejemplo, la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) se agrega para inducir la diferenciación osteogénica, mientras que el factor de crecimiento transformante β (TGF-β) se utiliza para promover la diferenciación condrogénica. Los sistemas de liberación controlada deben proporcionar una combinación adecuada de moléculas de señalización para promover el resultado regenerativo deseado [112,157-159]. Por lo tanto, los liposomas pueden usarse como portadores para la entrega controlada espacio-temporal de GF, mejorando la proliferación y diferenciación de células madre. in vitro [160,161].

Los liposomas se utilizaron con cierto éxito en un modelo animal para la reparación del cartílago [143]. Fueron utilizados como sistemas de liberación de TGF-β1 durante un período de algunas semanas, evitando los efectos secundarios típicos de la administración sistémica, debido a su inyección directa en la cavidad articular. Además, la conjugación de liposomas cargados con TGF-β1 con un andamio mejoró su cinética de liberación y eficacia local [143]. Los liposomas recubiertos con bisfosfonato mostraron una fuerte unión a un armazón compuesto de colágeno / hidroxiapatita (HA), aumentando su retención en los armazones de colágeno / HA después de su implantación subcutánea en ratas [122]. Los liposomas recubiertos de bisfosfonato pudieron atrapar BMP-2 y administrarlo localmente [122]. La inmovilización de liposomas cargados de suero fetal bovino en un armazón fibroso de poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) mejoró significativamente la adhesión y la proliferación de condrocitos [123]. El objetivo de este estudio fue investigar la interacción entre los liposomas y los andamios de fibra y desarrollar un nuevo sistema de administración de fármacos. El perfil de liberación de Dex mostró una liberación de ráfaga inicial, aunque Dex continuó siendo liberada a un ritmo más lento pero constante hasta el día 21 [55]. Este período de tiempo se seleccionó de acuerdo con el tiempo de cultivo que generalmente se requiere para obtener una diferenciación osteogénica completa de las células madre mesenquimales (MSC). in vitro. Los liposomas cargados con Dex no tuvieron ningún efecto citotóxico sobre las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBMSC). Fueron capaces de promover una inducción más temprana de la diferenciación de hBMSC en el linaje osteogénico [55]. Los ensayos biológicos mostraron que los liposomas cargados con Dex inmovilizados en la superficie de los NFM PCL electrohilados no exhibían ningún efecto citotóxico, pudiendo promover con éxito la diferenciación osteogénica de las hBMSC [125].

4.3. Entrega de genes terapéuticos

El uso de factores de crecimiento / diferenciación para inducir la diferenciación de células madre en vivo tiene algunas limitaciones como semividas cortas, desnaturalización durante los procesos de encapsulación, largos períodos de tiempo para obtener las células diferenciadas, uso de cócteles de GF y dificultad para diferenciar las células en un linaje específico [108,162]. Por lo tanto, la terapia génica, la codificación de factores de transcripción o la codificación de una proteína específica o un conjunto de proteínas puede ser un buen enfoque para superar estas limitaciones y controlar la diferenciación de células madre [124]. Los factores de transcripción asegurarían que la expresión de todas las variantes de corte y empalme naturales ocurra en un tiempo y secuencia coordinados, y puede regular una cascada de múltiples genes diferentes. La terapia génica se concibió inicialmente como la inserción de un gen funcional en el genoma de la célula huésped para reemplazar un defecto genético hereditario o, más recientemente, para proporcionar una nueva función en una célula, como sobreexpresar GF o incluso matar células cancerosas [36,148]. Cuando el pDNA entra en el núcleo, se intercala en el DNA de la célula huésped y, luego, se transcribe en RNA mensajero (mRNA). Por lo tanto, las proteínas terapéuticas o GF se producen utilizando la maquinaria celular fuera del núcleo.

Otra forma de controlar la diferenciación de células madre se basa en la entrega de ARNi, como se mencionó anteriormente [162]. El ARNi actúa uniéndose a los ácidos nucleicos, inhibiendo la transcripción y traducción de genes, en otras palabras, el ARNi actúa silenciando los genes de interés mediante la erradicación de los ARNm diana mediante la introducción de pequeños ARN interferentes (siRNA), pequeños ARN en horquilla (shRNA) o micro- ARN (miARN) [25,108,162]. La principal ventaja de esta estrategia es que el ARNi induce el silenciamiento de genes diana sin integración en el genoma del hospedador. Por lo tanto, este campo ha crecido considerablemente en las últimas décadas, debido a su enorme potencial para tratar enfermedades reemplazando genes defectuosos o faltantes o silenciando la expresión génica no deseada [163]. Se ha logrado un progreso notable mediante la administración de miARN para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes (iPSC), obviando así la necesidad de introducir ADNp en las células del donante [164].

La entrega de genes puede realizarse mediante un ex vivo acercarse o directamente a una célula o tejido diana. los ex vivo El método generalmente utiliza células autólogas que se recuperan del cuerpo del paciente. Las células se transducen generalmente con vectores virales, que contienen genes recombinantes, y se vuelven a insertar / trasplantar en el tejido diana [148]. Asimismo, el pDNA o RNAi es escasamente captado por las células hospedadoras, y se somete a degradación cuando se expone a proteínas sanguíneas [165]. Los vectores virales y no virales son ejemplos de portadores utilizados para transfectar células [166-168]. El método ampliamente utilizado para transferir genes a células madre se realiza a través de vectores virales (es decir, lentivirus y retrovirus), debido a su mayor expresión transgénica y eficiencia de transducción. Por tanto, cuando se utilizan células madre para corregir una patología genética y para expresar el gen terapéutico durante la vida de un paciente, se prefieren los vectores virales [169]. Por el contrario, cuando se utilizan células madre para tratar enfermedades no hereditarias y sólo se requiere que expresen el gen terapéutico durante un breve período de tiempo, se prefieren los vectores no virales [169]. Aunque los vectores virales son más eficientes, poseen algunas limitaciones, como un alto coste de producción, problemas de seguridad, incluida la mutagénesis, la inmunogenicidad de las proteínas del virus, la falta de la selectividad tisular deseada y la generación de virus infecciosos debido a la recombinación [170-172]. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de entrega que no solo proteja el pDNA / RNAi y facilite su captación celular, sino que además mejore el potencial para una entrega dirigida y eficaz [165,169]. Los sistemas de administración no virales (es decir, liposomas, lípidos catiónicos, polímeros y proteínas) tienen una eficacia de transfección comparativamente menor, pero se han propuesto debido a su seguridad, fácil producción y encapsulación de mayor tamaño de pDNA [27,108,162,172-174]. Además, los vectores no virales proporcionan flexibilidad en el diseño de la formulación que se puede adaptar para interactuar con la carga de ADN. Además, mediante la incorporación de ligandos dirigidos, es posible especificar la ruta de administración del vector y mejorar la administración a tejidos o células específicos.

Los liposomas se consideran el primer sistema de administración no viral utilizado en biología celular [27]. Los lípidos catiónicos han surgido como la opción principal para la administración de genes [77,175]. Se sintetizaron y evaluaron varios lípidos catiónicos para la transfección de células [175]. Estos liposomas catiónicos muestran una alta eficacia de transfección, que puede atribuirse en parte a sus interacciones con las membranas celulares cargadas negativamente [27]. La lipofectamina, un reactivo comercial líder, es una formulación de liposomas catiónicos comúnmente utilizada para transfectar células [176]. Sin embargo, su éxito en vivo como estrategia de terapia génica se ha visto limitada debido a la falta de estabilidad coloidal, la corta duración de la expresión génica y la citotoxicidad [175,177,178]. Los polímeros catiónicos también se han propuesto como sistemas de suministro de genes no virales, debido a sus propiedades flexibles, fácil síntesis, robustez y eficacia probada en el suministro de genes. Para obtener más detalles sobre los avances científicos más recientes en polímeros catiónicos y sus derivados, no solo con fines de suministro de genes, sino también para diversas aplicaciones terapéuticas alternativas, se remite al lector a la revisión en [179]. El uso de liposomas combinados con andamios puede contribuir a superar los problemas de toxicidad, expresión a largo plazo y eficacia de silenciamiento. Específicamente, la administración tópica de liposomas cargados con genes a través de un andamio de biomaterial puede reducir su exposición a las células inmunes, mejorar la captación celular y posiblemente permitir una administración sostenida [27,162].

Los sistemas de andamio de liposomas pueden usarse como biomaterial para entregar genes de una manera eficiente, controlada por células y localizada espacialmente para aplicaciones de TE. La regeneración de huesos y cartílagos con una estrategia de terapia génica es una de las aplicaciones clínicamente relevantes [108]. Esas estrategias se han centrado en la entrega de genes que codifican BMP y TGF-β que inician la diferenciación de las células progenitoras del cartílago y el hueso, y coordinan las vías de la osificación ósea recién formada y la maduración del cartílago [133,137,148,180]. La vascularización tisular se aprovechó mediante la entrega de genes que codifican VEGF utilizando células del estroma de la médula ósea [181]. Se inyectaron liposomas cargados con ADN que codifica la forma de 165 aminoácidos de VEGF en piel de rata para estimular la cicatrización de heridas [182]. La supervivencia del colgajo se incrementó en un 14% y el análisis histológico mostró la formación de nuevos vasos [182]. Se construyó un vector de expresión de plásmido que contenía VEGF para ser administrado al lecho de la herida de colgajos de piel abdominal de rata en un sellador de fibrina [145]. La administración tópica mediada por fibrina de un plásmido VEGF-A aumentó la supervivencia del colgajo en 7 días. Los liposomas cargados con RUNX2 que codifican pDNA se inmovilizaron covalentemente en la superficie de las nanofibras de PCL [124]. El resultado biológico utilizando hBMSC mostró que las hBMSC cultivadas en liposomas cargados con RUNX2 inmovilizados en la superficie de PCL NFM electrohilado mostraron niveles mejorados de actividad metabólica y síntesis de proteínas totales. Los liposomas cargados con RUNX2 inmovilizados en la superficie de los NFM de PCL electrohilados inducen una expresión génica a largo plazo de eGFP y RUNX2 mediante hBMSC cultivadas. Además, la diferenciación osteogénica de hBMSC también se logró mediante la sobreexpresión de otros marcadores osteogénicos en un medio libre de suplementación osteogénica.